从斑马鱼胚胎中产生幼稚的胚泡外植体

1 准备试剂和耗材 试剂制备 准备500毫升3x Danieau的溶液（溶液1，表1）。 准备1L鸡蛋水（溶液2，表1）。 在鸡蛋水中准备1.2%的琼脂糖溶液。琼脂糖在微波炉中完全融化，然后在水浴中冷却至55°C。 根据实验条件准备4 mL外植体培养基（溶液3，表1，从19，21略微改良）。注意：在计算所需体积时，请记住至少一个来自未注射（或对照注射）胚胎的外植体孔。 用70%乙醇消毒工作空间。 从4°C中取出细胞培养基，并用70%乙醇喷雾/擦拭。 使外植体培养基并置于28.5°C培养箱中以在注射胚胎时加热。注意：始终包括年龄匹配，完整的兄弟姐妹胚胎，以便分期。将这些胚胎去脉，并在琼脂糖包被的平板上培养0.3x Danieau溶液（溶液4，表1）。 从-20°C除去丙酶等分试样（1 mL，20 mg / mL），并在冰上解冻。解冻每三个实验条件一个1 mL等分试样。 准备琼脂糖板 制作注射板。 将100 mm x 15 mm的塑料培养皿中加入半滴熔融琼脂糖放入鸡蛋水中。 将注射模具以45°角轻轻地放在熔融琼脂糖的顶部，然后逐渐将其降低到琼脂糖中，确保下面没有气泡。让它完全冷却。 取出模具。立即使用盘子或通过加入2mL鸡蛋水，包裹盘子并将其储存在4°C以备后用。 注射前在28.5°C培养箱中加热板15-30分钟。 制作外植切割板。 将3 mL熔融的1.2%琼脂糖加入鸡蛋水中，放入60 mm x 15 mm培养皿中，确保整个井底都涂有涂层。让它完全冷却。 用琼脂糖覆盖培养板。 对于每个实验条件，将1 mL熔融的1.2%琼脂糖在鸡蛋水中分配到6孔板的一个孔中，确保整个孔的底部被涂覆。让它完全冷却。 为了制作嵌合外植体，通过在60 mm x 15 mm培养皿中的熔融琼脂糖中加入12个1mm玻璃珠，创建具有小孔的外植体切割皿。琼脂糖完全冷却后，用镊子取出珠子。 2 用RNA注射胚胎 戴上手套，从-80°C的储存中取出一等分试样的合成 ndr2 mRNA，并立即将其放在冰上。 准备注射针。 用RNA填充拉动的玻璃毛细管针。将填充的针放入微型机械手中，并用镊子折断针尖。 使用带有一滴矿物油的载物台千分尺校准注射量，调整注射时间和气动注射器上的压力，以实现所需尺寸的推注。直径为120μm的推注量为1 nL。注意：推注的所需体积将取决于RNA的浓度和每个胚胎的所需剂量。例如，如果RNA在10 ng / μL下等分，则注射1 nL以达到10pg的最终量。 保持RNA针尖浸没在油中，直到准备注射。 加载胚胎并注射。 拉动繁殖池中的分隔物，让鱼产卵10-15分钟，然后使用茶过滤器收集胚胎。 使用巴斯德移液器和移液器泵将胚胎装入注射板，然后用戴手套的手指将卵子轻轻地压入槽中。 将10 pg ndr2 RNA注射到单细胞胚胎的蛋黄中，直到达到所需的胚胎数量或直到胚胎开始分裂。注意：不要在单细胞阶段后注射，以确保RNA在整个胚胎中的均匀分布。 将胚胎从注射板中洗出到标记的100 mm x 15 mm培养皿中，从挤压瓶中加入温和的鸡蛋水流。注意：始终保留一组年龄匹配、未被打扰的兄弟姐妹作为对照。 将胚胎放入28.5°C培养箱中，直到它们达到128细胞阶段。从培养皿中取出未受精的卵子和死胚胎。 3 对胚胎进行去鞘化 一旦胚胎达到128个细胞阶段，将它们放入标记的玻璃培养皿中，并从中倾出尽可能多的鸡蛋水。 用实验室胶带（对应于小碟子名称）标记玻璃结晶皿，并用鸡蛋水填充2/3的方式。将这些培养皿放在解剖显微镜旁边，以便快速接近。 在50 mL锥形管中加入1mL丙酶原液（20mg / mL，在冰上解冻）到15mL 3x Danieau溶液中。注意：此量足以满足最多三种实验条件。增加前蛋白酶的体积和3倍Danieau的溶液，以获得额外的外植体条件。注意：Pronase是一种刺激物;因此，在处理时戴上手套。 向每个含有胚胎的玻璃培养皿中加入至少5mL的丙酶溶液。 以圆周运动搅拌玻璃盘，在解剖显微镜下持续监测去角质的进度。 一旦绒毛膜开始起皱，1-2个胚胎从绒毛膜中出来，小心地将含有蛋白酶的玻璃培养皿和胚胎浸入含有鸡蛋水的相应玻璃结晶皿中。 洗涤去甲状胚胎。 用鸡蛋水清洗胚胎三次，轻轻加入，然后从盘子中倒出鸡蛋水。 第三次也是最后一次洗涤是用0.3倍的Danieau溶液。注意：如果胚胎在洗涤后仍有绒毛膜，请轻轻移液胚胎，直到绒毛膜被移除，或者让它们静置在洗涤物（卵水或0.3x Danieau’s溶液）中一两分钟，然后轻轻地以圆周运动搅拌。 用培养皿盖覆盖去瓶的胚胎，并将其返回培养箱（28.5°C），直到它们达到256个细胞阶段。 4 切口外植体 用3x Danieau的溶液填充琼脂糖包被的60 mm x 15 mm培养皿。 一旦胚胎处于256细胞阶段，将它们转移到含有3x Danieau溶液的琼脂糖包被的板中，沿着培养皿的中心排列。 使用镊子切割外植体（图1）。 使用一对闭合的镊子来稳定胚胎，并使用另一对镊子以大约一半的高度（从边缘到动物极）切穿胚层（图1A）。 要切割，用一对镊子轻轻挤压胚泡细胞。然后，取稳定镊子并沿着其他镊子运行它们，以在胚泡皮层上切开大约一半（图1B）。 旋转胚胎，将镊子放入现有的切口中，然后将剩余的胚芽正交切开到第一个切口（图1C）。 将外植体保持在3x Danieau的溶液中至少5分钟以愈合，然后将它们转移到涂有琼脂糖并充满4mL外植体培养基的6孔板的孔中。注意：将未注射（或对照注射）兄弟姐妹的外植体切除为阴性对照。如果外植体的实施正确，这些外植体既不会延伸也不会表达内胚层、中胚层或神经外胚层的标志物。 将外植体培养板放入28.5°C培养箱中，直到达到所需的时间点/阶段（从完整的兄弟姐妹中确定）。注意：如果用化合物（例如小分子抑制剂）处理外植体，则可以在所需的时间点将所需浓度直接添加到孔内的外植体培养基中。在计算浓度时，请记住包括琼脂糖的体积。（例如：1 mL 琼脂糖 + 4 mL 外植体培养基 = 每孔 5 mL 总体积）。 5 准备嵌合外植体 代替常规琼脂糖涂层板，在培养皿中切割嵌合体外植体，琼脂糖使用1mm玻璃珠模塑成十二个小的浅孔（第1.2.4节）。用3x Danieau的溶液填充此盘子。注意：嵌合外植体是由两个不同基因型或条件的胚胎的胚芽细胞产生的。确保这些条件可以通过转基因或注射的荧光标记物的表达来区分。 通过将一种基因型/条件的十二个胚胎添加到板的左侧，并将另一种基因型/条件的十二个胚胎添加到板的右侧来准备。 将每种条件的一个胚胎移动到板的中心，靠近12个孔中的一个。 使用镊子，按照单个胚胎外植体的描述从每个胚胎中切割一个外植体（步骤4.3）。 使用镊子将两个外植体的切边在浅孔内快速压在一起，以使两半愈合成单个外植体。 继续板内剩余的11个孔。一旦外植体愈合，将它们转移到涂有琼脂糖并充满4mL外植体培养基的6孔板的孔中。重复此步骤，直到达到所需的外植体数量。 6 培养和/或成像固定外植体 在28.5°C培养箱中培养外植体，直到完整的兄弟姐妹胚胎达到所需阶段。 活外植体可以安装用于连续延时成像，在整个培养期间定期成像，或在实验终点进行现场成像。 如果需要，固定外植体。一旦外植体达到所需的终点，记下完整胚胎兄弟姐妹的阶段，并将外植体放入装有1 mL 4%多聚甲醛的玻璃闪烁小瓶中PBS。在4°C的摇摇杯上固定过夜。注意：多聚甲醛是有毒的。处理这种化学品时戴上手套，并通过每个机构批准的方法进行处理。 固定后，用PBS + 0.1%吐温-20冲洗外植体六次，每次15分钟，然后逐渐脱水成甲醇。将外植体储存在-20°C，以便以后通过全口 原位 杂交，免疫荧光染色等进行分析。