Messung des pH-Werts, der Redoxchemie und der abbauenden Kapazität von Makropinosomen mit Hilfe der ratiometrischen Dual-Fluorophor-Mikroskopie

Makropinozytose bezieht sich auf die Aufnahme großer Mengen extrazellulärer Flüssigkeit in membrangebundene zytoplasmatische Organellen, die Makropinosomen^1,2genannt werden. Es ist ein hochkonserviertes Verfahren, das von freilebenden einzelligen Organismen wie der Amöbe Dictyostelium sppdurchgeführt wird. ³, sowie Anthozoen⁴ und Metazoen². In den meisten Zellen ist die Makropinozytose ein induziertes Ereignis. Die Ligatur von Zelloberflächenrezeptoren induziert das Hervorkommen von Aktin-getriebenen Plasmamembranverlängerungen, die als Rüschen bezeichnet werden. Ein Bruchteil dieser Rüschen versiegelt sich durch einen schlecht verstandenen Mechanismus an ihren distalen Spitzen, um Makropinosomen zu bilden (obwohl sie den Rahmen dieses Methodenpapiers sprengen, verweisen wir auf detaillierte Übersichten über die Mechanik der Makropinozytose, siehe Referenzen^1,2,5,6,7). Der extrazelluläre Reiz, der die Makropinozytose induziert, ist meistens ein löslicher Wachstumsfaktor^5,8. Dementsprechend ermöglicht das makropinozytäre Ereignis die Einnahme eines Bolus aus extrazellulärem Material, aus dem die Zelle nützliche Metaboliten ableiten kann, um das Wachstum zu erleichtern. Leider kann dieser Weg zur Nährstoffzufuhr auch die Pathologie vorantreiben. Bestimmte Krebszellen beherbergen Mutationen, die zu einer kontinuierlichen oder konstitutiven Makropinozytose führen. Die kontinuierliche Zufuhr von Nährstoffen erleichtert die unkontrollierte Vermehrung von Krebszellen und wurde mit besonders aggressiven Tumoren in Verbindung gebracht^{9,10,11,12,13}. In ähnlicher Weise können Viren Makropinozytose induzieren, um Zugang zu Wirtszellen zu erhalten, wodurch die Viruspathologie vorangetrieben wird¹⁴.

Makropinozytose funktioniert auch bei der Aufrechterhaltung der Immunität gegen Krankheitserreger. Bestimmte angeborene Immunzellen wie Makrophagen und dendritische Zellen beteiligen sich an der konstitutiven und aggressiven Probenahme extrazellulärer Flüssigkeit über Makropinozytose^6,15,16. Dieser Modus der Makropinozytose ist unglaublich aktiv, und eine einzelne dendritische Zelle kann sich jede Stunde mit einem Volumen extrazellulärer Flüssigkeit einfüllen, das ihrem eigengewicht entspricht¹⁷. Trotz dieser konstitutiven Probenahme replizieren sich Makrophagen und dendritische Zellen nicht unkontrolliert wie Tumorzellen, sondern scheinen das extrazelluläre Material so zu verarbeiten, dass Informationen extrahiert werden können, um über das Vorhandensein oder Sogar Fehlen potenzieller Bedrohungen zu informieren. Informationen werden extrahiert als i) pathogen-assoziierte molekulare Muster, die von intrazellulären Pathogenerkennungsrezeptoren gelesen werden können, und ii) kurze Abschnitte von Aminosäuren, die auf wichtige Histokompatibilitätsmoleküle geladen werden können, um von Zellen des adaptiven Immunsystems gescreent zu werden^16,18,19. Ob Krankheitserreger diesen Weg zur Informationsverarbeitung durch Immunzellen untergraben, ist derzeit unklar.

Trotz dieser gut definierten und kritischen Rollen für die Makropinozytose sowohl bei der Aufrechterhaltung der Immunität als auch bei der Homöostase und im Gegensatz zu anderen häufiger untersuchten Modi der Endozytose ist wenig über die innere (luminale) Funktionsweise von Makropinosomen bekannt. Die Entwicklung standardisierter Protokolle und Werkzeuge zur Untersuchung der luminalen Biochemie von Makropinosomen wird uns nicht nur helfen, ihre einzigartige Biologie besser zu verstehen, sondern auch Erkenntnisse liefern, die für neuartige therapeutische Strategien, einschließlich der Medikamentenabgabe, genutzt werden können²⁰. Dieses Methodenmanuskript wird sich auf kürzlich entwickelte Werkzeuge konzentrieren, um auf der Ebene der Einzelnen Organellen verschiedene Aspekte der luminalen Biochemie von Makropinosomen zu sezieren.

Fluorophore können zur Messung spezifischer Biochemien von Organellen verwendet werden, wenn sie sich i) bevorzugt in das interessierende Kompartiment aufteilen und/oder ii) als Reaktion auf den interessierenden Parameter spektrale Veränderungen erfahren. Zum Beispiel sammeln sich im Falle des pH-Werts fluoreszierende schwache Basen wie Acridinorange, Cresylviolett und die LysoTracker-Farbstoffe bevorzugt in sauren Organellen an. Daher ist ihre relative Intensität ein grober Hinweis darauf, dass die markierte Organelle sauer ist. Andere pH-responsive Fluorophore wie Fluorescein, pHrodo und cypHer5e unterliegen spektralen Veränderungen bei der Bindung an Protonen (Abbildung 1A–C). Veränderungen der Fluoreszenzemission von pH-sensitiven Fluorophoren können daher eine sinnvolle Annäherung an den pH-Wert liefern. Die Verwendung von einzelnen Fluorophoren birgt jedoch eine Reihe von Nachteilen. Zum Beispiel können Änderungen der Fokusebene, Photobleaching und Änderungen des Volumens einzelner Organellen, ein häufiges Vorkommen in Makropinosomen^21,Änderungen der Fluoreszenzintensität einzelner Fluorophore induzieren, und dies kann nicht leicht für²²korrigiert werden. Einzelwellenlängenbewertungen sind zwar nützlich für die Visualisierung saurer Kompartimente, aber daher rein qualitativ.

Ein quantitativerer Ansatz besteht darin, das parameterempfindliche Fluorophor zusammen mit einem Referenzfluorophor auf die interessierende Organelle auszurichten. Das Referenzfluorophor ist idealerweise unempfindlich gegenüber biochemischen Veränderungen innerhalb der Organelle (Abbildung 1D–F) und kann daher verwendet werden, um Veränderungen der Fokusebene, des Organellarvolumens und bis zu einem gewissen Grad des Photobleachings zu korrigieren²³. Mit diesem Ansatz, der als duale fluorophore ratiometrische Fluoreszenz bezeichnet wird, kann eine Korrektur erreicht werden, indem ein Verhältnis der Fluoreszenzemission des parametersensitiven Fluorophors zum Referenzfluorophor erzeugt wird.

Hier wird das Protokoll das Prinzip der ratiometrischen Dual-Fluorophor-Bildgebung nutzen, um pH-Wert, oxidative Ereignisse und Proteinabbau in Makropinosomen zu messen. In jedem Fall wird ein Fluorophor ausgewählt, das empfindlich auf den interessierenden Parameter reagiert, und ein Referenzfluorophor. Um die Fluorophore gezielt auf Makropinosomen auszurichten, werden sie kovalent an 70 kDa Dextran gekoppelt, das bevorzugt in Makropinosomen eingebaut wird²⁴. Alle Assays werden in Raw264.7-Zellen durchgeführt, können aber an andere Zelltypen angepasst werden. Wenn möglich, werden die Fluoreszenzverhältnisse gegen eine Referenzkurve kalibriert, um absolute Werte zu erhalten. Wichtig ist, dass alle Messungen in lebenden Zellen zur dynamischen und quantitativen Beurteilung der luminalen Umgebung von Makropinosomen durchgeführt werden.

Bei der Auswahl pH-sensitiver Fluorophore müssen eine Reihe von Überlegungen abgewogen werden. Der erste ist der pK_a des Fluorophors, der den Bereich der pH-Werte angibt, bei dem die Sonde am empfindlichsten ist. Wenn davon ausgegangen wird, dass kurz nach der Bildung der pH-Wert des Makropinosoms nahe an dem des extrazellulären Mediums (~pH 7,2) liegt und dass es durch Wechselwirkungen mit späten Endosomen und Lysosomen (~pH 5,0) progressiv ansäuert, sollte eine Sonde mit einem pK_a gewählt werden, die innerhalb dieses Bereichs empfindlich ist(Abbildung 2C). Das Fluorophor Fluorescein, das einen pK_a von 6,4 aufstellt, ist in diesem Bereich optimal empfindlich. Es wurde ausgiebig verwendet, um andere ähnliche Organellen, wie Phagosomen, zu messen, und wird das Fluorophor der Wahl in diesem Manuskript^22,25sein. Als Referenzfluorophor wird Tetramethylrhodamin verwendet, das unempfindlich gegen pH-Wert ist (Abbildung 1E). Andere Fluorophore wie pHrodo und cypHer5e können Fluorescein ersetzen, wenn die spektralen Eigenschaften von Fluorescein mit anderen experimentellen Variablen übereinstimmen. Einige vorgeschlagene Referenzfluorophore für pHrodo und cypHer5e sind in Abbildung 1 dargestellt.

Eine zweite Überlegung ist die Methode, mit der die beiden Fluorophore spezifisch auf Makropinosomen ausgerichtet werden. Dextran der Größe 70 kDa, das einen hydrodynamischen Radius von etwa 7 nm aufweist, haftet nicht unspezifisch an Zellen und wird in Makropinosomen, aber nicht in Clathrin-beschichtete Gruben oder Caveolae eingebaut und markiert daher Makropinosomen (Abbildung 2A und Abbildung 3A, B)^16,24,26. In diesem Protokoll werden Fluorescein-markierte 70 kDa-Dextran und Tetramethylrhodamin (TMR)-markierte 70 kDa-Dextran als pH-sensitive bzw. Referenzsonden verwendet.

In angeborenen Immunzellen stellen Makropinozytose und Phagozytose die beiden Hauptwege für die Internalisierung von exogenem Material zur Verarbeitung und anschließenden Präsentation der adaptiven Immunantwort an Zellen dar²⁷. Die sorgfältige und koordinierte Kontrolle der Redoxchemie des Lumens von Phagosomen und Makropinosomen ist entscheidend für die kontextspezifische Verarbeitung von exogenem Material. Der vielleicht am besten untersuchte Regulator oxidativer Ereignisse in Phagosomen ist die NADPH-Oxidase, ein großer Multi-Subunit-Komplex, der große Mengen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) im Lumen von Phagosomen produziert²⁸. In der Tat ist seine Aktivität von zentraler Bedeutung für eine angemessene Antigenverarbeitung innerhalb von Phagosomen^29,30. Die Aktivität der NADPH-Oxidase auf makropinosomalen Membranen wurde jedoch nicht untersucht.

In diesem Protokoll wird der H2DCFDA-Succinimidylester zur Messung oxidativer Ereignisse innerhalb des Makropinosoms verwendet. Dies ist eine modifizierte Form von Fluorescein (2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat), das in seiner reduzierten Form minimal fluoreszierend ist. Bei der Oxidation nimmt seine Fluoreszenzemission deutlich zu. Es ist jedoch erwähnenswert, dass H2DCFDA einen signifikanten Vorbehalt hat – da es auf dem Fluorophor Fluorescein basiert, wird seine Fluoreszenz auch in sauren Kompartimenten abgeschreckt, und bei der Gestaltung von Experimenten muss darauf geachtet werden, diese Variable zu kontrollieren²⁸. Ähnlich wie bei der Messung des pH-Werts wird der H2DCFDA-Succinimidylester kovalent an 70 kDa Dextran gebunden und TMR-markiertes 70 kDa Dextran wird als Referenzfluorophor verwendet (Abbildung 3A).

Fluoreszierendes Ovalbumin wird verwendet, um den Proteinabbau in Makropinosomen zu messen. Das hier verwendete Ovalbumin ist dicht mit einem 4,4-Difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL-Farbstoff markiert, der selbst abgeschreckt wird. Bei der Verdauung werden stark fluoreszierende farbstoffmarkierte Peptide freigesetzt. Da Ovalbumin nicht einfach zu 70 kDa Dextran konjugiert werden kann, werden Zellen mit TMR-markiertem 70 kDa Dextran und Fluidphasen-Ovalbumin koinkubiert. Das TMR-Signal wird verwendet, um während der Analyse nach der Bildgebung eine Makropinosom-Maske zu erzeugen, und das vom verdauten Ovalbumin freigesetzte Signal wird innerhalb der Maske gemessen (Abbildung 3B).