Zebrafisch-Blastoderm-Explantaten werden erzeugt, indem embryonale Zellen aus endogenen Signalzentren innerhalb des frühen Embryos isoliert werden, wodurch relativ naive Zellcluster erzeugt werden, die leicht manipulierbar und ex vivokultiviert werden können. Dieser Artikel enthält Anweisungen zur Herstellung solcher Expflanzen und demonstriert ihren Nutzen, indem er die Rollen für die Knotensignalisierung während der Gastrulation abfragt.
Zebrafischembryonen sind aufgrund ihrer optischen Klarheit und schnellen Entwicklung ein hervorragendes System, um Zellverhalten und Entwicklungsprozesse zu untersuchen. Aufgrund der Komplexität und Redundanz embryonaler Signale kann es jedoch schwierig sein, die vollständige Rolle eines einzelnen Signals während der frühen Embryogenese zu erkennen. Durch die Explantierung der Tierregion des Zebrafisch-Blastoderms werden relativ naive Cluster embryonaler Zellen erzeugt, die ex vivoleicht kultiviert und manipuliert werden können. Durch die Einführung eines Gens von Interesse durch RNA-Injektion vor der Explantation kann man die Wirkung dieses Moleküls auf die Genexpression, das Zellverhalten und andere Entwicklungsprozesse relativ isoliert beurteilen. Darüber hinaus können Zellen aus Embryonen verschiedener Genotypen oder Zustände in einem einzigen chimären Explantat kombiniert werden, um Zell-Gewebe-Interaktionen und gewebespezifische Genfunktionen zu untersuchen. Dieser Artikel enthält Anweisungen zur Erzeugung von Zebrafisch-Blastoderm-Explantaten und zeigt, dass ein einzelnes Signalmolekül – ein Knotenligand – ausreicht, um die Keimschichtbildung und Erweiterungsmorphogenese in ansonsten naiven embryonalen Geweben zu induzieren. Aufgrund ihrer Fähigkeit, embryonales Zellverhalten, Morphogengradienten und Genexpressionsmuster in einem vereinfachten Ex-vivo-System zu rekapitulieren, wird erwartet, dass diese Explantaten für viele Zebrafischforscher von großem Nutzen sind.
Ein immerwährendes Ziel der Entwicklungsbiologie ist es, die Komplexität der Entwicklung von Embryonen zu entwirren, um den Ursprung der Tierform und -funktion zu verstehen. Selbst frühe Embryonen enthalten eine komplexe Mischung aus Signalmolekülen, Zell- und Gewebeinteraktionen und mechanischen Kräften, die alle einer strengen räumlichen und zeitlichen Regulierung unterliegen. Aus diesem Grund ist es oft schwierig, die genaue Rolle eines bestimmten Signals in einem Entwicklungsprozess von Interesse zu bestimmen. Durch die Entfernung embryonaler Gewebe aus ihrer endogenen Umgebung schafft die Embryonenexplantation eine vereinfachte Plattform, um die Entwicklungsrollen einzelner Gewebe und Moleküle in relativer Isolation zu erkennen. Explantationstechniken sind vielleicht am besten bei Xenopus laevisbekannt, wo sie verwendet wurden, um Gewebeinduktion, Zellsignalisierung, Zelladhäsion und Morphogenese zu untersuchen, neben anderen Prozessen1,2,3,4. Sogenannte Animal Cap Explantate, bei denen die Tierregion der Xenopus-Embryonen im Blastulastadium vor induktiven Wechselwirkungen5,6,7isoliert wird, sind eine weit verbreitete und leistungsfähige Explantattechnik. Unmanipulierte Tierkappen sind dazu bestimmt, Ektoderm7,8zu werden. Dennoch sind sie in der Lage, auf mehrere induktive Faktoren zu reagieren, so dass sie Gewebe aller drei Keimschichten bilden und gewebegerechte morphogenetische Bewegungen durchlaufenkönnen 9,10,11. Begrenzte genetische Werkzeuge und eine suboptimale Eignung für die Live-Bildgebung verhindern jedoch die Verwendung von Xenopus-Tierkappen-Explantaten für viele Entwicklungsbiologen. Durch die Explantierung von Blastoderm-Zellen aus Zebrafischembryonen können Forscher den Nutzen des Tierkappen-Assays mit der optischen Klarheit, der Fülle genetischer Werkzeuge und anderen experimentellen Vorteilen des Zebrafisch-Modellsystems kombinieren.
Bisher haben Forscher zwei Geschmacksrichtungen von Zebrafisch-Explantaten verwendet: sogenannte Pescoids und die Blastoderm-Explantaten. Im Pescoid-Modell wird das gesamte Blastoderm, einschließlich der Randzone, aus dem Eigelb isoliert und ex vivo ohne die extraembryonale Eigelb-Synzytialschicht (YSL)entwickelt 12,13. Auf diese Weise haben Pescoids eine bemerkenswerte Ähnlichkeit mit den Fundulus-Explantaten, die vor Jahrzehnten von Jane Oppenheimer und J.P. Trinkaus14,15erzeugt wurden. Diese Explantate rekapitulieren viele Aspekte der embryonalen Musterung und Morphogenese12,13. Da diese Isolate jedoch endogene Signalzentren (den embryonalen Rand) enthalten, sind sie hinsichtlich ihres molekularen Milieus nicht vereinfacht. Alternativ können Forscher relativ naive Zebrafisch-Blastodermen-Explantaten erzeugen, indem sie die Randzone16,17,18,19,20,21ausschließen. Unmanipulierte Zebrafisch-Blastoderm-Explantate explantieren hohe Mengen an Knochenmorphogenetischem Protein (BMP) Morphogenen19 und führen zu nicht-neuralen Ektodermen und umhüllenden Schichten (EVL), wenn sie ex vivokultiviert werden18. Sie rekapitulieren jedoch viele Aspekte der axialen Musterung und Morphogenese als Reaktion auf exogene Signalgradienten19,20,21, ähnlich wie Xenopus-Tierkappen. Aus diesem Grund sind Blastoderm-Explantaten ein vorteilhaftes Modell, um die Rolle eines gegebenen Morphogens (oder von Morphogenen) bei der Keimschichtspezifikation, morphogenetischen Zellbewegungen und Signalgradienten in einer vereinfachten Signalumgebung zu untersuchen. Darüber hinaus können Blastodermen aus Embryonen verschiedener Genotypen oder Zustände in einem einzigen chimären Explantat19,21 kombiniertwerden,um die Zell-/Gewebeautonomie und induktive Wechselwirkungen zu untersuchen.
Zebrafisch-Blastoderm-Explantaten können verwendet werden, um die Rolle embryonaler Signale (z. B. Nodal) bei der Morphogenese und Gewebespezifikation während der Gastrulation zu untersuchen. Durch die Injektion synthetischer ndr2-RNA (die für einen Knotenliganden kodiert) im Einzelzellstadium wird die Knotensignalisierung im gesamten Blastoderm des Embryos aktiviert. Explantate aus diesen Embryonen erzeugen Knotensignalgradienten, bilden alle drei Keimschichten und durchlaufen Konvergenz- und Erweiterungsgastrulationsbewegungen (C & E), wie sie bei intakten Embryonen beobachtet werden20. Zusätzlich werden chimäre Explantate verwendet, um die Fähigkeit von Mesodermgeweben zu veranschaulichen, Neuroektodermen aus nicht injizierten (naiven) Blastodermen zu induzieren. Dieses Protokoll enthält Anweisungen zur Herstellung von Zebrafisch-Blastodermen-Explantaten und demonstriert ihren Nutzen bei der Definition der Rolle der Knotensignalisierung bei der Gewebeinduktion und Morphogenese.
Dieser Artikel hat beschrieben, wie Zebrafisch-Blastoderm-Explantaten erzeugt werden können, und zwei praktische Anwendungen dieser Explantaten diskutiert, um die Rolle der Knotenmorphogensignalisierung bei der Gastrulation anzugehen. Diese Methode des Schneidens und Kultivierens von Explantaten liefert ein unbeschriebenes Blatt naiver Zellen, die mit RNA-Injektionen und der Behandlung mit niedermolekularen Verbindungen manipuliert werden können, um einen molekularen Weg von Interesse zu untersuchen.
Kritische Schritte
Es gibt vier Schritte in diesem Protokoll, die für seinen Erfolg besonders entscheidend sind. Die erste besteht darin, den Embryonen die entsprechende Menge Nodal zu injizieren. Dieses Protokoll empfiehlt 10 pg ndr2 RNA, und obwohl eine Reihe von Dosen die Erweiterung fördert, verhindert zu viel oder zu wenig Nodal eine optimale Explantatverlängerung20. Der zweite Schritt ist die Dekreionierung der Embryonen. Wenn die Embryonen zu lange in der Pronase bleiben, platzt das Eigelb und die Embryonen können nicht geschnitten werden. Wenn sie nicht lange genug in der Pronase sind, werden die Chorionen durch das Waschen nicht gelockert und erfordern stattdessen eine zeitaufwendige manuelle Dekationierung. Der dritte kritische Schritt ist das Schneiden der Explantate. Das Einschneiden in 3x Danieaus Lösung wird empfohlen, da der niedrigere Salzgehalt von 0,3x Danieaus Lösung oder Eiwasser die Heilung und das Überleben von Explantaten nicht fördert.
Zusätzlich müssen die Explantate in etwa halber Höhe des Blastoderms geschnitten werden, um die Naivität der Zellen zu gewährleisten. Wenn sie zu nahe am Eigelb geschnitten werden, enthalten sie Signale vom Rand (einschließlich endogener Knoten), die die Gewebespezifikation und Morphogenese fördern. Der vierte und letzte kritische Schritt ist die Heilung von chimären Explantaten. Zwei Expflanzen verschmelzen nicht zu Chimären, es sei denn, ihre Schnittkanten werden unmittelbar nach dem Schneiden vorsichtig zusammengedrückt.
Änderungen und Fehlerbehebung
Die oben beschriebenen kritischen Schritte bieten Möglichkeiten zur Fehlerbehebung. Einige häufige Probleme und Lösungsvorschläge werden im Folgenden vorgestellt.
Wenn sich Explantaten in Gegenwart von Knotensignalisierung nicht ausdehnen, gibt es einige mögliche Lösungen. (A) Injektion von Embryonen im Einzelzellstadium, um sicherzustellen, dass die RNA gleichmäßig über den gesamten Embryo verteilt ist. (B) Vermeiden Sie die Injektion von zu viel Knoten-RNA, indem Sie sicherstellen, dass das injizierte Volumen korrekt ist, indem Sie einen Mikrometer verwenden, um den Injektionsbolus zu messen. (C) Vermeiden Sie es, zu wenig Knoten-RNA zu injizieren, indem Sie ihre Konzentration messen, um sicherzustellen, dass sie nicht abgebaut wurde. (D) Bewahren Sie einige altersangepasste intakte Geschwister auf, um auf das äquivalente Stadium der Expflanzen zu schließen. Explantaten erreichen die maximale Ausdehnung, wenn intakte Geschwister das 2-5-Somite-Stadium erreichen. Wenn die Explantate zu früh gesammelt werden, wird die optimale Ausdehnung nicht erreicht.
Wenn das Eigelb nach der Dekaionierung platzt und die Embryonen nicht schnittbar sind, entfernen Sie die Embryonen aus der Pronaselösung, sobald die Chorionen zu knittern beginnen und 1-2 Embryonen ihr Chorion abwerfen. Dann sofort in Eiwasser abspülen.
Wenn die Explantate an den Rändern sprudelnd erscheinen, gibt es einige Lösungen. (A) Schneiden Sie Expflanzen nur innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens der Entwicklung. Obwohl Explantaten, die in jedem Stadium von 128- bis 1000-Zell-Stadien geschnitten werden, in Kultur überleben und sich ausdehnen können, neigen diejenigen, die in 256- bis 512-Zell-Stadien geschnitten werden, dazu, die robustesten zu sein. (B) Stellen Sie sicher, dass Explantaten in 3x Danieaus Lösung geschnitten werden, um eine ordnungsgemäße Heilung zu gewährleisten. (C) Explantate sauber, aber schonend schneiden. Vermeiden Sie es, die Zellen während des Schneidvorgangs zu dehnen oder auseinander zu ziehen.
Wenn sich die nicht injizierten Kontroll-Explantate ausdehnen, schnitten explantierte Explantate wahrscheinlich zu nahe am Eigelb. Damit Explantate naiv sind, stellen Sie sicher, dass die Schnitte auf halbem Weg zwischen dem Eigelb und der Oberseite des Blastoderms erfolgen.
Wenn die chimären Explantate nicht verschmelzen, liegt dies wahrscheinlich daran, dass die Tendenz von Explantaten in 3x Danieaus Lösung nach dem Schneiden darin besteht, sich über die Schnittkante aufzurunden und zu heilen. Um sicherzustellen, dass die beiden Blastodermen zueinander und nicht zu sich selbst heilen, drücken Sie sie sofort nach dem Schneiden zusammen. Verwenden Sie eine Pinzette, um sanften Druck auf die neu verbundenen Blastodermen im Agarose-Brunnen auszuüben, um sie zur gemeinsamen Heilung zu ermutigen.
Begrenzungen
Während diese Explantate ein wertvolles Werkzeug sind, um die Rolle eines bestimmten Morphogens (oder eines anderen Moleküls von Interesse) in relativer Isolation zu untersuchen, müssen Beobachtungen in jedem Ex-vivo-Modell mit Vorsicht interpretiert werden. Explantate weisen eine C&E-Morphogenese auf, die der in vivo20beobachteten sehr ähnlich ist, aber sie rekapitulieren nicht alle Aspekte der Gastrulation, zum Beispiel Epiboly-Bewegungen. Ihnen fehlen auch viele andere regulatorische Faktoren und Signalmoleküle, die in einem intakten Embryo vorhanden sind. Während dies ein bedeutender experimenteller Vorteil von Explantaten ist, kann es auch zu Schlussfolgerungen führen, die in vivonicht gelten. Da beispielsweise Explantaten, die keine exogenen Nodalliganden erhalten, keine Neuroektodermmarker exprimieren, könnte man allein aus Explantaten schließen, dass die Knotensignalisierung für die Neuroektodermspezifikation erforderlich ist. Neuroektoderm wird jedoch in intakten Embryonen gebildet, denen alle Knotensignale fehlen23,24, was die lebenswichtige Rolle anderer Signalmoleküle in der neuronalen Spezifikation32zeigt. Explantate können uns sagen, wozu ein Morphogen in einer isolierten Umgebung fähig ist. Dennoch sollten alle diese Befunde in intakten Embryonen bestätigt / verglichen werden, damit die Ergebnisse gründlich interpretiert werden können. Mit anderen Worten, Explantaten können nicht den Platz eines sich entwickelnden Embryos einnehmen. Stattdessen sind sie ein ergänzendes Werkzeug, um die Rolle und Beziehung eines Morphogens mit der Umgebung zu identifizieren. Vor diesem Hintergrund sind Zebrafisch-Blastoderm-Explantaten ein wertvolles Werkzeug für viele Forschungsfragen.
Bedeutung gegenüber bestehenden Methoden
Mit dem erneuten Interesse an der synthetischen Embryologie werden regelmäßig verschiedene ex vivo- und in vitro-Ansätze eingesetzt, um Aspekte der Embryonalentwicklung zu modellieren. Zum Beispiel können 2- und 3-dimensionale Gastruloide, die aus embryonalen / induzierten pluripotenten Stammzellen der Maus oder des Menschen bestehen, durch die Anwendung exogener Signalmoleküle dazu gebracht werden, einige der Muster- und / oder morphogenetischen Ereignisse der Gastrulation, Segmentierung und Neurulation zu rekapitulieren33,34,35,36,37 . Obwohl diese Methoden leistungsfähig sind, erfordern sie mühsame und verlängerte Kulturmethoden, um sowohl pluripotente Stammzellen kontinuierlich zu erhalten als auch Gastruloiden zu züchten, die viele Tage benötigen, um Gastrulationsstadien zu erreichen. Im Gegensatz dazu benötigen Zebrafisch-Explantate keine Pflege von Stammzellkulturen, da Embryonen einfach nach Bedarf entnommen werden. Sie sind relativ einfach zu erzeugen und erreichen Gastrulationsstadien innerhalb von Stunden, genau wie Zebrafischembryonen. Dies unterstreicht einen weiteren Vorteil von Zebrafisch-Explantaten, ihre intakte Entwicklungsuhr. Da das Entwicklungsalter embryonaler und induzierter pluripotenter Stammzellen variabel und stark diskutiert sein kann, sind embryonale Explantaten vielleicht besser geeignet, um die zeitliche Regulation der Entwicklung zu untersuchen. Schließlich, während sich Pescoid-Zebrafisch-Expflanzen (die den embryonalen Rand enthalten) in Kultur12,13ähnlich ausdehnen, tun sie dies als Reaktion auf endogene Signalzentren. Stattdessen ermöglichen die hier beschriebenen Explantate den Forschern, Moleküle von Interesse mit relativ wenig Interferenz durch solche embryonalen Signale zu untersuchen.
Mögliche zukünftige Anwendungen
Hier wurden Explantaten verwendet, um zu zeigen, dass die Knotensignalisierung für die C&E-Morphogenese notwendig und ausreichend ist. Es wird jedoch erwartet, dass sie verwendet werden können und werden, um die Rolle vieler verschiedener Moleküle in vielen anderen Entwicklungsprozessen zu erkennen, zum Beispiel bei der Regulation der Genexpression, Signalgradienten und zusätzlichen morphogenetischen Programmen. Da diese Explantate bis mindestens 24 hpf19lebensfähig sind, kann erwartet werden, dass sich ihr Nutzen über die Gastrulation hinaus auf Prozesse wie Segmentierung und Organogenese erstreckt, jeden Prozess, bei dem Forscher ein unbeschriebenes Blatt in der Entwicklung wünschen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von NICHD R00HD091386 an MLKW und an NIEHS T32ES027801 an AAE unterstützt.
1 mm glass beads | Millipore-Sigma | Z250473 | |
4% Paraformaldehyde | VWR | J19943-K2 | |
6-well plates | Fisher | FB012927 | |
Agarose | Thermo-Fisher | 16500500 | |
Ca(NO3)2 .4H2O | Thermo-Fisher | 12364-36 | |
DMEM/F12 media | Gibco | 11330032 | |
Dumont #5 watchmakers forceps | World Precision Instruments | 500341 | |
Embryo injection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
Glass crystalizing dishes | Fisher | 08-741A | |
Glass Petri dishes | Fisher | 08-748A | |
HEPES | VWR | JT4018-1 | |
Instant Ocean sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
KCl | VWR | BDH9258-500G | |
Low temperature incubator | Fisher | 15-015-2632 | |
MgSO4.7H2O | VWR | 97062-134 | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
Micrometer | SPI supplies | 02265-AB | |
Mineral oil | VWR | MK635704 | |
NaCl | VWR | BDH9286-500G | |
Newborn Calf Serum | Invitrogen | 26010-066 | |
Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-30 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo-Fisher | 15140122 | |
Pico-pump pneumatic injector | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
Pipet pump | Fisher | 13 683C | |
Plastic Petri dishes 100 mm | Fisher | FB0875712 | |
Plastic Petri dishes 60 mm | Fisher | FB0875713A | |
Plastic wash bottles | Fisher | 03-409-10E | |
Pronase | Millipore-Sigma | 10165921001 | |
Tween-20 | VWR | 200002-836 |