여기에서, 우리는 콜라겐 선택적 조영 증진과 함께 건강하고 병리학적인 큰 포유동물 전심의 고해상도 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 이미지를 얻기 위한 프로토콜을 제시한다.
구조 리모델링은 심장에 부과 된 만성 병리학 적 스트레스의 일반적인 결과입니다. 병든 조직의 건축 및 구성 특성을 이해하는 것은 부정맥 행동과의 상호 작용을 결정하는 데 중요합니다. 임상 해상도보다 낮은 마이크로 스케일 조직 리모델링은 젊은 성인에서 높은 유병률과 함께 치명적인 부정맥의 중요한 원천으로 부상하고 있습니다. 대형 포유류 전심과 같은 전임상 모델에 대해 충분한 마이크로 스케일 해상도로 높은 이미징 콘트라스트를 얻는 데 과제가 남아 있습니다. 더욱이, 조직 조성-입체 고해상도 이미징을 위한 선택적 콘트라스트 향상은 여전히 부족하다. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용한 비파괴 이미징은 고해상도 이미징에 대한 약속을 보여줍니다. 목표는 대규모 생물학적 샘플에서 감쇠에 대한 X 선으로 인한 고통을 완화하는 것이 었습니다. 심장은 건강한 돼지(N=2)와 양(N=2)으로부터 추출되었으며, 만성 심근경색 및 섬유성 흉터 형성을 유도하거나 만성 심방세동을 유발하였다. 적출된 심장은 칼슘 이온 담금질제 및 혈관확장제로 보충된 식염수 용액, 연속 탈수의 에탄올, 진공 하에 헥사메틸디실리잔으로 관류되었다. 후자는 1 주 동안 공기 건조 중에 심장 구조를 강화했습니다. 콜라겐-우성 조직은 X선 조영증강제인 포스포몰리브덴산에 의해 선택적으로 결합되었다. 조직 입체 형태는 공기 중에서 안정하였고, 고해상도(등방성 20.7 μm) 이미지를 얻기 위해 장기간 마이크로컴퓨터 단층 촬영 획득을 허용하였다. 확산에 의한 최적의 조영제 로딩은 건강한 돼지 심실에서 상피층 및 심내막 이하 Purkinje 섬유의 선택적 조영제 증진을 나타냈다. 심방 세동 (AF) 심장은 더 큰 콜라겐 함량에 기인하여 심방의 후벽과 부속기에서 향상된 대조 축적을 보였다. 심근 경색 심장은 심장 섬유증의 영역에서 선택적으로 증가 된 대조를 보여 주었고, 이는 생존 한 심근 근육 섬유의 엮임새를 식별 할 수있게했습니다. 콘트라스트-강화된 공기-건조된 조직 제제는 무손상 대형 포유동물 심장의 마이크로스케일 이미징 및 기저 질환 구성성분의 선택적 콘트라스트 증진을 가능하게 하였다.
구조적 심장 질환은 전 세계적으로 심장 관련 사망률의 대부분을 차지합니다1. 심장 구조의 리모델링은 심근 환경과 간질 공간에 영향을 미칩니다. 심장 전기 및 기계적 기능 모두 근세포 조직에 달려 있기 때문에 혼란은 참을 수없는 심장 부정맥, 손상된 혈액 펌핑 작용 및 심부전 2,3,4,5,6,7,8,9로 이어질 수 있습니다. 구조적 심장 질환에 대한 치료 요법의 개발은 질병 유병률 2,5보다 훨씬 큽니다. 이와 같이, 심장 부정맥의 해부학 형태학적 프로파일과 그로 인한 발병기전을 더 잘 이해하기 위해 구조적 심장 질환의 전임상 모델의 증가가 증가하고 있다 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23. 구조적 질환 스펙트럼을 가로질러 관찰되는 것은 간질성 섬유증의 상향조절이고, 허혈 관련 경우에서, 섬유증 및 지방 조직에 의한 심근 치환(18)에서 더욱 흔하게 관찰된다. 병리학적 세포외 성분의 형태학적 이해는 부정맥의 잠재적 기질의 식별을 가능하게 할 수 있다. 질병의 분포와 정도는 부정맥 유발 위험에 대한 강력한 지표를 제공합니다. 그러나 손상되지 않은 심장에 매크로 및 마이크로 스케일을 통합하여 질병 프로파일을 종합적으로 이미지화하는 데는 여전히 과제가 남아 있습니다.
X선을 기반으로 한 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (microCT)은 조영제를 사용하여 연질 생물 조직 미세 구조를 조사하는 강력한 도구로 부상하고 있습니다. 작은 설치류 24,25,26 및 큰 포유류 심장으로부터의 작은 해부 샘플(27,28)로부터의 심장에 대해 매우 상세한 해부학적 지도가 얻어졌다. 그러나, 큰 포유동물 심장의 전체 기관 수준에서의 이미징은 기존의 조직 준비 기술을 사용하여 X선 광자가 감쇠되는 과도한 경로 길이를 제시한다. 이것은 조직을 대조 로딩하고 획득 동안 조영제 용매에 샘플을 침지시키는 것을 포함한다. 표본 크기 및 분해능을 늘리면 총 수집 시간이 연장됩니다. 따라서 조직 안정성은 사용 가능한 이미지 재구성에 매우 중요하며, 이는 건조로 인한 조직 변형을 방지해야 함을 의미합니다. 그러나 침지 유체의 사용은 단점을 갖는다: (i) 전체 배경 신호 강도는 무시할 수 없게 되고, (ii) 조직-결합된 대조 분자의 희석을 촉진한다. 이 두 가지 요인 모두 이미지 대비를 낮추는 데 기여합니다.
이 연구는 배경 광자 감쇠를 완화하고 대조 강화제에 의해 제공되는 동적 범위를 최적화하는 새로운 조직 처리 파이프 라인을 자세히 설명합니다. 조직 변형(29)을 제한하기 위해 화학적 조직 강화와 함께 조직 공기 건조 접근법을 사용하는 것이 제안된다. 따라서 조직 샘플은 긴 획득을 위해 공기 중에서 안정적으로 유지되고 침지 유체에서 배경 기여를 생략 할 수 있습니다. 이 방법론 파이프 라인은 다음을 제공합니다 : (i) 전체 돼지 심장을 사용하여 최적화 된 포괄적 인 조직 처리 및 이미징 프로토콜; (ii) 대조 농도 및 로딩 기술의 평가 및, (iii) 양 심장에서의 심방 세동 및 심근 경색의 두 가지 별개의 만성 질환 모델에서이 파이프 라인의 적용. 만성 질환 모델의 개발은 각각의 만성 심장 질환 모델, 경피 관상동맥 색전술(13 ) 및 자가지지 심방세동(30)에 의해 유도되는 심근경색에 대해 다른 곳에서 설명되었다.
대형 조직 제제에 대한 상세한 프로토콜은 후속 고해상도 구조 이미징을 위해 대형 포유류의 전심을 사용하여 제시됩니다. 공기 건조 접근법은 배경 X선 감쇠의 영향을 제거하고 조직을 최대한 최적화합니다 : 배경 대비29. 이 접근법을 사용하여, 직경 7.2 cm까지의 샘플에 걸친 체적 이미징을 위해 20 μm 범위의 등방성 분해능이 달성되었다. 그러나 연조직의 MicroCT는 일반적으로 microCT 시스템(34)의 X선 흡수 및 감도를 개선하기 위해 비특이적 조영제의 사용에 의존한다. X선 조영제가 전반적인 X선 감쇠 및 연조직 이미징 향상을 향상시키지만, 생화학적 조성에 기초한 조직 구성성분의 분리는 여전히 어려운 과제입니다. 그러나, 공기 건조된 심장을 실험실 환경에서 일반적인 X선 조영제인 PMA와 조합하여 사용하여, 세포외 성분을 선택적으로 염색하는 것이 관찰되었다. 건강한 심근과 관련된 결합 조직 및 만성 질환에서의 병리학적 구조 리모델링이 강화되었다.
생물학적 조직을 공기 건조시키는 과정은 샘플의 변형에 저항하기위한 개입을 필요로합니다. 전자 현미경을 위한 샘플 준비는 비슷한 요구 사항을 가지고 있습니다. 전형적으로, 조직 침지 매질, 온도 및 압력의 균형을 사용하여 조직의 액체 함량의 표면 장력을 제거하는 임계점 건조 방법이 사용되며, 이는 증발 시 분자 수준에서 변형을 일으킨다(35). 이 접근법은 샘플의 수분 함량을 액체 이산화탄소로 균일하게 대체해야하며, 이는 작고 쉽게 확산 가능한 샘플에서보다 신뢰할 수 있습니다. 대안적으로, 조직의 구조적 완전성이 개선될 수 있고 공기-건조, 즉, 증발 단계가 전체 변형을 감소시키기 위해 더 긴 기간에 걸쳐 적용될 수 있다. 분자 HMDS는 실릴화를 겪어 실리콘 기반 스캐폴드를 형성하여 조직 샘플(36)의 분자 조직을 강화하고 안정화시킨다. 증발은 환경으로부터의 순환 기류를 제한함으로써 더욱 연장되며, 또한 특히 샘플 표면과 교내 층 사이의 불균질 증발을 피한다.
이전에 수많은 조영제가 연조직의 microCT 영상화에 사용되어 왔습니다. 가장 흔한 것은 요오드, 포스포텅스텐산 (PTA) 및 PMA입니다. 요오드는 특히 더 높은 확산률34,37,38로 인해 사용되었다. 그럼에도 불구하고, 요오드는 HMDS 시약(36)의 실릴화를 위한 촉매로서 작용한다. 촉매 반응은 공격적이고 발열적이며, 시료의 불완전한 건조로 인해 잔류 HMDS가 남아있을 경우 시편의 파괴 위험이 높고 안전 위험이 있습니다. 에탄올에 용해된 PTA 및 PMA 모두 HMDS와 함께 안전하게 사용될 수 있다. PTA 및 PMA는 요오드 염색38과 비교했을 때 미네랄화되지 않은 추간판에서 미세 구조의 더 큰 분해능을 제공하는 것으로 나타났다. 포유동물 샘플의 microCT 영상화에서, PTA 및 PMA는 마우스 배아(39), 마우스 심혈관계(37), 토끼 근육 및 뇌(40), 및 돼지 정맥(41)을 염색하는데 사용되어 왔다. PTA는 PMA보다 용액에서 더 높은 분자 질량 및 밀도를 갖는다. 이것은 부분적으로 PTA의 주요 감쇠 원소 인 텅스텐 (원자 번호는 74g / mol)의 원자 질량이 높기 때문입니다. 비교해 보면, PMA에서 가장 무거운 원소 인 몰리브덴은 원자 번호가 42g / mol입니다. 원자 질량 및 샘플 밀도 둘 다 샘플 두께(42)에 더하여 X선 감쇠의 기초가 된다. 샘플 크기를 늘려 X선 경로 길이를 늘리면 X선 감쇠가 샘플 밀도 증가에 더 민감해집니다. 따라서, 저밀도 PMA 조영제는 과다 감쇠의 위험을 감소시키고 인간과 같은 스케일의 심장에 대한 이미지 콘트라스트의 동적 범위를 최적화하기 위해 선택되었다. 추가의 증거는 PMA의 확산-로딩이 심장 조직(43)에서 더 큰 분자 PTA에 대한 것보다 더 균질한 염색을 제공한다는 것을 보여주었다.
조영제 전달 방법은 심장 조직에서 조영제 분포의 균일성에 영향을 미칩니다 (그림 3). 에탄올 탈수 심장에서 조영제의 관류는 가변 혈관 저항성으로 인한 PMA의 패치 배경 염색 수준을 보였다. 공기 건조 된 심장에서 근육 층상 구조는 샘플 건조 과정에 의해 강조되어 근육 층류 분리를 증가시킵니다. 이것은 궁극적으로 확산계 조영제 로딩을 위한 조직의 전체 투과성을 개선시켰다. 결과적으로, 공기 건조는 조직을 촉진시켰다: 층상 및 층내 수준에서의 공기 대비(그림 4). 더욱이, 확산-로딩은 진공 하에서의 적용에 의해 더욱 촉진될 수 있다. 건조되지 않은 샘플의 조직 수축은 조영제 농도(40)에 의존한다는 것이 추가로 밝혀졌다. 그러나, 공기 건조에 의한 시편의 종래 형태학적 안정화는 조직 수축 효과(29)를 억제한다.
전체 장기의 고해상도 microCT 이미지는 본질적으로 대용량 데이터를 생성합니다. 단층 촬영 이미징 기술의 특성상 시각화 및 이미지 처리를 슬라이스별로 수행할 수 있으므로 컴퓨터 처리 및 메모리 부담을 줄일 수 있습니다. 그러나 예를 들어 시편 볼륨을 3차원 표현으로 렌더링하는 등 3차원 이미지 스택을 시각화하기 위해 권장되는 최소 컴퓨터 사양은 128GB RAM과 3GHz의 프로세서 속도입니다. 솔리드 스테이트 하드 드라이브도 데이터 전송을 크게 개선했습니다.
심장 분야에서 microCT 이미징의 출현은 번역 연구 및 임상 검증에 많은 이점을 제공합니다. 그것의 입체 및 마이크로메트릭 영상화의 이점은 이미 ST-상승 심근 허혈 환자(44,45)의 혈전성 부담을 결정하는 데 응용을 보여주었다. 구조적 심장 질환 환자에서 부정맥의 잠재적 인 원인을 매핑하는 것은 섬유성 흉터 조직의 분포를 결정하고 생존 한 심근의 엮인 트랙을 국소화하는 데 크게 의존합니다. 심실 부정맥의 진단을 위한 두 번째 라인 접근법은 자기 공명 영상(46)을 이용한다. 그것은 조밀 한 섬유증을 견고하게 국소화 할 수 있지만 저해상도 형태 학적 특성화로 제한되며 섬유성 병변의 미세 구조 리모델링 및 확산 분포에 대한 제한된 통찰력을 제공합니다47. 흉터 분포 및 특성화에 대한 고해상도 검사는 심장 구조 리모델링에 대한 우리의 이해와 심부전 발병 위험을 향상시킬 수있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 특히, 근본적인 연구 연구 또는 사후 조사는 심장 부정맥의 전기 매핑을위한 확증적인 구조 이미지의 이점을 누릴 수 있습니다.
결론적으로, HMDS 처리 및 공기 건조로 강화된 심장은 후속적으로 X선 조영제로 염색되어 세포외 성분의 X선 감쇠를 향상시킬 수 있다. 구체적으로, 건강한 심근에서, 결합 조직에 의해 피복된 심실 전도 시스템의 상피, 판막 조직 및 구획에서 PMA 축적이 발생하여 향상된 X선 감쇠를 초래하였다. 더욱이, 구조적으로 병든 심근에서, 강화된 콘트라스트는 섬유증에 대해 더욱 선택적이었다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 ANR (National Research Agency), Grant reference ANR-10-IAHU-04 및 Leducq Foundation (RHYTHM network)이 관리하는 “미래의 투자”프로그램의 일환으로 프랑스 정부로부터 재정 지원을 받았으며 보조금 참조 ANR-17-CE14-0029-01 [UNMASC], 심혈관 질환 유럽 연구 지역 (ERA-CVD), 보조금 참조 H2020-HCO-2015_680969 [MultiFib] 및 프랑스 지역 누벨 아키텐의 자금 지원, 참조 2016 – 1R 30113 0000 7550/2016-1R 30113 0000 7553 및 ANR-19-ECVD-0006-01을 참조하십시오.
10% neutral buffered formalin | Diapath | F0043 | |
Calcium chloride solution | Honeywell | 21114 | |
Canulation Tubing PTFE | VWR | DENE3400102 | |
Constant Head 1L Reservoir | Harvard Apparatus | 50-0496 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 796881 | |
Heparin sodium (5000 U/mL) | Panpharma | 3400891287301. | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma | 440191-1L | |
Hydrochloric acid, ACS reagent, 37% | Sigma | 258148 | |
Magnesium chloride solution | Honeywell | 63020 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368 | |
Phosphomolybdic acid hydrate | Fisher Scientific | 417895000 | |
Potassium Chloride | Sigma | P5405 | |
Pump Tubing, 3-Stop | Ismatec | FV-96328-48 | |
SkyScan, 1276 | Bruker | micro CT | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
Sodium hydroxide solution 50% in H2O | Sigma | 415413 | |
Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 72-1407 | |
Tubing pump | Ismatec | ISM 1089 | |
Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm | VWR | 228-1279 | |
Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm | VWR | 228-1283 | |
Two-part single-use syringes 50 mL | Norm-Ject | 4850001000 | Pyrogen-free, PVC-free |