カエノハブディティス・エレガンスにおけるドーパミン作動性ニューロン形態変化と変性の定量化

パーキンソン病(PD)は、世界中で最大1000万人の個人に影響を与えるますます一般的な神経変性疾患^{です 1}.男性および高齢者はPDを発症するリスクが高い;この疾患の発症の平均年齢は60歳であり、PDの発生率は、一般集団の0.3%の発生率から^80歳1歳^、2歳以上の個体では3%に上昇する。PD病理の詳細は十分に理解されていないが、この進行性障害は、中脳の実質的なニグラ領域におけるドーパミン作動性ニューロンの喪失を伴う。この神経細胞喪失の仮説的メカニズムは、ミトコンドリア機能不全、酸化ストレス、および炎症²を伴う。病気の原因と危険因子はまだ検討されているが、環境と遺伝的要因の組み合わせを含む¹.例えば、研究は、生涯の農薬使用とPDとの間に肯定的な関連を発見しただけでなく、家族PD^1、3に対する遺伝的感受性も見^つかった。

C.エレガンスモデルシステムは、もともと神経生物学研究⁴の一部で開発され、生体内のドーパミン作動性ニューロン喪失を評価するために適している。Nassたちの研究グループは、ドーパミン作動性神経変性^症にC.エレガンスを使用し、その後、PDおよびドーパミン作動性機能不全^{6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17}の成功モデルとしてワーム^を採用しました。 ^、18,19,20.C.エレガンスは、生物学の他の分野でこのような人気のあるモデル生物であるのと同じ理由の多くのための良い神経変性疾患モデルです。その透明性は、細胞プロセスのin vivo研究を可能にし、ワームにおける遺伝子操作は比較的迅速かつ容易であり、彼らは約3日間の短い生成時間を有し、彼らは²¹を維持することが容易である。ほとんどの PD ワーム モデルは、年齢ベースのモデル、化学モデル、および遺伝的モデルの 3 つのカテゴリのいずれかに分類されます。ワームの集団を同期させる能力は^、PD22のような老化に関連する神経変性疾患の年齢ベースのモデルに対する加齢関連神経変性の研究を可能にする。PD様神経細胞の欠陥を誘発する化学的暴露は、6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)、ロテノーン、および1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)22を含む様々な化学物質を用いて確立されている。ワームはPDの遺伝的モデルとしてもうまく使用されています。選択された神経遺伝子ノックアウトを有する株は、様々な神経変性疾患^1、4をモデル化することができる。遺伝的要因と環境要因の組み合わせ、または「遺伝子環境相互作用」の組み合わせは、PD^{2、17、23、24、25、26、27、28}において大きな役割を果たす可能性が高く、C.エレガンスを用いたいくつかのグループによって検討されている。最後に、加齢に伴うドーパミン作動性神経変性も^29,30に観察されている。蛍光イメージングに適切な神経トランスジェニック株を使用する場合、これらのPDワームモデルのいずれかがドーパミン作動性神経変性を研究するために使用され得る。

神経形態の変化を定量化することは、神経変性研究の重要な要素です。C.エレガンスでは、多くの蛍光レポーター株が形態学的変化およびニューロンの喪失を視覚化するために使用されてきた。神経細胞イメージングに適した株は、細胞特異的プロモーターに関連する蛍光タンパク質を特徴とする。ドーパミン作動性神経変性アッセイの場合、我々の研究室では、ドーパミン作動性神経細胞で発現されるdat-1遺伝子に緑色蛍光タンパク質(GFP)タグを有するBY200[vtIs1(dat -1p::GFP、rol-6)株を使用しています。 BY200のローラー表現型は、浸透が非常に低く、ほとんど観察されない点に注意してください。このタイプのイメージングに使用される他の一般的な株には、BY250[dat- 1p::GFP]が含まれます。 BY273 [baEx18::GFP+dat-1p::WT α-syn], BZ555[dat-1p::GFP]、およびカエノールハブディティス遺伝学センター(CGC)から入手可能な他のいくつかの人^{1、21、22、29}.これらの株は、通常、ドーパミン作動性ニューロンの3つのクラスすべて(CEP)、前陰性(ADE)、およびポストデイリッド(PDE)ニューロンの視覚化を可能にする。C.エレガンスは、天然にαシヌクレインタンパク質を発現していないが、BY273などの株はそれを発現するように設計されている。しかし、我々は、我々が提示するスコアリングシステムは、アルファシヌクレインを発現しないBY200を使用して開発され、使用前にその株(または他の新しい株)で検証する必要があることに注意してください。追加のドーパミン作動性ニューロンは、男性に存在するが、男性は通常、C.エレガンスの人口の<1%を含むので、めったに考慮されません。ここでは、C.エレガンスの頭領域に見られる4つのCEPドーパミン作動性ニューロンに焦点を当てます。この一組のニューロンは、蛍光顕微鏡下で容易に位置し、雌雄同体と男性の両方のワームに存在し、通常、自己蛍光の他の領域と重複せず、一般的にワーム研究で報告されています。特に、これらのニューロンは髄膜化されていないが、CEP側の側線(CEPD)ニューロンは、CEP腹側ニューロンがそうではない偽性血体液に直接さらされる。正常なCEPデンドライトのセットは、通常、比較的直線的で途切れない線として表示されます。退化樹状突起は、樹状突起の線に沿ってブレブと呼ばれる顕著なドットや樹状突起のラインの破断を含む、不規則性と損傷の兆候の任意の組み合わせを示し得る。変性の様々なレベルでのCEPニューロンの例は図1に見ることができる。

ドーパミン作動性神経変性は、増加するC.エレガンス研究所によって研究されているが、ドーパミン作動性ニューロン損傷29、31、32、33、34を定量する分析方法に大きなばらつきがあった。多くの公表された研究は、変性対典型的または野生型ニューロン^31、32のバイナリスコアリングシステムを有するCEPソーマの存在または存在について報告している。これらのスコアリング方法は、神経変性を誘発するが、より微妙な神経損傷の進行の詳細を定量化することができない特定のストレッサーを識別したり、ユニークな化学物質または他の変数によって誘発される神経変性の違いを容易に検出することができる。さらに、細胞体に焦点を当てたスコアリングシステムは、より深刻なレベルの損傷や樹状突起などの細胞の一部にのみ影響を与える神経損傷に敏感ではない可能性があります。デンドライトは化学ストレータに反応して一貫して検出可能な形態変化の範囲が最も大きいように見えるので、我々は分析の基礎としてそれらを選択しました。ここで提示するスコアリングシステムは、我々の研究室^29、33で以前に使用されていた樹状突起形態ベースのマルチポイントスケールから変更されます。このシステムは、高齢者樹状突起の増加するキンク数などの加齢に伴う形態学的変化を考慮し、重度の損傷と完全な樹状突起損失を区別するために、これらの5ポイントと6ポイントスケールを7ポイントスケールに拡大します。このスコアリングシステムを導入する目的は、神経損傷のすべてのレベルで神経変性の包括的な画像をキャプチャし、C.エレガンドーパミン作動性神経変性研究全体の一貫性をサポートするための普遍的なシステムを提供する能力を提供することです。スコアリングは本質的に主観的であるため、個人スコアリング間の一貫性を最大化し、手動ブラインドまたは自動ブラインドプログラム³⁵を使用して画像のアイデンティティにスコアラーを盲目にすることが重要である。一貫性を向上させるために、一連のトレーニング画像を提示し、JoVEのビデオ機能を利用してスコアリングシステムを詳細に実証します。両方の自動ブラインドスコアリングを許可し、スコアラーが画像のサブセットを再スコアリングすることによって彼女または彼の得点の一貫性を定量化できるようにするシステムを使用することをお勧めします。これは、複数の科学者のデータを組み合わせたり比較したり、採点に新しい科学者を訓練したりする場合に特に重要です。