この合理化されたプロトコルは、組織の固定から、その場で蛍光を伴う微生物の染色まで、複雑な組織サンプル 中の 細菌を検出し、画像化するワークフローを詳述しています。
生体内のコンテキスト内での微生物の局在を測定することは、微生物叢と脊椎動物の腸との間の機能的関係を明らかにする上で不可欠なステップです。腸内微生物叢の空間的景観は、腸管粘液、納骨堂、折り目などの物理的特徴によって厳しく制御され、pH、酸素の入手可能性、免疫因子などの宿主制御特性の影響を受ける。これらの特性は、腸を安定的に植民地化するコメンサル微生物と病原体の能力を制限する。微生物群では、微生物の異なる微生物間の近距離相互作用と、微生物とその宿主との相互作用を決定します。これらの相互作用は、大規模な臓器機能と宿主の健康に影響を与えます。
このプロトコルは、細胞間の距離から臓器全体のスケールまでの腸内微生物叢空間組織の可視化を可能にする。この方法は、腸の構造と粘液の特性を維持しながら腸組織を固定することに基づいています。その後、固定サンプルを埋め込み、切り離し、染色して、蛍光を通して特定の細菌種 を ハイライトします。粘液および宿主細胞成分などの宿主特徴は、蛍光標識されたレクチンで標識される。最後に、染色された切片は、高倍率でタイルスキャンイメージングを利用した共焦点顕微鏡を使用して、ミクロンをセンチメートルの長さのスケールに橋渡しします。このタイプのイメージングは、動物モデルの腸管の切片やヒト組織の生検に適用して、健康と病気の腸内の微生物叢の生物地理学を決定することができる。
微生物の視覚化技術は、アントニー・ヴァン・レーウェンフックが顕微鏡を使って17世紀 に歯垢と便から細菌(「動物性」と呼ばれる)を観察した時に、微生物学そのものと同じくらい古い起源を持っています。それ以来、宿主微生物叢1に関連する細菌、真菌、ウイルスのコンソーシアムの空間的組織を可視化する技術が数多く開発されてきました。これらの微生物の局在化を解明することは、動物宿主内でのそれらの機能を決定するために不可欠である。細菌の生物地理学は、特定の場所(例えば上皮)、栄養基質、および特定の微生物が種間および王国間相互作用の基礎となる代謝産物の細菌産生を指示する可能性があるため、コメンサルおよび病原性分類において同様に重要である。
口腔、腸、肺など、いくつかの異なる身体部位で細菌と宿主組織を分離する重要な構造は、宿主上皮細胞への微生物転位を防ぎ、微生物叢の栄養資源として機能する宿主産生層である粘液である2,3,4.この障壁の違反や変化を特徴付けることが重要であり、シーケンシングだけでは得られない宿主微生物叢相互作用に対する機械主義的洞察につながる5,6,7。例えば、イメージングは、抗生物質暴露が粘液層および微生物叢組織7,8を破壊し、下剤が粘液を枯渇させ、免疫パラメータ5の大きな変化と相関する可能性があるという発見を可能にした。
このプロトコルは、ヨハンソンとハンソン9の仕事に基づいて構築された微生物叢と宿主組織(図1)を固定、染色、およびイメージングするための一般的な枠組みを概説する。このプロトコルは腸管のセクションのコンテキストでモデル化されるが、他の組織タイプに容易に適応することができる。このプロトコルは、実験動物またはヒト臨床サンプルの処理を可能にします。両方のタイプのサンプルを処理するためのノートが含まれています。ここで示した例では、宿主上皮と発光細菌は、4′、6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)染色、フルオレセイン(FITC)を用いた粘液、ウレックス・エウロペウス・アググルチンI(UEA-1)、およびFISHを使用する特異的なバクセクソンで同時に標識されています。FISHプローブは通常、高コピーの転写物を結合することから高いシグナルを確実にするために、分類の16S rRNA遺伝子に対して設計されています。
この例では、プローブは、ムリバクシアセ菌の細菌群の16S rRNAを標的とする(図2)。しかし、この染色は、適切な生物学的問題に対応するために、異なるFISHプローブおよび/またはレクチンで容易に置換されます。以前に検証されたFISHプローブは、rRNA標的オリゴヌクレオチドプローブのオンラインリソースであるProbeBase10またはリボソームRNAデータベースであるSILVA11で見つけることができます。新しいプローブの設計では、リーダーは HiPR-FISH8 や Oligominer12 などの新しいパイプラインを参照できます。このプロトコルを使用して、腸管腔内の細菌の密な充填と消化管全体の腸粘液の異なる特徴を観察することが可能です。ここで説明するワークフローは、宿主環境の空間的な文脈における微生物叢の定量的分析を可能にする。
上述のプロトコルは、宿主微生物叢界を可視化する再現可能な方法を提供する。これらのアッセイは、FISH標識18 の最適化から粘液保存およびimaging9に始まるプロトコル開発からかなり恩恵を受けています。固定と埋め込みもサンプルの有用なストレージを提供します。さらに、パラフィン浸潤カセットは、サンプルが完全に固定され、不活性であるとして、制限なしに郵送することができます。
有意性と代替方法
FISHと粘液染色の組み合わせは、特定の組織の場所での微生物叢組成の分析と、個々の細菌と宿主との相互作用を可能にする。マイクロビオタ内の特定の部位の分析を含む代替技術は、通常、シーケンシング19と結合されたレーザー捕捉マイクロ解剖の場合のような、これらの相互作用の単細胞性を探索することができない。しかし、シーケンシングベースの技術は、16S rRNAプローブよりも細かいレベルで、より広く微生物叢の遺伝的構成を捕捉することができるという利点を有する。
提示されるプロトコルの落とし穴は、宿主に関連してマイクロビオタの単回スナップショットを提供することです。生きた動物におけるリアルタイムイメージングでは、深部組織における蛍光シグナルの取得を容易にする特別なイメージング技術が必要です(例えば、生体内2光子顕微鏡および光シート蛍光顕微鏡20,21)。これらの方法では、モデル生物は、そのエンベロープ20に結合する分子で染色された細菌または蛍光タンパク質21を収容する遺伝子組み換え細菌でコロニー形成される。後者の場合、蛍光タンパク質の成熟は、ほとんどの標準的な蛍光タンパク質が光を放出するために酸素を必要とするので、重要な問題です。したがって、少なくともnan好気環境(酸素のナノモル濃度)を有するモデル生物が必要とされ、好気性ゼブラフィッシュgut21などが必要である。
このプロトコルでは、メタノールカルノイは、パラホルムアルデヒドまたはホルマリンの代わりに固定剤として使用されます。これにより、処理中の粘液層の水分補給、脱水、崩壊を防止し、粘液の厚さの正確な測定を容易にします。メタカーンの固定化とパラフィン埋め込みは分野の標準となっているが、粘液保存を最適化するための異なる固定剤および埋め込み技術が検討されており、樹脂がパラフィン埋め込みよりも優れている可能性が示されている。パラフィン埋め込みおよびメタカーン固定に対するもう一つの重要な制限は、蛍光タンパク質の消失であり、これは、代替固定剤(例えば、ホルマリンまたはパラホルムアルデヒド(PFA))または改変埋め込み技術23を用いて回避できる。各固定剤には利点と欠点があり、固定性の選択はイメージングの優先順位に依存します。PFAとメタカーンのどちらでも生物学的複製が固定され、両方のサンプルから画像が得られた場合、イメージングモダリティを組み合わせることができます。
FISHは、特異的抗Muc2C3ウサギポリクローナル抗体を有する単離された例において免疫蛍光と組み合わされている。これらの結果は、他のMuc2抗体と共に広く再現されておらず、FISH免疫蛍光の組み合わせの成功において抗体の選択が重要であり得る可能性があることを示している。特定の抗体に対する抗体染色が成功する条件は、FISH染色の保持を許可しない場合があります。
トラブルシューティング
このプロトコルでは、サンプルの収集、断面化、および染色は、イメージングアーティファクトの作成を防ぐための重要な手順を表します。例えば、採取時および埋め込み前に組織を押すと、微生物叢の誤局在化を招き、粘液の品質に影響を与える可能性があります。もう一つの重要な考慮事項は、小腸の比較的空の部分と遠位結腸内のペレットなど、単一のカセットで非常に異なる厚さのセグメントを組み合わせることを避けることです。異なる厚さはイメージングの困難につながる:埋め込んだ後、1つのセグメントの特定の深さでの横断断面は、他のセグメントのイメージングのために間違った深さにある可能性があります(例えば、ルーメンは組織ごとに異なる深さになります)(図1B、C および 図3A)。さらに、画像化動物モデル便ペレットについては、腹膜24に包んでもよい。この技術では、新たに分離された腹陰の小さな部分が便の周りに穏やかに折り畳まれ、プロトコルで概説されている洗浄段階の間にペレットの構造を保存します。
内容物を含む動物組織の処理とは異なり、ヒト腸管サンプルをイメージングすることはいくつかの課題を提示する。具体的には、腸内腔内の内容物および粘膜内層は、腸内生検または切除処置の前に通常行われる大腸内視鏡検査腸製剤によって破壊される可能性が高い。さらに、生検が収集されるとき、腸内含量がない場合に特定の特徴(例えば、内腔と粘膜の)の同定に役立つ組織の向きに注意することが有用である。3%寒天および/または寒天で事前埋め込み:ゼラチン混合物は、組織の極性を維持するのに有用であり得る25;しかし、文献に記載されているように寒天の脱水と断方に問題があり、処理時間を変更する必要があります。
良いFISH染色を達成するための重要な側面は、特定のFISHプローブのホルムアミド濃度を調整することから来る。Formamideは、FISHプローブのターゲットへのハイブリダイゼーションストリンジェンシーを制御します。a)適切なホルムアミド濃度が所定のコミュニティを染色するために選択されていること、およびb)適切なホルムアミド濃度が利用されているプローブの組み合わせに対しても可能であることを確認することが重要です。mathFISH(http://mathfish.cee.wisc.edu/)などのウェブサイトは、所定のプローブの適切なホルムアミド濃度を計算するのに役立ちます。適切なホルムアミド濃度に関する情報がない場合、このプロトコルは0%および10%ホルムアミドで試験することができる。
埋め込まれたサンプルを切り離すには、ブロックに浅く切り込みすぎると、明るい内容のない絨毛/納骨堂の断面図が得られるため、ブロックを十分な深さまで切る必要があります(図3A)。最適なFISH信号のために切り離した直後にサンプルを染色し、新鮮なDAPI(または-20°Cに保存されたDAPI)を使用してバックグラウンドの問題を解決します(図3C)。1ヶ月以上前の部分のFISH染色は、汚れが悪い/矛盾する可能性があります。
組織またはカバースリップがスライドに対して完全に平坦でない場合、サンプルはタイルスキャン内のすべての位置に焦点を合わせることができない可能性があります(図3B)。.は、無駄な労力と潜在的な光の漂白につながります。これは、すべての位置が焦点を合わせられたことを確認した、より小さなタイルスキャンを取ることによって解決できます。鈍い刃で切り離す場合、粘液や光度の内容物の剥離にもつながり、イメージング中に大きな暗い領域として表示されます。最後に、ハイブリダイゼーション工程中の溶液または気泡の蒸発は、組織におけるFISHプローブの不均一な染色につながる可能性があります。
FISHプローブ結合の効率に影響を与えるもう1つの重要なパラメータは、異なるプローブ間の競争です。FISHプローブが細菌に標識していることを確認するのに役立つチェックは、FISHプローブからのシグナルの共局在化をDAPIで調べることです(図2C,D)。複数のrRNAプローブを使用する必要があるサンプルでは、ハイブリダイゼーション温度、プローブ濃度、およびホルムアミドなどのパラメータを調整することが重要になり、プローブが正しい種に効率的に結合していることを確認することが重要になります18。
イメージングに関する注意事項
魚染色細菌は、共焦点顕微鏡と少なくとも40倍の倍率の目的を使用して最もよく視覚化されます。63倍の倍率は単細胞レベルでの画像細菌に好ましいが、40倍倍倍はデジタルズームを最大化するか、または超解像系を採用することによっても使用することができる。超分解能を備えたシステムは、個々の細菌細胞の細胞下解像度を提供する可能性もあります。低倍率目標は、細菌の局在および粘液の厚さの一般的な感覚を得るために利用され得る。
高いダイナミックレンジは、上皮の非常に明るい核と発光細菌の比較的弱い信号からDAPI信号の広い範囲をキャプチャするのに役立ちますので、8ビット画像の代わりに16ビット画像を取得することも強くお勧めします。上記のイメージング設定を使用する以外に、イメージングの重要な考慮事項は、フルオロフォアの選択です。細菌タイプ間の最良の分離のために、使用されるフルオロフォアが励起および発光スペクトルで重ならないようにしてください(線形アンミックスを行う能力を持つシステム上でイメージングしない限り)。さらに、プローブは、追加のコミュニティメンバーを識別するために、組み合わせて使用することができます(例えば、家族固有のプローブと属特異的プローブの組み合わせ)。線形非混合または未検証プローブを使用する場合、純粋な培養物8,14でのFISH染色の精度とレベルをテストすることが不可欠です。
画像が収集されると、BacSpace26、HiPR-FISH8、およびその他のセグメンテーションツール27などのホスト・マイクロビオタ・インターフェースの定量分析に複数のツールが使用できます。BacSpaceは、組織と発光成分のセグメンテーションと、images26からの植物材料の除去を可能にするMATLABソフトウェアです。プログラムはまた、2Dの粘液の厚さの分析と異なるチャネル26のピクセル距離に基づいて空間分布の定量化を提供します。逆に、HiPR-FISH画像解析ソフトウェアは、FISH染色細胞8のセグメンテーションを可能にする。最後に、in vitro実験27用に最適化された他の細菌セグメンテーションツールもこのアプリケーションに適応することができる。
結論
その場で イメージングは、他のコミュニティメンバーと食事、粘液、および宿主上皮陰窩によって作成された様々な微小環境のコンテキストで個々の微生物分類の定量分析を可能にする。生物間の相互作用は、宿主関連微生物系の生物学を決定し、健康に影響を及ぼす摂動中のこれらの構造の変化の本質的な分析を提供する。特に、上記のプロトコルを介して その場所で 微生物叢を画像化する能力は、動物宿主に関連して微生物叢の生物地理学に信じられないほどの窓を提供する。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、クリステン・アール博士の貴重な技術開発、トラブルシューティングの助けを求めるアンバー・ハン、原稿の批判的なレビューに対するジェン・グエン博士とディアナ・ペパン博士、顕微鏡アクセスを提供してくれたブリティッシュコロンビア大学のヘシャム・ソリマン博士とロッシ研究所に感謝したいと考えています。著者らは、CIHRチームグラント:カナダマイクロバイオームイニシアチブ2(C.T.)、クローン病と大腸炎カナダ(C.T.とK.M.N.)、CIFAR(C.T.とK.M.N.)、マイケル・スミス健康研究学者賞(C.T.へ)、ウェストン財団:ウェストン・ファミリー・マイクロバイオーム・イニシアチブ(C.T.T.)、ポール・アレン・アクト・アワードからの支援を認めています。
Aluminum foil | |||
Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
Ethanol, anhydrous, molecular grade | — | — | |
FISH probes | |||
FISH hybridization solution | — | — | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
FISH washing buffer | — | — | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
Forceps | |||
Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
Fumehood | |||
Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Kimwipes | |||
Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
Microtome | for sectioning | ||
Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
Sodium chloride | Fisher | S271 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |