在这里,我们提出了一种方案,以获得健康和病理性的大型哺乳动物全心的高分辨率微计算机断层扫描图像,并具有胶原选择性对比度增强。
结构重塑是施加在心脏上的慢性病理压力的常见后果。了解患病组织的结构和组成特性对于确定它们与心律失常行为的相互作用至关重要。低于临床分辨率的微尺度组织重塑正在成为致死性心律失常的重要来源,在年轻人中患病率很高。在足够微尺度分辨率下为临床前模型(例如大型哺乳动物全心)获得高成像对比度仍然存在挑战。此外,仍然缺乏用于三维高分辨率成像的组织组成选择性对比度增强。使用显微计算机断层扫描的非破坏性成像显示出高分辨率成像的前景。目的是减轻大型生物样品中X射线对衰减的影响。从健康猪(N = 2)和绵羊(N = 2)中提取心脏,这些猪诱导慢性心肌梗塞和纤维化瘢痕形成或诱导慢性心房颤动。切除的心脏灌注:补充钙离子猝灭剂和血管扩张剂的盐水溶液,连续脱水的乙醇和真空下的六甲基二硅烷。后者在风干1周期间加强了心脏结构。胶原显性组织被X射线造影剂磷酸钼酸选择性地结合。组织构象在空气中稳定,允许长时间的微算断层扫描采集以获得高分辨率(各向同性20.7μm)图像。 通过弥散获得最佳造影剂上样量显示健康猪心室中上皮层和心内膜下浦肯野纤维的选择性造影剂增强。心房颤动(AF)心脏在心房的后壁和附属物中显示出增强的造影剂积聚,归因于更高的胶原蛋白含量。心肌梗死心脏在心脏纤维化区域选择性地显示对比度增加,这使得能够识别交织的幸存心肌纤维。造影剂增强的风干组织制剂能够对完整的大型哺乳动物心脏进行微尺度成像,并对潜在疾病成分进行选择性造影增强。
结构性心脏病占全世界心脏相关死亡率的大多数1.心脏结构的重塑会影响心肌环境和间质空间。由于心脏电和机械功能都依赖于肌细胞组织,因此破坏可导致无法忍受的心律失常,血液泵送作用受损和心力衰竭2,3,4,5,6,7,8,9。结构性心脏病治愈疗法的发展远远超过疾病流行率2,5。因此,越来越多的结构性心脏病临床前模型正在出现,以更好地了解心律失常的解剖学形态特征和由此产生的发病机制10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.在整个结构疾病谱中观察到的是间质纤维化的上调,并且在缺血相关病例中更常见的是纤维化和脂肪组织的心肌替代18。对病理细胞外成分的形态学理解可以识别心律失常的潜在底物。该病的分布和程度为致心律失常风险提供了强有力的指标。然而,通过在完整心脏中整合宏观和微观尺度来全面成像疾病概况仍然存在挑战。
基于X射线的显微计算机断层扫描(microCT)正在成为使用造影剂询问软生物组织微观结构的强大工具。已经获得了来自小型啮齿动物心脏的高度详细的解剖图24,25,26 和来自大型哺乳动物心脏的小型解剖样本27,28。然而,大型哺乳动物心脏的整个器官水平的成像呈现过长的路径长度,使用常规组织制备技术可以衰减X射线光子。这涉及在采集期间对组织进行造影剂加载并将样品浸入造影剂溶剂中。增加样本数量和分辨率会延长总采集时间。因此,组织稳定性对于可用的图像重建至关重要,这意味着必须防止干燥引起的组织变形。然而,使用浸没液有缺点:(i)整体背景信号强度变得不可忽视,并且(ii)促进组织结合的对比分子的稀释。这两个因素都有助于降低图像对比度。
这项研究详细介绍了一种新的组织处理管道,以减轻背景光子衰减并优化对比度增强剂提供的动态范围。建议使用组织风干方法与化学组织加固以限制组织变形29。因此,组织样品可以在空气中保持稳定,以便长时间采集,并省略浸没液的背景贡献。该方法管道提供:(i)使用整猪心脏优化的综合组织处理和成像方案;(ii)对造影剂浓度和负荷技术的评估,以及(iii)该管道在羊心房颤动和心肌梗死的两种不同慢性疾病模型中的应用。开发慢性病模型的病症模型已在别处描述过每种慢性心脏病模型、经皮冠状动脉栓塞13 诱导的心肌梗死和自我维持性心房颤动30。
使用来自大型哺乳动物的全心脏进行大组织制备的详细方案,以进行随后的高分辨率结构成像。风干方法消除了背景X射线衰减的影响,并最大限度地优化了组织:背景对比度29。使用这种方法,在直径达7.2 cm的样品上实现了20μm范围内的各向同性分辨率,用于体积成像。然而,软组织的MicroCT通常依赖于使用非特异性造影剂来改善microCT系统的X射线吸收和灵敏度34。尽管X射线造影剂可改善整体X射线衰减和软组织成像增强,但基于生化成分的组织成分分离仍然具有挑战性。然而,观察到在实验室环境中使用风干心脏与常见的X射线造影剂PMA组合,选择性染色细胞外成分。与慢性病中健康心肌和病理结构重塑相关的结缔组织得到增强。
空气干燥生物组织的过程需要干预来抵抗样品的变形。用于电子显微镜的样品制备也有类似的要求。通常,采用临界点干燥方法,其使用组织浸泡介质,温度和压力的平衡来消除组织液体含量的表面张力,其在蒸发时在分子水平上引起变形35。这种方法需要用液态二氧化碳均匀地替换样品的含水量,这在小而容易扩散的样品中更可靠。或者,可以改善组织的结构完整性并进行空气干燥,即,蒸发相可以在更长的时间内施加以减少整体变形。分子HMDS经历硅烷化以形成硅氧烷基支架,以增强和稳定组织样品36的分子组织。通过限制来自环境的循环气流,进一步延长蒸发时间,同时避免不均匀蒸发,特别是在样品表面和壁内层之间。
许多造影剂以前已被用于软组织的microCT成像。最常见的是碘,磷钨酸(PTA)和PMA。碘特别被使用, 因为更高的扩散速率34,37,38.然而,碘充当HMDS试剂36的硅烷化的催化剂。催化反应具有侵蚀性和放热性,如果由于样品不完全干燥而残留HMDS仍然存在,则具有很高的试样破坏风险和安全风险。溶解在乙醇中的PTA和PMA都可以安全地与HMDS结合使用。PTA和PMA已被证明与碘染色相比,在非矿化椎间盘中提供更大的分辨能力38。在哺乳动物样品的microCT成像中,PTA和PMA已用于染色小鼠胚胎39,小鼠心血管系统37,兔肌肉和大脑40以及猪静脉41。PTA在溶液中具有比PMA更高的分子质量和密度。这部分是由于钨的原子质量较高(原子序数为74 g / mol),这是PTA中的主要衰减元素。相比之下,PMA中最重的元素钼的原子序数为42 g / mol。原子质量和样品密度都是X射线衰减的基础,此外还有样品厚度42。通过增加样本量来增加X射线路径长度,X射线衰减对增加的样品密度变得更加敏感。因此,选择较低密度的PMA造影剂,以降低过度衰减的风险,并优化人形尺度心脏的图像对比度的动态范围。进一步的证据表明,PMA的扩散负荷比心脏组织中较大的分子PTA提供更均匀的染色43。
造影剂递送的方法会影响心脏组织中造影剂分布的均匀性(图3)。由于血管阻力可变,乙醇脱水心脏中造影剂的灌注显示 PMA 的背景染色水平斑片状。在风干的心脏中,通过样品干燥过程强调肌肉层流结构,增加肌肉层流分离。这最终改善了基于扩散的造影剂上样的组织的整体通透性。因此,空气干燥促进了组织:层流和层内水平的空气对比(图4)。此外,通过在真空下施用可以进一步促进扩散加载。已经进一步表明,非干燥样品的组织收缩率取决于造影剂浓度40。然而,通过空气干燥对标本进行先前的形态学稳定抑制了组织收缩效应29。
整个器官的高分辨率microCT图像本身会产生大量数据。层析成像技术的本质是可以逐片进行可视化和图像处理,从而减轻了计算机处理和内存负担。但是,为了可视化三维图像堆栈,例如,以三维表示形式呈现标本体积,建议的最低计算机规格为128 GB RAM和3 GHz的处理器速度。
心脏领域microCT成像的出现为转化研究和临床验证提供了许多优势。其三维和显微成像的优势已经显示出在确定ST段抬高型心肌缺血患者的血栓负荷中的应用44,45。绘制结构性心脏病患者心律失常的潜在来源在很大程度上取决于确定纤维化瘢痕组织的分布和定位幸存心肌的交织轨迹。诊断室性心律失常的二线方法利用磁共振成像46.它可以稳健地定位致密纤维化,但仅限于低分辨率形态学表征,并且对纤维化病变的微观结构重塑和弥漫性分布提供有限的见解47。瘢痕分布和表征的高分辨率检查对于提高我们对心脏结构重塑和发生心力衰竭风险的理解具有巨大的潜力。特别是,基础研究或验尸研究将受益于用于心律失常电图谱的确凿结构图像。
总之,通过HMDS治疗和风干强化的心脏随后可以用X射线造影剂染色,以增强细胞外成分的X射线衰减。具体而言,在健康的心肌中,PMA积累发生在上皮,瓣膜组织和由结缔组织鞘的心室传导系统的室室,导致X射线衰减增强。此外,在结构病变的心肌中,增强的造影剂对纤维化具有进一步的选择性。
The authors have nothing to disclose.
作为国家研究机构(ANR)管理的“未来投资”计划的一部分,该研究得到了法国政府的财政支持,赠款参考号ANR-10-IAHU-04和Leducq基金会(RHYTHM网络),以及赠款参考号ANR-17-CE14-0029-01 [UNMASC],来自欧洲心血管疾病研究区(ERA-CVD)的资金,赠款参考号H2020-HCO-2015_680969[MultiFib]和法国新阿基坦地区的资金, 授权参考号 2016 – 1R 30113 0000 7550/2016-1R 30113 0000 7553 和 ANR-19-ECVD-0006-01。
10% neutral buffered formalin | Diapath | F0043 | |
Calcium chloride solution | Honeywell | 21114 | |
Canulation Tubing PTFE | VWR | DENE3400102 | |
Constant Head 1L Reservoir | Harvard Apparatus | 50-0496 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 796881 | |
Heparin sodium (5000 U/mL) | Panpharma | 3400891287301. | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma | 440191-1L | |
Hydrochloric acid, ACS reagent, 37% | Sigma | 258148 | |
Magnesium chloride solution | Honeywell | 63020 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368 | |
Phosphomolybdic acid hydrate | Fisher Scientific | 417895000 | |
Potassium Chloride | Sigma | P5405 | |
Pump Tubing, 3-Stop | Ismatec | FV-96328-48 | |
SkyScan, 1276 | Bruker | micro CT | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
Sodium hydroxide solution 50% in H2O | Sigma | 415413 | |
Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 72-1407 | |
Tubing pump | Ismatec | ISM 1089 | |
Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm | VWR | 228-1279 | |
Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm | VWR | 228-1283 | |
Two-part single-use syringes 50 mL | Norm-Ject | 4850001000 | Pyrogen-free, PVC-free |