Dit protocol beschrijft twee gevoelige testen voor het onderscheid tussen milde, matige en ernstige motorische stoornissen in C. elegans-modellen van amyotrofische laterale sclerose, met algemeen nut voor C. elegans-stammen , met veranderde beweeglijkheid.
De neurodegeneratieve ziekte amyotrofische laterale sclerose (ALS) kenmerkt progressief verlies van motorneuronen vergezeld van spierzwakte en motorische stoornissen die met de tijd verergeren. Hoewel er aanzienlijke vooruitgang is geboekt bij het bepalen van genetische drivers van ALS voor een subgroep van patiënten, hebben de meeste gevallen een onbekende etiologie. Verder zijn de mechanismen die ten grondslag liggen aan motorneurondisfunctie en degeneratie niet goed begrepen; daarom is er een voortdurende behoefte om representatieve modellen te ontwikkelen en te karakteriseren om deze processen te bestuderen. Caenorhabditis elegans kunnen hun beweging aanpassen aan de fysieke beperkingen van hun omgeving, met twee primaire bewegingsparadigma’s bestudeerd in een laboratoriumomgeving: kruipen op een vast oppervlak en zwemmen in vloeistof. Deze vertegenwoordigen een complex samenspel tussen sensatie, motorneuronen en spieren. C. elegans modellen van ALS kunnen een beperking vertonen in een of beide van deze bewegingsparadigma’s. Dit protocol beschrijft twee gevoelige assays voor het evalueren van de beweeglijkheid in C. elegans: een geoptimaliseerde radiale voortbewegingstest die het kruipen op een vast oppervlak meet en een geautomatiseerde methode voor het volgen en analyseren van zwemmen in vloeistof (thrashing). Naast de karakterisering van baseline motorische stoornissen van ALS-modellen, kunnen deze testen onderdrukking of verbetering van de fenotypes detecteren door genetische of kleine molecuulinterventies. Deze methoden hebben dus nut voor het bestuderen van ALS-modellen en elke C. elegans-stam die veranderde beweeglijkheid vertoont.
Amyotrofische laterale sclerose (ALS) is een slopende, verouderingsgerelateerde neurodegeneratieve ziekte met een bijzondere impact op motorneuronen. De ziekte kenmerkt verlies van motorneuronen in de hersenen en het ruggenmerg en progressieve motorische stoornissen. Dit resulteert in ernstige functionele invaliditeit en vroegtijdig overlijden, meestal binnen 3-5 jaar na diagnose1. Mutaties in minstens 38 genen kunnen ALS veroorzaken; de meeste patiënten met ALS accumuleren echter ubiquitinated inclusies van het eiwit TDP-43 als hun primaire pathologie in neuronen en gliacellen2,3,4. Er zijn een aantal diermodellen ontwikkeld om de onderliggende mechanismen te bestuderen die in vivo ALS veroorzaken of eraan bijdragen (beoordeeld in5). Bij C. elegans omvatten deze modellen genetische functieverliesmutaties in homologen van ALS-veroorzakende genen of transgene expressie van menselijke ALS-genen. Er zijn tal van voordelen aan het modelleren van ALS in C. elegans. C. elegans zijn een handelbaar eenvoudig dier met een gedifferentieerd zenuwstelsel, goed gekarakteriseerde gedragsparadigma’s en een aanzienlijke genetische homologie aan de mens6,7. Er bestaan veel hulpmiddelen voor het werken met C. elegans, waaronder robuuste genoombewerkingsmogelijkheden, in vivo fluorescerende verslaggevers van neurodegeneratie, RNAi-screeningsparadigma’s, handelbare genetica en gevestigde gedrags- en fenotypische assays. C. elegans-modellen van ALS recapituleren aspecten van menselijke ziekten, waaronder accumulatie van onoplosbaar eiwit, neurodegeneratie en vroege dood8,9. Verder is motorische disfunctie met verstoring van zowel kruip- als zwemgedrag aanwezig in veel C. elegans ALS-modellen.
Dit protocol beschrijft twee methoden om C. elegans motorfenotypes te karakteriseren: de radiale voortbewegingstest voor het evalueren van kruipen op een vast oppervlak en de beoordeling van zwemmen in vloeistof (thrashing) met behulp van de WormLab geautomatiseerde tracking en analyse. Deze gevoelige methoden voor het karakteriseren van motorische tekorten maken vergelijkingen van de ernst mogelijk en bieden hulpmiddelen voor het meten van onderdrukking en verbeteringen van motorische fenotypen. De radiale voortbewegingstest kwantificeert verschillen in kruipmotiliteit (sinusoïdale beweging op een vast oppervlak) tussen populaties van wormen. Deze test maakt gebruik van C. elegans natuurlijke ongestimuleerde exploratiegedrag door wormen op een enkele locatie op een plaat te plaatsen en hun uiteindelijke locatie na een bepaalde periode te markeren10. Als alternatief, zwemmen in vloeibare (thrashing) assays tellen lichaamsbuigingen van individuele wormen over een bepaalde periode van tijd. Het handmatig tellen van lichaamsbuigingen door het menselijk oog is tijdsintensief en vertoont doorgaans een aanzienlijke variabiliteit tussen experimentatoren. Het gebruik van computerondersteunde geautomatiseerde tracking en analyse kan veel van die variabiliteit elimineren. Naast de karakterisering van baseline motorische stoornissen van ALS-modellen, kunnen zowel radiale voortbewegings- als zwemtests modulatie van verschillende locomotorische fenotypen detecteren uit genetische of kleine molecuulinterventies. Deze methoden hebben nut voor het bestuderen van ALS-modellen en elke C. elegans-stam die een veranderde beweeglijkheid vertoont.
Radiale voortbeweging:
De resolutie van deze test kan eenvoudig worden geregeld door de tijdvariabele te wijzigen. Het verlengen van de tijd maakt het gemakkelijker om verschillen tussen dieren met ernstige fenotypen waar te nemen, waardoor subtiele verschillen worden geïdentificeerd. Omdat deze test echter verplaatsing meet, zullen dieren met normale beweeglijkheid, zoals N2, naar de randen van de plaat reizen als de testtijd te lang wordt verlengd, en foerageergedrag zal leiden tot backtracking. Dit zal de meting van de afgelegde afstand kunstmatig verminderen. Te lange tijdsperioden kunnen leiden tot het verdwijnen van verschillen tussen stammen, met name tussen dieren met minder ernstige motorische fenotypen, omdat dieren gelijkmatig over de plaat worden verspreid. Het verkorten van de tijdvariabele voorkomt dat actievere wormen de randen van de plaat vinden. Deze methode houdt niet de totale afgelegde afstand voor elke worm bij, maar comprimeert de afgelegde afstand voor elke worm in een lineaire afstand van het midden van de plaat. Als zodanig is het inherent minder robuust dan een methode die de totale spoorlengte van individuele wormen registreert. De radiale voortbewegingstest vereist echter zeer weinig training van onderzoekers, gebruikt relatief betaalbare reagentia die algemeen beschikbaar zijn in de meeste wormlaboratoria en is gevoelig genoeg om significante en reproduceerbare resultaten te produceren. Voor laboratoria die de voorkeur geven aan geautomatiseerde videotracking, zijn er eerder verschillende methoden vastgesteld om kruipbewegingen te volgen en te analyseren12, of de softwareparameters die worden gebruikt voor de zwemtest in dit artikel kunnen worden gewijzigd om kruipdetectie en -analyse mogelijk te maken.
Dit experiment wordt meestal uitgevoerd in drievoud onafhankelijke replicaties, met een set van 30-40 wormen per replicatie. Elke replica wordt gesplitst op twee verschillende platen van 100 mm of 150 mm, met 15-20 wormen per plaat. Het gebruik van meer wormen dan aanbevolen per plaat kan het moeilijk maken om efficiënt te scoren. Een totaal aantal gescoorde 90+ is voldoende krachtig om significantie voor milde, matige of ernstige motiliteitsstoornissen vast te stellen. Consistent zijn met de timing tussen de gescoorde stammen is essentieel voor nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid. 30 minuten is over het algemeen lang genoeg om verschillen vast te stellen tussen matige tot ernstige fenotypen zoals transgene stammen die menselijke mutant TDP-43 tot expressie brengen in vergelijking met wildtype wormen (figuur 4). Als de tijdvariabele wordt verlengd, is het raadzaam om ook de grootte van de plaat te vergroten van 100 mm naar 150 mm. Omgevingsfactoren zoals temperatuur en vochtigheid kunnen deze test beïnvloeden, die meestal wordt uitgevoerd bij omgevingstemperatuur, dus het is belangrijk om altijd een wild-type (N2) -controle te gebruiken bij het vergelijken van tussen replicaties. Bovendien kan deze test de beweeglijkheid meten van sommige stammen die geen normaal zwemgedrag vertonen in vloeistof (thrashing), waardoor het een nuttige aanvulling is op de zwemtest.
Zwemtest:
Het gebruik van het beeldvormings- en acquisitiesysteem om het volgen en analyseren van wormzwemmen te automatiseren, zorgt voor rigoureuze en onbevooroordeelde gegevens. Er zijn echter verschillende factoren tijdens de eerste opzet van het experiment die tussen de monsters moeten worden gecontroleerd. Deze omvatten de tijd om te acclimatiseren aan vloeistof voordat u begint met opnemen, omgevingsomstandigheden (d.w.z. temperatuur, vochtigheid) en consistente licht- en opname-instellingen. Op het opnamepodium zijn er verschillende functies die de variabiliteit tussen platen helpen verminderen. Deze omvatten een geïntegreerde op een spoor gemonteerde camera en een helder veld podium dat het opnemen van video consistent maakt tussen platen, afscherming rond het podium die reflecties, verblinding en luchtbewegingen tijdens het opnemen voorkomt, en een robuust softwarepakket dat betrouwbaar wormen detecteert en handmatige correctie van tracks in video-nabewerking mogelijk maakt. In dit protocol worden video’s van een 35 mm plaat met wormen gedurende 1 minuut opgenomen en vervolgens verwerkt met behulp van het softwarepakket. Na verwerking zorgt handmatige correctie van tracks ervoor dat wormgedrag nauwkeurig wordt geregistreerd zonder storende trackingfouten. Gegevens over het aantal beurten en de duur van het spoor worden gebruikt om de bochten per minuut te bepalen als een definitieve uitlezing. Om reproduceerbaarheid te garanderen, worden gegevens verzameld over minimaal 3 onafhankelijke replicatie-experimenten, elk met 40-50 dieren gescoord, om een gecombineerd eindaantal dieren 120-150 te bereiken. Dit aantal is voldoende om kleine verschillen in zwemgedrag te onderscheiden van controlewormen. Sommige wormen hebben motorische tekorten die te ernstig zijn om te worden gevangen door zwemtests. Als de dieren bijvoorbeeld in een krul van een vloeibaar medium worden geplaatst in plaats van de verwachte thrashing-respons uit te voeren, zal deze test die bewegingen niet nauwkeurig registreren en kan een andere bewegingstest, zoals radiale voortbeweging, die motiliteitsdefecten beter vastleggen. Het meegeleverde protocol maakt gebruik van een in de handel verkrijgbaar beeldvormingssysteem (zie Tabel met materialen voor meer informatie), maar andere wormvolgsystemen kunnen een vergelijkbaar hulpprogramma bieden, waarvan sommige open source zijn12. Eerder gepubliceerde methoden beschrijven handmatige scoring van wormthrashing13. Hoewel de geautomatiseerde analyse een aantal statistieken voor elke individuele worm produceert, biedt de detectie van lichaamsbuigingen die wordt gemeten in thrashes per minuut, consistente resultaten tussen experimenten en volgt deze goed met conventionele scores van wormen met het oog.
The authors have nothing to disclose.
We bedanken de recensenten voor nuttige opmerkingen en suggesties. We bedanken Aleen Saxton, Brandon Henderson en Jade Stair voor hun uitstekende technische assistentie. We bedanken Brian Kraemer en Rebecca Kow voor hun hulp bij het ontwikkelen van deze testen. Dit materiaal is het resultaat van werk ondersteund met middelen en het gebruik van faciliteiten bij het VA Puget Sound Health Care System. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Verenigde Staten (VS) Department of Veterans Affairs (VA) Biomedical Laboratory Research and Development Service [Merit Review Grant #I01BX004044 aan N.F.L.]
C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | – | Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain |
Disposable pasteur pipets, borosilicate glass | VWR | 14673-010 | Glass pipet used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
Disposable petri dishes, 35x10mm | VWR | 10799-192 | Assay plates for WormLab Imaging System |
Disposable petri dishes, 60x15mm | VWR | 25384-090 | Stock plates for worms |
Disposable petri dishes, 100x15mm | VWR | 25384-302 | Standard radial locomotion assay plate |
Disposable petri dishes, 150x15mm | VWR | 25384-326 | Longer time frame radial locomotion assay plate |
Dissecting microscope | Leica | M80 | Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays |
Fine-tipped markers | VWR | 52877-810 | Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy. |
Flatbed Scanner | Amazon | Epson Perfection V850 | Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine |
ImageJ | NIH | – | Optional free software provided by the NIH – https://imagej.nih.gov/ij/ |
M9 buffer | VWR | IC113037012 | Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
NGM (Nematode Growth Medium) | VWR | 76347-412 | Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
OP50 bacteria | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Primary food source for C. elegans |
p1000 pipettor | VWR | 76207-552 | Pipettor, used in swimming assay |
p1000 tips | VWR | 83007-384 | Tips for pipettor, used in swimming assay |
Platinum wire, 0.2032mm diameter | VWR | BT136585-5M | Fine gauge platinum wire used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
Ruler | VWR | 56510-001 | Need to score radial locomotion assays |
WormLab Imaging System | MBF Bioscience | WormLab | The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system |