植物細胞におけるフェルスター共鳴エネルギー移動測定
Özet
インビボフェルスター共鳴エネルギー移動測定に対して標準の共焦点レーザー走査顕微鏡を設定し、その後データ評価を行うためのプロトコルが提供されています。
Abstract
感作発光ベースのフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)実験は簡単に行われますが、顕微鏡の設定に依存します。共焦点レーザー顕微鏡は生物学者の役馬となっています。商用システムは、レーザーパワー調整と検出器感度に高い柔軟性を提供し、多くの場合、完璧な画像を得るために異なる検出器を組み合わせます。しかし、この柔軟性により、異なる実験やセットアップによる強度ベースのデータの比較は、しばしば不可能です。生物学者に優しい手順は利点があり、レーザーおよび検出器の設定の簡単で、信頼できる調節を可能にする。
さらに、生細胞におけるFRET実験は、タンパク質発現およびドナー・アクセクター比の変動の影響を受けるため、データ評価のためにタンパク質発現レベルを考慮する必要があります。ここで説明するのは、タンパク質発現の推定とレーザー強度と検出器の設定の調整のためのルーチンを含む、信頼性と再現性FRET測定のための簡単なプロトコルです。データ評価は、既知のFRET効率の蛍光色素融合を用いた較正により行われる。簡便性を向上させるために、細胞内で得られた補正因子と、組換え蛍光タンパク質の測定によって得られた補正因子が比較されてきた。
Introduction
フェルスター共鳴エネルギー移動((F)RETは、通常、蛍光分光法によって観察されるが、プロセス自体は、フルオロフォア間で発生するに限定されない。基礎となる双極子双極子結合は単に発光のドナー分子および光吸収の受け入れ器を必要とする。これは、正規化されたドナー発光とアクピケータ吸光度スペクトル1の必要なスペクトルオーバーラップ積分Jに由来する。しかし、RETは蛍光と競合するため、蛍光発光の変化によりエネルギー移動が測定可能になる:RETはドナーの焼入れおよび感作アクセプターの放出を誘導する。
蛍光系RETは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)と呼び、これを生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)から分離する。RETは、0.5〜10 nm2の範囲で広く、したがって、タンパク質とその複合体の寸法と同じ範囲にあるドナーとアクセクターの間の距離に強く依存します。第二に、RETは双極子双極子方向カッパ二乗に依存する。タンパク質結合フルオロフォアの回転自由度は分子量と回転緩和の遅さにより無視され得るという事実と相まって、RETは立体構造変化の解析を可能にする3。
いわゆるフェルスター半径は、スペクトル重複積分とオーバーラップの波長範囲に基づいているため、赤色光吸収性のクロモフォアは青色光吸収色素よりも長いフェルスター半径をもたらす。FRET測定のダイナミックレンジはR0×0と1.5×R0によって制限されているため、FRETペアECFP-EYFPは4.9 nm4のR0により2.5-7.3 nmのダイナミックレンジを有します。
蛍光色素の明るさは、そのモル絶滅係数とその量子収率の積で与えられます。FRET測定では、ほぼ同じ輝度の蛍光体を選択することが有利です。これにより、ドナーの焼入れおよび感作アクセプター放出の検出が強化される。また、顕微鏡システムのキャリブレーションを好みます。頻繁に使用されるFRET対のシアンおよび蛍光タンパク質を見ると、シアン蛍光タンパク質の輝度が低いほど明らかになる(図1A)。
しかし、アクシーザの寿命はドナーの寿命よりも低く、エネルギー移動のためのアクシークサの利用可能性を確保しなければならない。アクセクサの寿命がドナーの存続期間を超えた場合、ドナーが再び興奮したときに、アクセクサは興奮状態にある可能性があります。mTurquoiseのような高度なシアン蛍光タンパク質は、寿命が長く、FRETの増加確率に寄与します(図1B)。FRET の確率も、アクシペクタのモル絶滅係数に依存します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ドナーの急流および感作アクセプター放出は、ドナーまたはアクセプターベースのFRETの計算を可能にする線形関係によって特徴付けられる。線形性の対応する要因は、G因子(受入者へのドナー)またはxi(ドナーへのアクシー)と呼ばれ、これは逆の値4である。蛍光顕微鏡による蛍光タンパク質間のフレット測定では、蛍光タンパク質の広い吸収および発光スペクトルにより、D…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
実験はビーレフェルト大学生物学部の光顕微鏡技術プラットフォーム(LiMiTec)で行われました。この作品はビーレフェルト大学が資金を提供しています。
Materials
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
Referanslar
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , (2006).
- Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it’s done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS ONE. 7, 49593 (2012).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).
- Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. GFP-based FRET-microscopy in living plant cells. Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).
- Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).
- Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).
- Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET. BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).
- Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).
- Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).
- Seidel, T., et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).
- Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FCγ receptor-mediated phagocytosis. PLoS Biology. 4, 162 (2006).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278 (2019).
