Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence <em>In Situ</em> Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Katharine M. Ng; Carolina Tropini

doi:10.3791/62646

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualisatie van darmmicrobiota-gastheerinteracties via fluorescentie in situ hybridisatie, lectinekleuring en beeldvorming

Published: July 09, 2021

doi:

10.3791/62646

Katharine M. Ng^1,2, Carolina Tropini^1,2,3

¹School of Biomedical Engineering,University of British Columbia, ²Department of Microbiology and Immunology,University of British Columbia, ³Humans and the Microbiome Program,Canadian Institute for Advanced Research (CIFAR)

Özet

Dit gestroomlijnde protocol beschrijft een workflow om bacteriën in complexe weefselmonsters te detecteren en in beeld te brengen, van het fixeren van het weefsel tot het kleuren van microben met fluorescerende in situ hybridisatie.

Abstract

Het meten van de lokalisatie van microben binnen hun in vivo context is een essentiële stap in het onthullen van de functionele relaties tussen de microbiota en de gewervelde darm. Het ruimtelijke landschap van de darmmicrobiota wordt strak gecontroleerd door fysieke kenmerken – darmslijm, crypten en plooien – en wordt beïnvloed door gastheergestuurde eigenschappen zoals pH, zuurstofbeschikbaarheid en immuunfactoren. Deze eigenschappen beperken het vermogen van zowel commensale microben als pathogenen om de darm stabiel te koloniseren. Op micronschaal bepaalt microbiële organisatie de interacties op korte afstand tussen verschillende microben en de interacties tussen microben en hun gastheer. Deze interacties beïnvloeden vervolgens de grootschalige orgaanfunctie en de gezondheid van de gastheer.

Dit protocol maakt de visualisatie van de ruimtelijke organisatie van de darmmicrobiota mogelijk van afstanden tussen cellen tot orgaanbrede schalen. De methode is gebaseerd op het fixeren van darmweefsels met behoud van darmstructuur en slijmeigenschappen. De vaste monsters worden vervolgens ingebed, gesneden en gekleurd om specifieke bacteriesoorten te markeren door fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). Gastheerkenmerken, zoals slijm en gastheercelcomponenten, zijn gelabeld met fluorescerend gelabelde lectines. Ten slotte worden de gekleurde secties afgebeeld met behulp van een confocale microscoop met behulp van tegelscan-beeldvorming bij hoge vergroting om de micron tot centimeterlengte schalen te overbruggen. Dit type beeldvorming kan worden toegepast op darmsecties uit diermodellen en biopten uit menselijke weefsels om de biogeografie van de microbiota in de darm in gezondheid en ziekte te bepalen.

Introduction

Microbiële visualisatietechnieken hebben een oorsprong die zo oud is als de microbiologie zelf, toen Antonie Van Leeuwenhoek in de ^17e eeuw met zijn microscoop bacteriën (die hij ‘animalcules’ noemde) uit tandplak en ontlasting observeerde. Sindsdien zijn tal van technieken ontwikkeld om de ruimtelijke organisatie van het consortium van bacteriën, schimmels en virussen die leven geassocieerd met een gastheer – de microbiota1 – te visualiseren. Het ophelderen van de lokalisatie van deze microben is essentieel voor het bepalen van hun functie binnen hun dierlijke gastheer. De biogeografie van bacteriën is belangrijk in zowel commensale als pathogene taxa, omdat de nabijheid van specifieke locaties (bijvoorbeeld het epitheel), voedingssubstraten en specifieke microben de bacteriële productie van metabolieten die ten grondslag liggen aan interspecies en inter-koninkrijksinteracties kunnen dicteren.

Een belangrijke structuur die bacteriën en de gastheerweefsels scheidt op verschillende ongelijksoortige lichaamslocaties, zoals de mondholte, darm of long, is het slijm – een door de gastheer geproduceerde laag die zowel microbiële translocatie op de gastheerepitheelcellen voorkomt als dient als een voedingsbron voor de microbiota2,3,4 . Het karakteriseren van breuken en veranderingen in deze barrière is van cruciaal belang, wat leidt tot mechanistisch inzicht in gastheer-microbiota-interacties die niet zouden worden verkregen door alleen sequencing5,6,7. Beeldvorming maakte bijvoorbeeld de ontdekking mogelijk dat blootstelling aan antibiotica de slijmlaag en microbiota-organisatie kan ^verstoren7,8, en dat laxeermiddelen het slijm kunnen uitputten, wat correleert met grote veranderingen in ^{immuunparameters5}.

Dit protocol schetst een algemeen kader voor het fixeren, kleuren en afbeelden van de microbiota en het gastheerweefsel (figuur 1), gebaseerd op het werk van Johansson en Hansson9. Hoewel dit protocol is gemodelleerd in de context van darmsecties, kan het gemakkelijk worden aangepast aan andere weefseltypen. Dit protocol maakt de verwerking van proefdier- of menselijke klinische monsters mogelijk; opmerkingen voor het verwerken van beide soorten monsters zijn opgenomen. In het hier gepresenteerde voorbeeld zijn het gastheerepitheel en de luminale bacteriën tegelijkertijd gelabeld met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) kleuring, slijm met het fluoresceïne (FITC)-geconjugeerde lectine, Ulex europaeus agglutinine I (UEA-1) en een specifiek bacterieel taxon met fish. FISH-sondes zijn meestal ontworpen tegen de 16S-rRNA-genen van een taxon om ervoor te zorgen dat het hoge signaal een transcript met een hoge kopie bindt.

In dit voorbeeld richt de sonde zich op het 16S-rRNA van de muribaculaceae bacteriële familie (figuur 2). De vlekken worden echter gemakkelijk vervangen door verschillende FISH-sondes en / of lectines om de juiste biologische vraag te accommoderen. Eerder gevalideerde FISH-probes zijn te vinden op ^ProbeBase10, een online bron voor rRNA-gerichte oligonucleotide probes, of op ^SILVA11, een ribosomale RNA-database. Voor het ontwerp van nieuwe sondes kan de lezer verwijzen naar nieuwe pijpleidingen zoals HiPR-FISH8 of Oligominer12. Met behulp van dit protocol is het mogelijk om de nauwe verpakking van bacteriën in het darmlumen en de verschillende kenmerken van darmslijm in het spijsverteringskanaal te observeren. De hier beschreven workflow maakt de kwantitatieve analyse van de microbiota in de ruimtelijke context van zijn gastheeromgeving mogelijk.

Protocol

Alle dierproeven en weefselverzameling beschreven in dit protocol werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care (CCAC) en werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Universiteit van British Columbia. Kiemvrije Zwitserse Webster muizen werden gebruikt. Alle dieren waren 8-10 weken oud, beide geslachten werden gebruikt en alle muizen werden samen gehuisvest met ten minste twee muizen per kooi. Dieren werden geëuthanaseerd met behulp van koolstofdioxide met secundaire cervicale dislocatie of hartpunctie. 1. Het ontwerpen van een beeldvormingsexperiment: overwegingen en monsterverzameling FISH probe ontwerp Als er een geschikte FISH-sonde bestaat, selecteert u een reeds bestaande gepubliceerde sonde die een sterk signaal in gelabelde cellen vertoont in vergelijking met de achtergrond. Valideer nieuwe sondes in vitro om hun efficiëntie van binding aan vaste monsters van de doelbacteriën en off-target binding aan andere bacteriën te bepalen. Controleer alle 16S FISH-sondes die moeten worden gebruikt tegen 16S-sequenties van het doelorganisme of tegen 16S rRNA-sequencing van de te analyseren monsters om ervoor te zorgen dat het verwachte aandeel positieve matches aanwezig is en dat probes niet niet-specifiek binden aan andere microbiota-leden. Lijn de FISH-sondes uit tegen sequenties over de volledige lengte of ampliconsequentievarianten met behulp van een hulpmiddel, zoals Clustal Omega13, om de potentiële binding van sondes en hun doelen te evalueren. Test naast in silico-testen de nauwkeurigheid en het niveau van FISH-kleuring van niet-gevalideerde sondes op zuivere culturen8,14. OPMERKING: Bij het kleuren van meerdere leden van de gemeenschap kunnen sondes combinatorisch worden gebruikt (bijvoorbeeld de combinatie van een familiespecifieke sonde en een geslachtsspecifieke sonde) als de gebruikte fluoroforen elkaar niet overlappen in excitatie- en emissiespectra (tenzij beeldvorming op een systeem met de mogelijkheid om lineaire ontmenging uit te voeren). Bovendien kan specificiteit worden aangetoond door specificiteitscontroles/gecodeerde sondes op te nemen of door concurrentie met niet-fluorescerende sondes. Soorten monsters en weefselverzameling Snijd met behulp van scherpe en schone hulpmiddelen darmsegmenten van gnotobiotische Zwitserse Webster-muizen voor beeldvorming. Minimaliseer het storen van het monster zoveel mogelijk en behandel de secties aan hun randen om te voorkomen dat het beeldvormingsgebied wordt beïnvloed. Bevestig het monster zo snel mogelijk na de dissectie om degradatie te voorkomen.OPMERKING: Voor dierstudies hebben intacte, niet-geflushte darmsecties de voorkeur; het membraan helpt de luminale en mucosale organisatie intact te houden. Reinig gereedschappen door ze af te vegen met 70% ethanol tussen monsters en locaties. Verkrijg ten minste drie biologische replicaties per darmsectie / biopsielocatie, waarbij u ervoor zorgt dat consistente darmlocaties worden bemonsterd, omdat de slijm- en darmarchitectuur en de microbiota op verschillende locaties aanzienlijk veranderen. 2. Fixatie en infiltratie van weefselmonsters Fixatie Bereid vers methacarn in een compatibele container met de volgende verhoudingen: 60% absolute methanol, 30% chloroform en 10% ijsazijn. Doseer elk van deze chemicaliën in een zuurkast. Kies een container die kan worden geventileerd door het deksel open te breken. Aangezien methacarn niet compatibel is met polystyreen, bereidt u het in een polyethyleen container, met behulp van glazen gegradueerde cilinders / serologische pipetten voor het chloroform en glaciale azijnzuur.OPMERKING: Tijdens het mengen worden dampen geproduceerd en kunnen er druk ontstaan in de container. Het is raadzaam om de container relatief goed gesloten te houden zodra deze uit de zuurkast is verwijderd als er niet actief monsters worden toegevoegd. Chloroform is giftig; niet inademen, slikken of absorberen via de huid. Methanol is giftig en licht ontvlambaar; niet inademen, slikken of absorberen via de huid. Ijsazijn is ontvlambaar en zeer corrosief voor de huid en de ogen. Sluit na het doseren de container, draai om te mengen en ontlucht vervolgens; herhaal dit totdat de ontgassing is gestopt (en de druk zich niet meer merkbaar opbouwt onder het deksel).OPMERKING: Gooi methacarn niet weg in afvoeren; inzamelen en verwijderen als gevaarlijk chemisch afval volgens de institutionele richtlijnen. Gebruik een potlood voor het labelen van histologiecassettes, omdat er veel peninkten loskomen in de methacarnoplossing. Plaats de darmsecties in histologiecassettes door voorzichtig een rand van het weefsel vast te houden met een pincet. Sluit de cassette en dompel hem volledig onder in verse methacarnoplossing. Zorg ervoor dat de oplossing niet ouder is dan een paar uur na het onderdompelen van de cassettes. Voor klinische monsters die worden verzameld in een klinische suite zonder toegang tot een zuurkast, gebruikt u een polyethyleen opslagcontainer met een klep die in het deksel is gesneden en die de doorgang van de histologiecassettes mogelijk maakt. Plak deze klep dicht wanneer er geen monsters worden doorgegeven om te voorkomen dat giftige dampen ontsnappen.OPMERKING: Het is belangrijk om afplaktape te gebruiken om te voorkomen dat lijm op de container oplost – sommige soorten tape (bijv. Plastic verpakkingstape) houden mogelijk niet goed bestand tegen de methacarndampen. Fixeer monsters gedurende minimaal 3 uur en maximaal twee weken.OPMERKING: Dikkere monsters kunnen fixatietijden langer dan 3 uur vereisen. Fixatietijd kan worden gekozen om gelijktijdige paraffine-infiltratieverwerking mogelijk te maken voor cassettes die in verschillende methacarnoplossingen zijn gefixeerd (bijvoorbeeld om gelijktijdig paraffine-infiltratie uit te voeren op groepen monsters die gedurende twee weken zijn verzameld en gefixeerd). Paraffine-infiltratie en -inbedding Doe de paraffine in een hittebestendige container en smelt deze een nacht in een oven op 60 °C. Omdat paraffinekorrels meer ruimte innemen voordat ze smelten, moet u ervoor zorgen dat er voldoende paraffine wordt gesmolten om alle cassettes te bedekken.OPMERKING: De temperatuur mag niet hoger zijn dan 60 °C, omdat dit aanleiding kan geven tot artefacten. Was het weefsel door de vloeistof in de juiste afvalcontainer uit te gieten en onmiddellijk te vervangen door de volgende chemicaliën. Incubeer in absolute methanol gedurende 30 min. Herhaal dit eenmaal. Incubeer in absolute ethanol gedurende 20 min. Herhaal dit eenmaal. Incubeer in xylenen gedurende 15 min. Herhaal dit eenmaal. Wissel de wasbeurten snel om en zorg ervoor dat de cassettes niet drogen. Zorg ervoor dat elke was de cassettes in het bekerglas of de container volledig bedekt.OPMERKING: Xylenen zijn ontvlambaar en bij inademing kunnen de dampen het centrale zenuwstelsel onderdrukken met mogelijke neurologische gevolgen op lange termijn bij blootstelling aan hoge concentraties (>200 ppm). Behandel xylenen alleen binnen een zuurkast. Aangezien xylenen gevaarlijk zijn, moet u ervoor zorgen dat u de minimale hoeveelheid gebruikt die nodig is om de histologische cassettes te bedekken. Oriënteer tijdens het inbedden de darmsegmenten parallel aan de lengte van de cassette (in tegenstelling tot rechtop) met behulp van een pincet om longitudinale, dwarsdoorsneden te bieden in plaats van dwarsdoorsnede donuts om meer potentieel monstergebied te bieden voor kwantitatieve beeldvorming (figuur 1B). Open de cassettes iets (~ 1-2 cm of 0,5 inch) om de paraffine binnen te laten zonder de weefselsegmenten te verliezen. Gebruik dubbele handschoenen voor deze stap of pincet om oververhitting of lichte verbranding van vingers te voorkomen. Dompel de cassettes onder in de container met gesmolten paraffine en plaats de container terug in de oven van 60 °C. Zorg ervoor dat de cassettes gevuld zijn met paraffine en dat er geen grote luchtbellen achterblijven. Na incubatie gedurende 2 uur bij 60 °C haalt u de container uit de oven. Verwijder met een tang voorzichtig de cassettes en leg ze afzonderlijk op een stuk aluminiumfolie om af te koelen. Bewaar ze op kamertemperatuur totdat ze klaar zijn voor inbedding en sectie. Snijd de paraffineblokken met een microtoom, snijd diep genoeg in het blok dat luminale inhoud wordt blootgesteld, waardoor een longitudinale sectie van villi en / of crypten mogelijk is naast luminale inhoud en slijm. Zorg ervoor dat u de messen vervangt, omdat fecaal materiaal het mes snel dof maakt in vergelijking met weefsel. Snijd secties tot 4 μm dikte voor optimale scherpte van de beelden. Breng de secties over naar gewone ongecoate dia’s. Voor FISH-kleuring, kleur de darmsecties zo snel mogelijk (d.w.z. binnen een paar weken na sectie) om een sterk FISH-signaal te bereiken. Bij het weglaten van FISH-kleuring kan lectine + DAPI-kleuring worden uitgevoerd op minder verse (d.w.z. maanden oude) monsters zonder significant signaalverlies. 3. Kleuring van bacteriën en gastheer kenmerken Voorbereiding Verwarm de oven op 60 °C. Verwarm een lege Coplin-pot voor en voldoende volume om de glazen glijden in de pot twee keer te bedekken met xylenen in een glazen fles, waarbij u ervoor zorgt dat u rond het deksel parafilmt om verdamping van de xylenen te voorkomen. Laat de temperatuur van de xylenen 60 °C bereiken.OPMERKING: Een standaard Coplin-pot past op 8 dia’s en de dia’s kunnen worden bedekt met ongeveer 50 ml vloeistof (kan variëren tussen 40 en 60 ml, afhankelijk van het merk). Xyleenvervangers zijn minder giftig en zijn met succes gebruikt door andere groepen voor de ontwasstap (stap 3.2)8,9. Als er een aparte oven beschikbaar is, verwarm dan een hybridisatieoven voor tot 50 °C. Anders kan deze stap worden uitgevoerd met dezelfde oven die wordt gebruikt voor het bakken van de dia’s na stap 3.2.3. Bereid de FISH-hybridisatieoplossing voor: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0,9 M NaCl; 0,01 – 0,1%9 (w/v) natriumdodecylsulfaat (SDS) in nucleasevrij water. Voeg indien nodig 5-50% (v/v) formamide toe. Verwarm deze hybridisatieoplossing voor bij 50 °C tijdens de-paraffinisatie.OPMERKING: Formamide is een amide dat werkt als een teratogeen; behandel formamide met handschoenen en een bril. In kleine doses en bij blootstelling aan ogen, huid of slijmvliezen is het irriterend. In grote hoeveelheden kan formamidedamp medische interventie vereisen. Formamide kan op 100% bewaard worden in een -20 °C vriezer. De dia’s voorbereiden op kleuring: deparaffinisatie Plaats de dia’s in de Coplin-pot, zorg ervoor dat de secties niet in contact komen met andere dia’s of de pot, en bak de dia’s gedurende 10 minuten op 60 °C. Vul in de zuurkast de Coplin-pot met voorverwarmde xylenen uit de oven, zorg ervoor dat u niet direct op de monsters giet en de weefsels mogelijk losmaakt. Plaats de Coplin pot terug in de oven van 60 °C. Laat de fles met de resterende xylenen in de zuurkast zitten. Giet de gebruikte xylenen in een goede afvalcontainer voor verwijdering, zorg ervoor dat de weefselsecties op de glazen dia’s niet worden verstoord en gebruik een tang om te voorkomen dat de dia’s uit de Coplin-pot vallen. Vul de Coplin-pot aan met de resterende xylenen en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in de zuurkast. Incubeer de secties in 99,5% ethanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na deze incubatiestap de dia’s uit de Coplin-pot, veeg de achterkant van de dia’s af op een laboratoriumdoekje of papieren handdoek en droog kort aan de lucht totdat de ethanoldruppels verdwenen zijn.OPMERKING: Het afvegen van de achterkant van de dia’s zorgt voor een betere visualisatie van de droogvoortgang. Bacteriële kleuring met FISH Gebruik een vloeistofblokker of PAP-pen om het gebied van vloeistofuitzetting te beperken door het gebied van elk weefselgedeelte te omcirkelen. Zorg ervoor dat de inkt niet in contact komt met de sectie zelf. Maak een cirkel zo dicht mogelijk bij elk weefselgedeelte zonder contact te maken met het weefsel om het oppervlak te minimaliseren dat door de hybridisatieoplossing moet worden bedekt. Bereid de hybridisatieoplossing voor: voeg voor elke 50 μL voorverwarmde hybridisatieoplossing 0,5 μg sonde toe (bijv. 0,5 μL van 1 μg/μL sonde). Pipetteer de hybridisatieoplossing op de secties op de dia (~ 20 μL / sectie, afhankelijk van de sectie / cirkelgrootte). Bescherm de hybridisatieoplossing en de dia’s vanaf dit punt tegen licht tijdens incubatiestappen en opslag. Zorg ervoor dat het gebruikte volume vloeistof het hele gedeelte bedekt bij het bedekken met een flexibele plastic afdekplaat. Incubeer de glijbaan in een vochtige kamer om verdamping te verminderen. Maak een vochtige kamer met een pipetpuntdoos met doekjes of papieren handdoeken aan de onderkant die zijn gedrenkt met overtollige hybridisatieoplossing of fosfaatbuffered saline (PBS) om vochtigheid te bieden. Incubeer de secties bij 45-50 °C, afhankelijk van de sondeset, gedurende >3 uur. Warm de FISH wasbuffer op: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0,9 M NaCl tot 50 °C tijdens de incubatietijd. Bereid voldoende wasbuffer voor om de dia’s in de Coplin-pot te bedekken. Verwijder de plastic hoesjes; incubeer de glaasjes in FISH wasbuffer in een Coplin pot, beide voorverwarmd tot 50 °C. Plaats de Coplin pot terug in de 50 °C oven gedurende 10-20 min. Voor dikke monsters verwijdert u de dekmantels in de Coplin-pot door de buffer toe te voegen en de dekvellen voorzichtig te ontwrichten om te voorkomen dat de plak wordt besmeurd. Kleuring van het slijm en gastheer kenmerken Bereid een algemene DNA/slijmtellersvlek voor in PBS: laatste 10 μg/ml DAPI + 40 μg/ml slijmvlek UEA-1. Bereid voldoende tegendraad voor om de vlekken te bedekken bij afwezigheid van een coverslip om te voorkomen dat weefsel wordt beschadigd met extra coverslips.OPMERKING: Het afdekken van de vlekken bij afwezigheid van een coverslip vereist grotere volumes dan de 20 μL die in 3.3.2 wordt gebruikt. Voor secties van gemiddelde grootte (diameter ~ 10 mm) is 200 μL voldoende om één plek te bedekken; test dit volume vooraf op een dummy slide. Verwijder de FISH wasbuffer en vervang deze door PBS in de Coplin pot. Direct na het bijvullen van de Coplin pot met PBS, decanteer de PBS. Verwijder de glaasjes uit de pot en pipetteer de counterstain bovenop de sectie terwijl u ervoor zorgt dat u het weefsel niet raakt met de pipetpunt. Bedek het hele gedeelte met een bubbel. Incubeer bij 4 °C gedurende 45 minuten in het donker. Was de vlekken 3 keer snel met verse PBS: terwijl je de dia’s op hun plaats houdt met een pincet, giet je de PBS uit in een gootsteen en vul je deze onmiddellijk bij met verse PBS. Door de achterkant van de dia’s tegen een doekje of papieren handdoekje te vegen, laat het grootste deel van de PBS van de secties verdampen, geholpen door een vacuümleiding die is aangesloten op een pipetpunt. Nogmaals, vermijd het aanraken van het gedeelte met de pipetpunt. Monteer de secties met behulp van een montagemedium (zonder DAPI) en laat het instellen bij kamertemperatuur bedekt met glazen afdekplaten, zodat de afdekplaten vlak zijn en er geen luchtbellen in het montagemedium zitten. Bevestig de coverslips op de dia door langs de randen van de coverslip te schilderen met heldere nagellak, waarbij u ervoor zorgt dat u uit de buurt van de rand van de dia blijft om ervoor te zorgen dat de dia tijdens het fotograferen vlak in de microscoopplaathouder zit. Bewaar de dia’s bij 4 °C in het donker gedurende enkele weken voordat de fluorescentie is uitgeput. 4. Beeldvorming en beeldanalyse Visualiseren van de vlekken Selecteer een gebied van het weefsel dat zowel weefsel als lumen bevat om de microbiota-host interface in beeld te brengen. Voor kwantitatieve beeldvorming van slijmdikte en luminale biogeografie, selecteert u gezichtsvelden waar de plakjes van de epitheliale villi en /of crypten longitudinaal zijn en niet dwarsdoorsnede. Vermijd gebieden met grote openingen tussen het slijm en het epitheel om te voorkomen dat artefacten worden doorsneden. Lokaliseer weefsel en corrigeer het brandpuntsvlak, met behulp van het DAPI-signaal voor het lokaliseren en scherpstellen om fotobleken van het FISH-fluorescentiesignaal te voorkomen. Pas de beeldinstellingen aan. Om de bacteriële DAPI-vlek te visualiseren, verhoogt u het laservermogen en wint u tot het punt waarop het DAPI-signaal van epitheelcellen oververzadigd of “uitgeblazen” is.OPMERKING: Oververzadig niet overmatig, omdat dit zal leiden tot fotobleaching en visuele artefacten in de kernen die niet kunnen worden hersteld. Gebruik voor alle andere kanalen de minimale hoeveelheid laservermogen die een duidelijk signaal boven de achtergrond geeft en pas op dat u niet oververzadigt.OPMERKING: Dit is vooral belangrijk bij het uitvoeren van tegelscans, omdat fotobleaching problematisch zal zijn wanneer de overlap tussen tegels wordt afgebeeld. Gebruik 40x of hoger vergroting om individuele bacteriën in beeld te brengen. Verkrijg de afbeeldingen. Verkrijg tegelscans om kwantitatieve gegevens te verkrijgen over de dikte van het slijm en de ruimtelijke verdeling van microben in het lumen. Zorg voor 15% overlap tussen de tegels en controleer op lichtafval/ongelijke verlichting, die kan worden verergerd door <1x zoom. Let er bij het opzetten van een tegelscan goed op of het weefsel in alle tegels scherp is, omdat wazige / onscherpe beelden niet kunnen worden geanalyseerd (figuur 3B). Minimaliseer indien mogelijk het aantal tegels dat nodig is om een bepaalde lengte van het epitheel in beeld te brengen door het scangebied zo te draaien dat het epitheel en de slijmlaag evenwijdig aan de tegel zijn en niet onder een hoek. Zoek anders een deel van het epitheel dat parallel of loodrecht op het beeldvormingsgebied staat om een vergelijkbaar effect te bereiken.

Representative Results

Om de lokalisatie van specifieke darmcommensale bacteriën in de darm van de muis te onderzoeken, werden kiemvrije Zwitserse Webster-muizen gebruikt die waren gekoloniseerd met individuele bacteriële isolaten in deze studie. Voor dit experiment waren de bacteriesoorten die werden gelabeld i) een menselijk isolaat van de Muribaculaceae-familie5, Muribaculum intestinale, een overvloedige en veel voorkomende familie van bacteriën in de muizenmicrobiota15, evenals ii) Bacteroides thetaiotaomicron, een genetisch handelbare en veel voorkomende darmbacterie. Na twee weken van evenwicht werden de muizen geëuthanaseerd en een segment van de dikke darm met een fecale pellet werd gesneden en gefixeerd in vers bereid methacarn. Na twee dagen fixatie werden de secties gedehydrateerd door verwerking door methanol, ethanol en xylenen, geïnfiltreerd met paraffine, ingebed en vervolgens gesneden tot luminale plakjes van 4 μm. Deze monsters werden vervolgens gekleurd met een FISH-sonde (3’Cy3-tagged) specifiek voor het Muribaculum-isolaat, ontworpen met behulp van Oligominer-software12, en gecontroleerd op secundaire en tertiaire structuur en minimale niet-specifieke binding met behulp van NuPACK en mathFISH16,17. De monsters werden ook bestreden met het Rhodamine-gebonden lectine UEA-1 (dat gefucosyleerde glycanen in slijm kleurt) en DAPI. De bevlekte secties werden afgebeeld met behulp van een 40x olie objectief en superresolutie module. Figuur 1: Workflow van visualisatie van de microbiota-host interface in de darm. (A) Een geïllustreerde workflow voor de pijplijn. (B) De twee sectievlakken leveren ofwel dwarsdoorsneden (bij voorkeur voor deze pijpleiding) of dwarsdoorsnede “donuts” op. (C) Het insluiten van weefsels van zeer verschillende diktes kan resulteren in plakjes die alleen optimaal zijn voor het ene of het andere weefsel. Afkortingen: FISH = fluorescentie in situ hybridisatie; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Beeldvorming van de dikke darm toont de lokalisatie van Muribaculum intestinale ten opzichte van slijm in een gnotobiotisch muismodel. Secties werden gekleurd met DAPI (blauw), Muribaculaceae FISH probe (rood) en UEA-1 (groen). (A) Distale dikke darm van muis mono-gekoloniseerd met Muribaculum intestinale en (B) distale colon van muis bi-gekoloniseerd met Muribaculum intestinale en Bacteroides thetaiotaomicron. Schaalbalk = 20 μm. (C en D) Cy3-FISH (links), DAPI (midden) en gecombineerde Cy3-FISH + DAPI-kanalen voor luminale inzetgedeelten van respectievelijk (A) en (B). Schaalbalk = 5 μm. In (A) en (C) zijn alle bacterievormige en bacteriegrote DAPI-signalen gelabeld met Cy3 (enkele pijlpunten) en in (B) en (D) zijn er naast deze Cy3- en DAPI-dubbelpositieve cellen (enkele pijlpunten) DAPI-gekleurde bacteriële cellen die Cy3-negatief zijn (dubbele pijlpunten), zoals verwacht voor mono- en bi-kolonisatietoestanden. Met uitzondering van langere filamenteuze bacteriën zijn grotere (>4 μm lang) DAPI-positieve structuren (stompe pijlen) plantaardig materiaal of kernen van gastheercellen. Afkortingen: FISH = fluorescentie in situ hybridisatie; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Veel voorkomende problemen. (A) Ondiepe sectie zal geen luminale plakjes van de darm opleveren. (Links) Een darmsegment dat is doorsneden op een diepte die zowel zicht biedt op het lumen als longitudinale weergaven van het epitheel. (Rechts) Een darmsegment dat te ondiep is doorsneden, waardoor alleen doorsneden van crypten en geen constante slijmlaag of bacteriën zichtbaar zijn. (B) Ongelijke dekking van weefsel/coverslip kan leiden tot wazige en ongelijk verlichte tegelscans. Er werd een tile-scan opgezet met posities die onscherp waren (rechterbovenhoek). (C) Voorbeeld van normale achtergrond (links) en hoge achtergrond (rechts). In dit voorbeeld is voor de DAPI-signaaltoon het signaal afkomstig van het epitheel, buiten de kernen. Alle schaalbalken = 20 μm. Afkorting: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het hierboven beschreven protocol biedt een reproduceerbare methode om de gastheer-microbiota-interface te visualiseren. Deze testen hebben aanzienlijk geprofiteerd van protocolontwikkeling, van de optimalisatie van ^{FISH-etikettering18} tot slijmconservering en ^{beeldvorming9}. Fixatie en inbedding bieden ook nuttige opslag van monsters; bovendien kunnen paraffine-geïnfiltreerde cassettes zonder enige beperking worden verzonden, omdat de monsters volledig vast en inert zijn.

Significantie en alternatieve methoden
De combinatie van FISH en slijmkleuring maakt de analyse van de samenstelling van de microbiota op specifieke weefsellocaties en de interactie tussen individuele bacteriën en de gastheer mogelijk. Alternatieve technieken waarbij specifieke plaatsen in de microbiota worden geanalyseerd, zijn meestal niet in staat om de eencellige aard van deze interacties te onderzoeken, zoals in het geval van laservangstmicrodissectie in combinatie met ^sequencing19. Op sequencing gebaseerde technieken hebben echter het voordeel dat ze de genetische samenstelling van de microbiota op een fijner niveau en breder dan 16S-rRNA-sondes kunnen vastleggen.

Een valkuil van het gepresenteerde protocol is dat het een eenmalige momentopname biedt van de microbiota in relatie tot de gastheer. Voor real-time beeldvorming bij levende dieren zijn speciale beeldvormingstechnieken nodig om de verwerving van een fluorescentiesignaal in diep weefsel te vergemakkelijken (bijv. intravitale tweefotonenmicroscopie en lichtbladfluorescentiemicroscopie20,21). In deze methoden wordt het modelorganisme gekoloniseerd met bacteriën die gekleurd zijn met moleculen die zich binden aan hun ^envelop20 of genetisch gemodificeerde bacteriën die fluorescerende eiwitten ^herbergen21. In het laatste geval is de rijping van fluorescentie-eiwitten een belangrijk probleem, omdat de meeste standaard fluorescerende eiwitten zuurstof nodig hebben om licht uit te stralen. Daarom zijn modelorganismen nodig die ten minste nanaerobe omgevingen (nanomolaire zuurstofconcentratie) hebben, zoals de aerobe zebravis ^gut21.

In dit protocol wordt methanol-Carnoy gebruikt als fixeermiddel in plaats van paraformaldehyde of formaline omdat het geen water bevat. Dit voorkomt hydratatie, uitdroging en instorting van de slijmlaag tijdens de verwerking en vergemakkelijkt nauwkeurige metingen van de slijmdikte. Hoewel methacarnfixatie en paraffine-inbedding een standaard in het veld zijn geworden, zijn verschillende fixatieven en inbeddingstechnieken onderzocht om het behoud van slijm te ^{optimaliseren9,22}, waarbij sommige studies aangeven dat harsen superieur kunnen zijn aan paraffine-inbedding22. Een andere belangrijke beperking voor paraffine-inbedding en methacarnfixatie is het verlies van fluorescentie van fluorescentie van fluorescentie, dat kan worden vermeden door alternatieve fixatieven (bijv. Formaline of paraformaldehyde (PFA)) of gemodificeerde inbeddingstechnieken ^{te gebruiken23}. Elk fixatief heeft voor- en nadelen en de keuze van het fixatief hangt af van de beeldvormingsprioriteiten. Beeldvormingsmodaliteiten kunnen worden gecombineerd als biologische replicaties worden gefixeerd in PFA en methacarn en beelden worden verkregen uit beide monsters.

FISH is in geïsoleerde gevallen gecombineerd met immunofluorescentie met specifieke anti-Muc2C3 konijnenpolyklonale ^{antilichamen9,24}. Deze resultaten zijn niet op grote schaal gereproduceerd met andere Muc2-antilichamen, wat aangeeft dat de keuze van antilichamen van cruciaal belang kan zijn voor het succes van de FISH-immunofluorescentiecombinatie. De voorwaarden voor succesvolle antilichaamkleuring voor een bepaald antilichaam staan mogelijk geen retentie van FISH-kleuring toe.

Probleemoplossing
In dit protocol vertegenwoordigen monsterverzameling, sectie en kleuring kritieke stappen om het maken van beeldartefacten te voorkomen. Het indrukken van het weefsel bij het verzamelen en vóór inbedding kan bijvoorbeeld leiden tot mislokalisatie van de microbiota en de slijmkwaliteit beïnvloeden. Een andere belangrijke overweging is om te voorkomen dat segmenten van zeer verschillende diktes in een enkele cassette worden gecombineerd, zoals een relatief leeg stuk van de dunne darm en een pellet in de distale dikke darm. De verschillende diktes leiden tot problemen bij beeldvorming: na inbedding kan de transversale sectie op een specifieke diepte voor het ene segment zich op de verkeerde diepte bevinden voor beeldvorming voor het andere segment (het lumen zal bijvoorbeeld op verschillende diepten voor elk weefsel zijn) (figuur 1B, C tr figuur 3A). Bovendien kunnen ze voor het afbeelden van ontlastingspellets van diermodellen worden ingepakt in peritoneaal ^membraan24. Bij deze techniek wordt een klein deel van vers geïsoleerd peritoneum voorzichtig rond de ontlasting gevouwen en behoudt de structuur van de pellet tijdens de wasstappen die in het protocol worden beschreven.

In tegenstelling tot het verwerken van dierlijk weefsel met inhoud, biedt het afbeelden van menselijke darmmonsters enkele uitdagingen. In het bijzonder zullen luminale inhoud en mucosale voering waarschijnlijk worden verstoord door de colonoscopie darmpreparaat die gewoonlijk wordt uitgevoerd vóór darmbiopten of resectieprocedures. Bovendien, wanneer biopsieën worden verzameld, is het nuttig om de weefseloriëntatie op te merken om te helpen bij de identificatie van specifieke kenmerken (bijv. Lumen versus submucosa) bij afwezigheid van darminhoud. Vooraf inbedding met 3% agar en/of agar:gelatinemengsels kan nuttig zijn bij het handhaven van de ^{weefselpolariteit25}; er zijn echter problemen met de uitdroging en sectie van agar, zoals gemeld in de literatuur, en verwerkingstijden moeten mogelijk worden gewijzigd.

Een belangrijk aspect voor het bereiken van goede FISH-kleuring komt van het aanpassen van de formamideconcentratie voor specifieke FISH-sondes. Formamide zal de hybridisatie strengheid van FISH-sondes naar hun doelen regelen. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat a) de juiste formamideconcentratie wordt gekozen voor het kleuren van een bepaalde gemeenschap, en b) dat een geschikte formamideconcentratie zelfs mogelijk is voor de sondecombinatie die wordt gebruikt – dit kan de optimale sondekeuze beïnvloeden bij het gebruik van meerdere sondes. Websites zoals mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) kunnen helpen bij het berekenen van de juiste formamideconcentraties voor een bepaalde sonde. Bij gebrek aan informatie over geschikte formamideconcentraties kan dit protocol worden getest met 0% en 10% formamide.

Het doorsnijden van de ingebedde monsters vereist het snijden van het blok tot een voldoende diepte om luminale plakjes te verkrijgen, omdat te ondiep in een blok snijden zal resulteren in een dwarsdoorsnede van de villi / crypten zonder luminale inhoud (figuur 3A). Kleur de monsters kort na het snijden voor een optimaal FISH-signaal en gebruik verse DAPI (of DAPI opgeslagen bij -20 °C) om achtergrondproblemen op te lossen (figuur 3C). VISkleuring van secties die meer dan een maand oud zijn, kan resulteren in slechtere / inconsistente vlekken.

Als het weefsel of de afdekplaat niet perfect vlak is ten opzichte van de dia, is het mogelijk dat het monster niet op elke positie binnen een tegelscan scherp is (figuur 3B), wat leidt tot verspilde moeite en mogelijk fotobleeken. Dit kan worden opgelost door kleinere tegelscans te maken waarbij alle posities zijn geverifieerd om scherp te zijn. Secties met doffe messen kunnen ook leiden tot het loslaten van het slijm en de luminale inhoud, die tijdens het afbeelden als grote donkere gebieden verschijnen. Ten slotte kan de verdamping van de oplossing of bellen tijdens de hybridisatiestap leiden tot ongelijke kleuring van de FISH-sondes in het weefsel.

Een andere kritische parameter die de efficiëntie van de FISH-sondebinding beïnvloedt, is de concurrentie tussen verschillende sondes. Een nuttige controle om te controleren of de FISH-sonde bacteriën labelt, is om de colokalisatie van het signaal van de FISH-sonde met DAPI te onderzoeken (figuur 2C, D). In monsters die het gebruik van meerdere rRNA-sondes vereisen, wordt het aanpassen van parameters zoals hybridisatietemperatuur, sondeconcentratie en formamide van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de sondes efficiënt aan de juiste soort ^binden18.

Opmerkingen over beeldvorming
FISH-gekleurde bacteriën kunnen het beste worden gevisualiseerd met behulp van een confocale microscoop en een objectief van ten minste 40x vergroting. Hoewel 63x vergroting de voorkeur heeft boven beeldbacteriën op het niveau van één cel, kan 40x vergroting ook worden gebruikt door de digitale zoom te maximaliseren of een superresolutiesysteem te gebruiken. Systemen die zijn uitgerust met superresolutiemogelijkheden kunnen ook subcellulaire resolutie van individuele bacteriële cellen bieden. Lagere vergrotingsdoelstellingen kunnen worden gebruikt om een algemeen gevoel van bacteriële lokalisatie en slijmdikte te krijgen.

Het verkrijgen van 16-bits afbeeldingen in plaats van 8-bits afbeeldingen wordt ook ten zeerste aanbevolen, omdat het hogere dynamische bereik zal helpen om het brede bereik van het DAPI-signaal van de extreem heldere kernen van het epitheel en het relatief zwakke signaal van luminale bacteriën vast te leggen. Afgezien van het gebruik van de hierboven beschreven beeldvormingsopstelling, is een belangrijke beeldvormingsoverweging de keuze van fluoroforen. Voor de beste scheiding tussen bacterietypen moet u ervoor zorgen dat de gebruikte fluoroforen elkaar niet overlappen in excitatie- en emissiespectra (tenzij beeldvorming op een systeem met de mogelijkheid om lineaire ontmenging uit te voeren). Bovendien kunnen sondes in combinatie worden gebruikt (bijvoorbeeld de combinatie van een familiespecifieke sonde en een geslachtsspecifieke sonde) om extra leden van de gemeenschap te identificeren. Bij gebruik van lineaire niet-gemengde of niet-gevalideerde sondes is het essentieel om de nauwkeurigheid en het niveau van FISH-kleuring op zuivere culturen te ^testen8,14.

Zodra de beelden zijn verzameld, zijn er meerdere tools beschikbaar voor de kwantitatieve analyse van de host-microbiota-interface, zoals ^BacSpace26, HiPR-FISH8 en andere segmentatietools27. BacSpace is een MATLAB-software die de segmentatie van het weefsel en de luminale componenten en de verwijdering van plantmateriaal uit afbeeldingen mogelijk ^maakt26. Het programma biedt ook analyse van slijmdikte in 2D en kwantificering van ruimtelijke verdeling op basis van pixelafstanden in verschillende ^kanalen26. Omgekeerd maakt de HiPR-FISH Image Analysis-software de segmentatie van FISH-gekleurde ^{cellen8 mogelijk}. Ten slotte kunnen ook andere bacteriële segmentatietools die zijn geoptimaliseerd voor in vitro ^{experimenten27} worden aangepast aan deze toepassing.

Conclusie
In situ beeldvorming maakt de kwantitatieve analyse van individuele microbiële taxa mogelijk in de context van andere leden van de gemeenschap en de verschillende micro-omgevingen gecreëerd door dieet, slijm en gastheer epitheliale crypten. De interactie tussen organismen dicteert de biologie van gastheer-geassocieerde microbiële systemen en biedt een essentiële analyse van verandering in deze structuren tijdens verstoring die implicaties heeft voor de gezondheid. Met name het vermogen om de microbiota in situ in beeld te brengen via het hierboven beschreven protocol biedt een ongelooflijk venster op de biogeografie van de microbiota in relatie tot de dierlijke gastheer.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen Dr. Kristen Earle bedanken voor de onschatbare ontwikkeling van de techniek, Amber Hann voor hulp bij het oplossen van problemen, Dr. Jen Nguyen en Deanna Pepin voor kritische beoordeling van het manuscript, en Dr. Hesham Soliman en het Rossi-lab aan de Universiteit van British Columbia voor het bieden van microscooptoegang. De auteurs erkennen de steun van CIHR Team Grant: Canadian Microbiome Initiative 2 (C.T.), Crohn’s and Colitis Canada (aan C.T. en K.M.N.), CIFAR (aan C.T. en K.M.N.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (aan C.T.), de Weston Foundation: Weston Family Microbiome Initiative (aan C.T.), Paul Allen Distinguished Investigator Award (aan C.T.).

Materials

Aluminum foil
Chloroform	Fisher	C298-500	Toxic
Coplin jar	Fisher	08-813E
Cover glass, 22 × 22 mm, no #1	VWR	CA48366-227-1
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Resuspended to 5 mg/mL
Empty pipette tip box(es)			To melt paraffin
Ethanol, anhydrous, molecular grade	—	—
FISH probes
FISH hybridization solution	—	—	20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide
FISH washing buffer	—	—	20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl
Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin	Vector Laboratories	FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled)	UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts.
Forceps
Formamide	Sigma-Aldrich	F9037
Fumehood
Glacial Acetic Acid	Fisher	A38-212	Corrosive and flammable
HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm	Sigma Aldrich	GBL722222	for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes
Methanol	Fisher	A412	Toxic and flammable
Microtome			for sectioning
Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL	Fisher	14-955-117A	Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal.
Nail Polish	Electron Microscopy Sciences	72180	Any nail polish should work
Oven			Necessary range: 45-60 °C
Paraffin: Leica Paraplast	Leica	39601006
PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution)	Fisher	BP3991	Dilute to 1x for protocol
Sodium chloride	Fisher	S271
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free	Invitrogen	AM9820
Tissue-Loc HistoScreen Cassettes	Thermo Scientific	CA83009-999
Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2663-1L
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Water, nuclease-free	Fisher	BP2484100
Xylenes	Fisher	X3P-1GAL	Toxic and flammable

Referanslar

Tropini, C., Earle, K. A., Huang, K. C., Sonnenburg, J. L. The gut microbiome: connecting spatial organization to function. Cell Host and Microbe. 21 (4), 433-442 (2017).
Hansson, G. C., Johansson, M. E. V. The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria. Gut Microbes. 1 (1), 51-54 (2010).
Johansson, M. E. V., et al. Normalization of host intestinal mucus layers requires long-term microbial colonization. Cell Host and Microbe. 18 (5), 582-592 (2015).
Jakobsson, H. E., et al. The composition of the gut microbiota shapes the colon mucus barrier. EMBO Reports. 16 (2), 164-177 (2015).
Tropini, C., et al. Transient osmotic perturbation causes long-term alteration to the aut microbiota. Cell. 173 (7), 1742-1754 (2018).
Desai, M. S., et al. A dietary fiber-deprived gut microbiota degrades the colonic mucus barrier and enhances pathogen susceptibility. Cell. 167 (5), 1339-1353 (2016).
Ng, K. M., et al. Recovery of the gut microbiota after antibiotics depends on host diet, community context, and environmental reservoirs. Cell Host and Microbe. 26 (5), 650-665 (2019).
Shi, H., et al. Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. Nature. 588 (7839), 676-681 (2020).
Johansson, M. E. V., Hansson, G. C. Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH. Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).
Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. ProbeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: New features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (1), 586-589 (2016).
Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (1), 590-596 (2013).
Beliveau, B. J., et al. OligoMiner provides a rapid, flexible environment for the design of genome-scale oligonucleotide in situ hybridization probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2183-2192 (2018).
Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47 (1), 636-641 (2019).
Welch, J. L. M., Hasegawa, Y., McNulty, N. P., Gordon, J. I., Borisy, G. G. Spatial organization of a model 15-member human gut microbiota established in gnotobiotic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (43), 9105-9114 (2017).
Lagkouvardos, I., et al. Sequence and cultivation study of Muribaculaceae reveals novel species, host preference, and functional potential of this yet undescribed family. Microbiome. 7 (1), 28 (2019).
Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. MathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization. Applied and Environmental Microbiology. 77 (3), 1118-1122 (2011).
Huber, D., Voith von Voithenberg, L., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
Wang, Y., et al. Laser capture microdissection and metagenomic analysis of intact mucosa-associated microbial communities of human colon. Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (6), 1333-1342 (2010).
Geva-Zatorsky, N., et al. In vivo imaging and tracking of host–microbiota interactions via metabolic labeling of gut anaerobic bacteria. Nature medicine. 21 (9), 1091-1100 (2015).
Jemielita, M., et al. Spatial and temporal features of the growth of a bacterial species colonizing the zebrafish gut. mBio. 5 (6), 01751 (2014).
Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome. PLoS ONE. 12 (11), 0188257 (2017).
Zhanmu, O., et al. Maintenance of fluorescence during paraffin embedding of fluorescent protein-labeled specimens. Frontiers in Neuroscience. 13, 752 (2019).
Bergstrom, K., et al. Proximal colon-derived O-glycosylated mucus encapsulates and modulates the microbiota. Science. 370 (6515), 467-472 (2020).
Jones, M. V., Calabresi, P. A. Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing. BioTechniques. 42 (5), 569-570 (2007).
Earle, K. A., et al. Quantitative imaging of gut microbiota spatial organization. Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).
Jeckel, H., Drescher, K. Advances and opportunities in image analysis of bacterial cells and communities. FEMS Microbiology Reviews. , (2020).

Etiketler

Gut Microbiota Host-associated Microbes Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)Lectin Staining Imaging Host-microbiome Interface Methacarn Fixation Paraffin Embedding Intestinal Sections Visualization

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Ng, K. M., Tropini, C. Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging. J. Vis. Exp. (173), e62646, doi:10.3791/62646 (2021).