استهداف القناة القشرية الشوكية في الفئران الوليدية باستخدام ناقل فيروسي مزدوج باستخدام جراحة الدماغ والعمود الفقري المشتركة

في حين أن اصابات النخاع الشوكي نادرة الحدوث نسبيا بين الأطفال ، إلا أنها مؤلمة بشكل خاص وتسبب إعاقة دائمة تتطلب بصيرة لوجستية هائلة. علاوة على ذلك ، يتم تصنيف نسبة أعلى من اصابات النخاع الشوكي للأطفال على أنها عنق الرحم وكاملة مقارنة بالسكان البالغين ^1,2. السمة المميزة لأنواع الثدييات هي أن حديثي الولادة يتعافون بشكل ملحوظ من اصابات النخاع الشوكي بشكل أفضل من البالغين ، وهذا يوفر فرصة لتقييم آليات القيادة للتعافي في السكان الأصغر سنا³،^4،5. على الرغم من ذلك ، هناك عدد أقل من الدراسات متعددة الوسائط التي تتناول أبحاث القوارض حديثي الولادة والرضع ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الصعوبة الإضافية المتمثلة في استهداف مجموعات مختارة من الخلايا العصبية بدقة في المعالم التشريحية الأكثر إحكاما للحيوانات الأصغر سنا⁶. تركز هذه المقالة على الحقن المباشر للناقلات المرتبطة بالغدي التقدمي والرجعي عالي الكفاءة في الحبل الشوكي للفئران لتعديل المسارات الحركية الرئيسية مع تطبيق Cre-dependent-DREADDs ، مما يوسع نطاق دراسات التجديد متعدد الوسائط.

النواقل الفيروسية هي أدوات بيولوجية مهمة لها مجموعة واسعة من التطبيقات ، بما في ذلك إدخال المادة الوراثية لتحل محل الجينات المستهدفة ، وتنظيم بروتينات النمو ، وتتبع المشهد التشريحي للجهاز العصبي المركزي⁷،^8،9. تمت دراسة العديد من التفاصيل التشريحية للمسارات الحركية الشوكية باستخدام المقتفيات الكلاسيكية ، أي أمين ديكستران البيوتينيل. في حين أن المتتبعات التقليدية كانت مفيدة في اكتشاف التشريح العصبي ، إلا أنها لا تخلو من عيوبها: فهي تسمي المسارات بشكل عشوائي حتى لو تم حقنها بشكل صحيح ، وقد وجدت الدراسات أنها تمتصها المحاور التالفة¹⁰،^11،12. وبالتالي ، قد يؤدي ذلك إلى تفسيرات غير صحيحة في دراسات التجديد حيث يمكن الخلط بين المحاور المقطوعة وتجديد الألياف.

تستخدم الطريقة التالية نظام النواقل الفيروسية الثنائية الذي شاع مؤخرا في دراسات التشكيل ، مع ناقلين فيروسيين مختلفين في منطقتين منفصلتين من نفس الخلية العصبية^13,14. الأول هو ناقل يصيب محليا أجسام الخلايا العصبية الإسقاطية. والآخر هو ناقل رجعي يتم نقله من النهايات المحورية للخلايا العصبية البارزة (الشكل 1). يحمل المتجه الرجعي Cre recombinase ، ويشتمل المتجه المحلي على تسلسل “Cre-On” مزدوج الفلوكس الذي يتم فيه تشفير بروتين الفلورسنت (mCherry). يتم عكس جين التحوير الأصلي الذي يعبر عن كل من hM3Dq و mCherry بالنسبة إلى المروج ويحيط به موقعان LoxP (الشكل 2). وبالتالي ، يتم التعبير عن mCherry فقط في الخلايا العصبية الإسقاطية المتحولة بشكل مضاعف حيث يحفز Cre recombinase حدث إعادة التركيب بين مواقع LoxP ، مما يؤدي إلى قلب اتجاه جين التحوير إلى إطار القراءة المناسب والسماح بالتعبير عن كل من DREADD والبروتين الفلوري. بمجرد أن يكون جين التحوير الفيروسي في الاتجاه الصحيح ، وعند الاقتضاء ، يمكن ل DREADDs أن تحفز بشكل عابر التعديل العصبي من خلال ليجند محقون بشكل منفصل ، أي كلوزابين-N-oxide. تم تصميم البروتوكول لمصادقة أبحاث التعديل العصبي المستحث في حديثي الولادة ، حيث يتم حقن DREADD لتعديل CSTs بشكل انتقائي. يعمل النظام ثنائي الفيروسات كبوليصة تأمين ، مما يضمن أن كل خلية إيجابية DREADD يمكن تتبعها تحت مضان بدقة عالية للتحقق من صحة الحقن.

تساعد هذه الطريقة أيضا على سد الفجوة في أبحاث حديثي الولادة. تقدم اصابات النخاع الشوكي للأطفال تحدياتها ، ويجب أن تؤكد الأبحاث التي تحلل التجديد أو الإنبات أو اللدونة على الاختلافات بين حديثي الولادة والبالغين³،¹⁵،^16،17. من خلال تحسين الإجراء الجراحي وإجراء الدراسات التشريحية السابقة مع تلطيخ نيسل ، تم التحقق من صحة إحداثيات كل من حقن الجمجمة والعمود الفقري. كان الهدف هو توفير طريقة للحقن المزدوجة في الفئران حديثي الولادة مع زيادة الدقة والقدرة على البقاء.

بالنسبة للنموذج الحالي ، تم حقن الناقل المتقدم في أجسام الخلايا في القشرة الحركية الجسدية باستخدام bregma كمرجع^18,19. فيما يتعلق بحقن العمود الفقري ، تم حقن الناقل الرجعي في الصفيحة V-VII ، حيث توجد نهايات محور CST^20,21. هناك العديد من الأسئلة الأساسية الكامنة وراء كيفية تأثير نماذج معينة من الآفات على الحيوانات الأصغر سنا بشكل مختلف ، وكيف يختلف التعافي اللاحق عن الحيوان الأكبر سنا. توضح هذه الدراسة وسيلة قوية لدراسة إصابات عنق الرحم وإمكانية استعادة وظيفة الأطراف الأمامية في القوارض الوليدية. في المقابل ، تناولت غالبية الدراسات السابقة حركة التعافي بعد الإصابات القطنية أو الصدرية⁵،²²،^23،24. من خلال إقران الناقل الفيروسي المزدوج بتقنية الحقن الجديدة الموصوفة هنا ، يساعد هذا البروتوكول في التخفيف من بعض المشكلات (أي البقاء على قيد الحياة) التي قد تصيب تحقيقات القوارض الوليدية. هذه الطريقة قوية وعملية ومتعددة الاستخدامات: ستسمح الاختلافات الطفيفة في التقنية باستهداف مسارات مختلفة ، أي CST البطني ، CST الظهري ، والمسارات الظهرية الصاعدة.

بالنسبة لهذا النظام ، يتم حقن فيروس واحد يعمل محليا (على سبيل المثال ، AAV2) في منطقة أجسام الخلايا العصبية ذات الأهمية. يتم حقن فيروس ثان ينتقل بأثر رجعي ويتحكم في التعبير عن الفيروس المحلي في النهايات المحورية لتلك المجموعة العصبية. وبالتالي ، بحكم التعريف ، يتم تصنيف الخلايا العصبية القشرية الشوكية فقط. تم اختيار فيروس retroAAV-Cre مع محفز CMV نشط بشكل أساسي حيث يتم استخدام بلازميد المكوك لتوليد العديد من الأنماط المصلية AAV للتعبير المعتمد على Cre في عدة أنواع من الخلايا. بالنسبة للحقن القشرية ، تم اختيار AAV2 مع جين التحوير الذي يقوده المروج synapsin-1 للحد من أي تعبير عن الخلايا العصبية. نظرا لأن النظام الفيروسي 2 يعتمد بشكل أكبر على أصل وإنهاء السكان العصبيين ذوي الأهمية ، يمكن استخدام العديد من المروجين المختلفين ، إذا كان بإمكانهم دفع التعبير عن الجينات ذات الأهمية داخل السكان العصبيين محل الاهتمام. على سبيل المثال ، يمكن استبدال المروج العصبي المثير ، CamKII ، ب synapsin-1. بالإضافة إلى استخدام هذه الأنماط المصلية AAV ، يمكن أيضا تحقيق النقل الرجعي إلى غير ناضج ، وبدرجة أقل بكثير ، الخلايا العصبية الحركية القشرية الشوكية البالغة باستخدام فيروس lentivirus القابل للنقل الرجعي العالي (HiRet)²⁵. تستخدم فيروسات HiRet lentivirus بروتين سكري خيمري لداء الكلب / VSV لاستهداف الامتصاص عند المشبك العصبي للنقل الرجعي. جنبا إلى جنب مع مروج Tet-On ، يدعم هذا النظام الفيروسي 2 التعبير المحرض بطريقة تعتمد على الرجعية^26,27.

تدخل الفيروسات المرتجعة ناقلات في الفضاء المشبكي للخلية العصبية المستهدفة، مما يسمح بامتصاصها بواسطة محور الخلية ونقلها إلى جسم الخلية. في حين أن النواقل الفيروسية العدسية قد حققت نجاحا هائلا في السابق ، حيث وفرت تعبيرا طويل المدى في دراسات العلاج الجيني ، فقد تمحورت هذه الطريقة نحو النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي لعدة أسباب بسيطة^26,28: AAV أكثر اقتصادا وفعالية بالمثل ويمثل عبئا لوجستيا أقل ، نظرا لأنه يحتوي على مستوى أمان حيوي أقل 29,30,31,32 . في حين أن AAV2 ، النمط المصلي الأكثر استخداما ، يوضح نقلا قويا لمحاور CST ، قد يلاحظ الباحثون في المستقبل أن AAV1 يوفر بعض التنوع لأنه يصنف بشكل عابر ، وبالتالي يطرح العديد من التكرارات المحتملة في الدراسات المستقبلية³³. التكيف النهائي هو تشفير الفيروس الرجعي مع Cre-recombinase بحيث يمكن إدخال العديد من النواقل التقدمية في وقت واحد ، وبالتالي تقليل نفايات الفيروسات الداخلية غير الضرورية وزيادة احتمالية تعبير DREADDs في الاتجاه الصحيح.

في النهاية ، يوضح هذا البروتوكول الحقن المتزامن في القشرة والعمود الفقري العنقي ، مستهدفا على وجه التحديد أجسام الخلايا والأطراف المحورية للقناة القشرية الشوكية ، على التوالي. يظهر النقل عالي الدقة في القشرة الدماغية والحبل الشوكي. في حين أن البروتوكول الموصوف كان مثاليا لفئران Sprague Dawley التي يبلغ عمرها 5 أيام ، إلا أنه مناسب لأيام ما بعد الولادة من 4 إلى 10 مع تعديلات طفيفة على التخدير وإحداثيات التجسيم.