Bildgebung der mitochondrialen Ca²⁺ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca²⁺ Indikatoren (GECIs)

Mitochondrien sind dynamische subzelluläre Organellen und gelten als Zellkraftwerke für die Energieproduktion. Auf der anderen Seite können Mitochondrien^Ca2+ in die Matrix aufnehmen, als Reaktion auf lokale oder zytosolische^Ca2+ Anstiege. Die mitochondriale^{Ca2+-Aufnahme} beeinflusst die mitochondriale Funktion, einschließlich Stoffwechselprozesse wie Reaktionen im Tricarbonsäurezyklus (TCA) und oxidative Phosphorylierung, und reguliert^{Ca2+-empfindliche}Proteine unter physiologischen^{Bedingungen 1,2,3,4}. Mitochondriale Ca^{2+ Überlastung} ist auch eine Determinante für den Zelltod, einschließlich Nekrose und Apoptose bei verschiedenen Hirnerkrankungen^5,6,7. Es verursacht die Öffnung von mitochondrialen Permeabilitätsübergangsporen (mPTPs) und die Freisetzung von Caspase-Cofaktor, die den apoptotischen Zelltod einleiten. Daher ist es wichtig, die mitochondriale^Ca2+-Dynamik und -Handhabung in lebenden Zellen zu untersuchen, um die zelluläre Physiologie und Pathologie besser zu verstehen.

Mitochondrien erhalten die Matrix^Ca2+ Homöostase durch ein Gleichgewicht zwischen Ca²⁺ Aufnahme und Efflux. Die mitochondriale^{Ca2+-Aufnahme} wird hauptsächlich durch mitochondriale^{Ca2+-Uniporter} (MCUs) vermittelt, während der mitochondriale^Ca2+-Efflux durch die Na+-Ca2+-Li+-Austauscher (NCLXs) und die^{H+/Ca2+-Austauscher}(mHCXs)⁸vermittelt wird. Das Gleichgewicht kann durch die Stimulation von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) gestört werden⁹. Mitochondriale^Ca2+ Homöostase wird auch durch mitochondriale Pufferung durch die Bildung von unlöslichen^xCa2+-xPO₄x-xOH-Komplexen^{beeinflusst 8}.

Intrazelluläre und mitochondriale Veränderungen der^{Ca2+-Konzentration ([Ca2+])}können durch fluoreszierende oder lumineszierende^{Ca2+-Indikatoren} bewertet werden. Die Bindung von Ca²⁺ an Indikatoren verursacht spektrale Modifikationen, die es ermöglichen, freie zelluläre [Ca²⁺] in Echtzeit in lebenden Zellen aufzuzeichnen. Derzeit stehen zwei Arten von Sonden zur Verfügung, um Ca^{2+-Veränderungen} in Zellen zu überwachen: organisch-chemische Indikatoren und genetisch kodierte^{Ca2+-Indikatoren} (GECIs). Im Allgemeinen stehen für die untersuchten biologischen Fragestellungen unterschiedliche Varianten mit unterschiedlichen^{Ca2+-Affinitäten} (basierend auf K_d),spektralen Eigenschaften (Anregungs- und Emissionswellenlängen), Dynamikbereichen und Sensitivitäten zur Verfügung. Obwohl viele synthetische organische Ca^{2+-Indikatoren} für die zytosolische^{Ca2+-Bildgebung} verwendet wurden, können nur wenige selektiv in die mitochondriale Matrix für die mitochondriale^{Ca2+-Bildgebung} geladen werden, wobei Rhod-2 am weitesten verbreitet ist (für Reviews siehe^10,11). Rhod-2 hat jedoch einen großen Nachteil der Leckage bei langen Zeitverlaufsexperimenten; Darüber hinaus ist es zwischen Mitochondrien, anderen Organellen und dem Zytosol aufgeteilt, was absolute Messungen in verschiedenen Unterkompartimenten erschwert. Im Gegensatz dazu können GECIs durch die Verwendung von zelltypspezifischen Promotoren und subzellulären Kompartiment-Targeting-Sequenzen in verschiedenen Zelltypen und subzellulären Kompartimenten für die zell- und kompartimentspezifische^{Ca2+-Bildgebung} in vitro oder in vivoexprimiert werden. Einwellenlängen-Fluoreszenzintensitäts-basierte GCaMP Ca²⁺ Indikatoren haben sich kürzlich als Haupt-GECIs^{12,13,14,15,16}herausgestellt. In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll für das Mitochondria-Targeting und die zelltypspezifische Expression von GCaMP5G und GCaMP6s (GCaMP5G/6s) in Astrozyten und Neuronen sowie die Abbildung der mitochondrialen Ca^2+-Aufnahme in diesen Zelltypen zur Verfügung. Mit diesem Protokoll kann die Expression von GCaMP6G/6s in einzelnen Mitochondrien aufgedeckt werden, und ca²⁺ Aufnahme in einzelner mitochondrialer Auflösung kann in Astrozyten und Neuronen in vitro und in vivoerreicht werden.