Özet

Imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca2+ dans les astrocytes et les neurones à l’aide d’indicateurs ca2+ codés génétiquement (GECI)

Published: January 22, 2022
doi:

Özet

Ce protocole vise à fournir une méthode d’imagerie mitochondriale in vitro et in vivo du Ca2+ dans les astrocytes et les neurones.

Abstract

Le Ca2+ mitochondrial joue un rôle essentiel dans le contrôle de la mise en mémoire tampon cytosolique du Ca2+, du métabolisme énergétique et de la transduction du signal cellulaire. La surcharge de Ca2+ mitochondrial contribue à diverses conditions pathologiques, y compris la neurodégénérescence et la mort cellulaire apoptotique dans les maladies neurologiques. Nous présentons ici une approche moléculaire spécifique au type cellulaire et ciblant les mitochondries pour l’imagerie mitochondriale Ca2+ dans les astrocytes et les neurones in vitro et in vivo. Nous avons construit des plasmides d’ADN codant pour des indicateurs Ca2+ (GECI) génétiquement codés ciblant les mitochondries GCaMP5G ou GCaMP6s (GCaMP5G/6s) avec des promoteurs spécifiques aux astrocytes et aux neurones gfaABC1D et CaMKII et une séquence de ciblage des mitochondries (mito-). Pour l’imagerie mitochondriale in vitro Ca2+, les plasmides ont été transfectés dans des astrocytes et des neurones en culture pour exprimer GCaMP5G/6s. Pour l’imagerie mitochondriale in vivo Ca2+, des vecteurs viraux adéno-associés (AAV) ont été préparés et injectés dans le cerveau des souris pour exprimer GCaMP5G/6s dans les mitochondries dans les astrocytes et les neurones. Notre approche fournit un moyen utile d’imager la dynamique mitochondriale du Ca2+ dans les astrocytes et les neurones afin d’étudier la relation entre la signalisation cytosolique et mitochondriale du Ca2+, ainsi que les interactions astrocyte-neurone.

Introduction

Les mitochondries sont des organites subcellulaires dynamiques et sont considérées comme les centrales cellulaires pour la production d’énergie. D’autre part, les mitochondries peuvent absorber le Ca2+ dans la matrice en réponse à des augmentations locales ou cytosoliques de Ca2+. L’absorption mitochondriale de Ca2+ affecte la fonction mitochondriale, y compris les processus métaboliques tels que les réactions dans le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et la phosphorylation oxydative, et régule les protéines sensibles au Ca2+dans des conditions physiologiques1,2,3,4. La surcharge mitochondriale de Ca2+ est également un déterminant de la mort cellulaire, y compris la nécrose et l’apoptose dans divers troubles cérébraux5,6,7. Il provoque l’ouverture des pores de transition de perméabilité mitochondriale (PTMP) et la libération de cofacteur caspase, qui déclenchent la mort cellulaire apoptotique. Par conséquent, il est important d’étudier la dynamique et la manipulation du Ca2+ mitochondrial dans les cellules vivantes pour mieux comprendre la physiologie et la pathologie cellulaires.

Les mitochondries maintiennent l’homéostasie de la matrice Ca2+ grâce à un équilibre entre l’absorption et l’efflux de Ca2+. L’absorption mitochondriale de Ca2+ est principalement médiée par les uniporteurs mitochondriaux de Ca2+ (MCU), tandis que l’efflux mitochondrial de Ca2+ est médié par les échangeurs Na+-Ca2+-Li+ (NCLX) et les échangeurs H+/ Ca2 + (mHCX)8. L’équilibre peut être perturbé par la stimulation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)9. L’homéostasie mitochondriale Ca2+ est également affectée par la mise en mémoire tampon mitochondriale par la formation de complexes xCa2+-xPO4x-xOH insolubles8.

Les changements intracellulaires et mitochondriaux de la concentration de Ca2+ ([Ca2+]) peuvent être évalués par des indicateurs de Ca2+ fluorescents ou luminescents. La liaison du Ca2+ aux indicateurs provoque des modifications spectrales, permettant l’enregistrement de cellules libres [Ca2+]en temps réel dans des cellules vivantes. Deux types de sondes sont actuellement disponibles pour surveiller les changements de Ca2+ dans les cellules : les indicateurs chimiques organiques et les indicateurs ca2+ (GECI) codés génétiquement. Généralement, différentes variantes avec différentes affinités Ca2+ (basées sur Kd),des propriétés spectrales (longueurs d’onde d’excitation et d’émission), des plages dynamiques et des sensibilités différentes sont disponibles pour les questions biologiques étudiées. Bien que de nombreux indicateurs de Ca2+ organiques synthétiques aient été utilisés pour l’imagerie cytosolique du Ca2+, seuls quelques-uns peuvent être chargés sélectivement dans la matrice mitochondriale pour l’imagerie mitochondriale ca2+, Rhod-2 étant le plus largement utilisé (pour les revues, voir10,11). Cependant, Rhod-2 présente un inconvénient majeur de fuite lors d’expériences à long terme; en outre, il est divisé entre les mitochondries, d’autres organites et le cytosol, ce qui rend difficiles les mesures absolues dans différents sous-compartiments. En revanche, en utilisant des promoteurs spécifiques au type cellulaire et des séquences de ciblage des compartiments subcellulaires, les GECI peuvent être exprimés dans différents types de cellules et compartiments subcellulaires pour l’imagerie Ca2+ spécifique aux cellules et aux compartiments in vitro ou in vivo. Les indicateurs GCaMP Ca2+ basés sur l’intensité de fluorescence à longueur d’onde unique sont récemment apparus comme des GECI majeurs12,13, 14,15,16. Dans cet article, nous fournissons un protocole pour le ciblage des mitochondries et l’expression spécifique du type cellulaire de GCaMP5G et GCaMP6s (GCaMP5G/6s) dans les astrocytes et les neurones, et l’imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca2+ dans ces types de cellules. En utilisant ce protocole, l’expression de GCaMP6G/6s dans les mitochondries individuelles peut être révélée, et l’absorption de Ca2+ en résolution mitochondriale unique peut être obtenue dans les astrocytes et les neurones in vitro et in vivo.

Protocol

Les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université du Missouri-Columbia. 1. Construction de plasmides d’ADN REMARQUE: Pour l’imagerie in vitro et in vivo, des plasmides d’ADN codant GCaMP5G / 6s avec des promoteurs spécifiques aux astrocytes et aux neurones et des séquences de ciblage mitochondrial sont construits. Insérer la…

Representative Results

L’objectif de cette étude était de fournir une méthodologie pour imager les signaux mitochondriaux Ca2+ en utilisant des GECI dans les astrocytes et les neurones in vitro et in vivo. Les résultats de l’imagerie mitochondriale in vitro et in vivo du Ca2+ sont présentés ici. Signalisation mitochondrialein vitro du Ca2+ dans les astrocytes et les neu…

Discussion

Dans cet article, nous fournissons une méthode et un protocole pour l’imagerie des signaux mitochondriaux Ca2+ dans les astrocytes et les neurones. Nous avons mis en œuvre des stratégies de ciblage des mitochondries et de type cellulaire spécifiques pour exprimer GECI GCaMP5G/6s. Pour cibler GCaMP5G/6s dans les mitochondries, nous avons inclus une séquence de ciblage des mitochondries dans les plasmides. Pour exprimer GCaMP5G/6s dans les astrocytes et les neurones in vivo,nous avons inséré un…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) subventions R01NS069726 et R01NS094539 à SD. Nous remercions Erica DeMers pour l’enregistrement audio.

Materials

Artificial tears ointment Rugby NDC-0536-6550-91 83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue World Precision Instruments 3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope Nikon SMZ 2B Surgery
Dumont forceps with fine tip Fine Science Tools 11255-20 for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick Fisher Scientific 12-542A for cranial window cover
High speed micro drill Fine Science Tools 18000-17 with bone polishing drill bit
Injection syringe Hamilton 2.5 ml for viral injection
Ketamine VEDCO NDC-50989-996-06 100 mg/kg body weight
Low melting point agarose Sigma-Aldrich A9793 reducing movement artifacts
Metal frame Custom-made see Fig 1 for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller World Precision Instruments UMP3 Injection speed controller
Mouse stereotaxic device Stoelting 51725 for holding mice
Perfusion chamber Warner Instruments 64-0284
Persfusion system ALA Scientific Instruments ALA-VM8
Self-regulating heating pad Fine Science Tools 21061 to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101 Invitrogen S-359 red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm Fine Science Tools 14002-12 for dissection
Trephine Fine Science Tools 18004-23 for clearing of material
Xylazine VEDCO NDC-50989-234-11 10 mg/kg body weight

Referanslar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
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