시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

이 프로토콜에 설명된 모든 동물 실험 및 조직 수집은 캐나다 동물 관리 위원회(CCAC) 지침에 따라 수행되었으며 브리티시 컬럼비아 대학의 동물 관리 위원회의 승인을 받았습니다. 세균이 없는 스위스 웹스터 마우스가 사용되었습니다. 모든 동물은 8-10 주 나이, 남녀 모두 사용 되었고, 모든 쥐는 케이지 당 적어도 2 마리의 마우스와 함께 공동 수용 되었다. 동물은 이차 자궁 경부 탈구 또는 심장 천자를 가진 이산화탄소를 사용하여 안락사되었습니다. 1. 이미징 실험 설계: 고려 사항 및 샘플 수집 FISH 프로브 설계 적절한 FISH 프로브가 있는 경우 배경에 비해 레이블이 부착된 셀에 강한 신호를 표시하는 기존 게시된 프로브를 선택합니다. 시험관 내의 새로운 프로브를 검증하여 대상 박테리아의 고정 된 샘플에 결합하고 다른 박테리아에 결합하는 오프 타겟에 결합하는 효율성을 결정합니다. 대상 유기체로부터의 16S 서열 또는 샘플로부터의 16S rRNA 시퀀싱에 대해 모두 사용되는 모든 16S FISH 프로브를 확인하여 양성 일치의 예상 비율이 존재하고 프로브가 다른 미생물 군수에 비특이적으로 결합하지 않도록 분석한다. Clustal Omega13과 같은 도구를 사용하여 FISH 프로브를 전체 길이 서열 또는 앰플리시온 서열 변형에 맞게 정렬하여 프로브와 대상의 잠재적 인 결합을 평가합니다. 실리코 테스트 외에도 순수한 배양에 대한 검증되지 않은 프로브의 정확성과 물고기 염색 수준을 테스트합니다8,14. 참고: 여러 커뮤니티 구성원을 염색할 때, 사용되는 형광이 흥분 및 방출 스펙트럼에서 겹치지 않는 경우(예: 가족별 프로브와 속별 프로브의 조합)를 조합하여 사용할 수 있습니다(선형 혼합 해제를 수행할 수 있는 시스템을 이미징하지 않는 한). 또한 특이성 제어/스크램블 프로브를 포함하거나 비형광 프로브와의 경쟁에 의해 특이성이 입증될 수 있다. 샘플 유형 및 조직 수집 선명하고 깨끗한 도구를 사용하여 이미징을 위해 gnotobiotic 스위스 웹스터 마우스에서 장 세그먼트를 잘라냅니다. 샘플을 가능한 한 많이 방해최소화하고 가장자리별로 섹션을 처리하여 이미징 영역에 영향을 주지 않도록 합니다. 분해를 방지하기 위해 해부 후 가능한 한 빨리 샘플을 수정합니다.참고: 동물 연구의 경우, 그대로, 플러시되지 않은 장 섹션이 바람직하다; 멤브레인은 발광 및 점막 조직을 그대로 유지하는 데 도움이됩니다. 샘플과 사이트 사이에 70% 에탄올로 닦아 공구를 청소하십시오. 점액 및 장 아키텍처뿐만 아니라 미생물이 다른 위치에서 현저하게 변화함에 따라 장 내 섹션 /생검 위치 당 적어도 3 개의 생물학적 복제를 얻을 수 있습니다. 2. 조직 샘플 고정 및 침투 고정 60% 절대 메탄올, 30% 클로로폼, 10% 빙하 아세트산 등 호환 되는 용기에 신선한 메타칸을 준비합니다. 연기 후드에 이러한 화학 물질의 각각을 분배. 뚜껑을 열어 환기할 수 있는 용기를 선택합니다. 메타카른은 폴리스티렌과 호환되지 않기 때문에, 클로로폼과 빙하 아세트산을 위해 유리 졸업 실린더 / 세로지스틱 파이프를 사용하여 폴리에틸렌 용기에서 준비하십시오.참고: 혼합 하는 동안, 연기 생산 되 고 용기 안에 구축 압력을 일으킬 수 있습니다. 샘플이 적극적으로 첨가되지 않는 경우 연기 후드에서 제거한 후 용기를 비교적 단단히 닫는 것이 좋습니다. 클로로폼은 독성이 있습니다. 피부를 흡입하거나 삼키거나 흡수하지 마십시오. 메탄올은 독성이 높고 인화성이 높습니다. 피부를 흡입하거나 삼키거나 흡수하지 마십시오. 빙하 아세트산은 인화성이며 피부와 눈에 부식성이 높습니다. 디스펜싱 후, 용기를 닫고, 소용돌이를 섞은 다음 환기하십시오. 오프 가스가 멈출 때까지 반복하십시오 (그리고 압력은 더 이상 뚜껑 아래에 현저하게 증가하지 않습니다).참고 : 배수구에서 메타칸을 처분하지 마십시오. 기관 지침에 따라 유해 화학 폐기물을 수거하고 폐기합니다. 많은 펜 잉크가 메타칸 용액에서 벗겨지므로 연약카세트에 라벨을 붙이세요. 핀셋으로 조직의 가장자리를 섬세하게 잡고 조직학 카세트에 장 섹션을 배치합니다. 카세트를 닫고 신선한 메타칸 용액에 완전히 담가 두세요. 카세트가 침수될 때 솔루션이 몇 시간 이상 오래되지 않았는지 확인합니다. 연기 후드에 접근하지 않고 임상 스위트에서 수집될 임상 샘플의 경우, 연골 카세트의 통과를 허용하는 뚜껑으로 플랩이 자른 폴리에틸렌 저장 용기를 사용하십시오. 독성 연기의 이스케이프를 방지하기 위해 샘플을 통과하지 않을 때이 플랩이 닫혀 테이프.참고: 마스킹 테이프를 사용하여 용기에 접착제가 용해되는 것을 방지하는 것이 중요합니다- 일부 유형의 테이프(예: 플라스틱 포장 테이프)는 메타칸 연기를 잘 유지하지 못할 수 있습니다. 최소 3시간 및 최대 2주 동안 샘플을 수정합니다.참고: 두꺼운 샘플은 3시간 이상 고정 시간이 필요할 수 있습니다. 고정 시간은 다른 메타칸 솔루션에 고정된 카세트에 대한 동시 파라핀 침투 처리를 가능하게 하도록 선택될 수 있다(예를 들어, 2주 동안 수집및 고정된 샘플 그룹에 파라핀 침투를 동시에 수행). 파라핀 침투 및 포함 파라핀을 내열 용기에 넣고 하룻밤 사이에 60°C의 오븐에서 녹입니다. 파라핀 펠릿이 녹기 전에 더 많은 공간을 차지하므로 모든 카세트를 덮기 위해 충분한 파라핀이 녹아 있는지 확인하십시오.참고: 아티팩트를 발생시킬 수 있으므로 온도가 60°C 이상이어야 합니다. 적절한 폐기물 리셉터클에 액체를 붓고 다음 화학 물질로 즉시 교체하여 조직을 세척하십시오. 절대 메탄올에서 30분 동안 배양하십시오. 절대 에탄올에서 20분 동안 배양하십시오. 15분 동안 자일렌으로 배양하십시오. 카세트를 건조시키지 않도록 주의하여 세서스를 빠르게 교환하십시오. 각 세척이 비커 또는 용기의 카세트를 완전히 덮는지 확인합니다.참고: Xylenes는 인화성이며 흡입하면 고농도 (>200 ppm)에 노출되면 잠재적 인 장기 신경 학적 결과로 중추 신경계를 우울하게 할 수 있습니다. 연기 후드 내에서만 자일렌을 처리하십시오. 자일렌은 위험하므로 조직학적 카세트를 커버하는 데 필요한 최소 금액을 사용하십시오. 포함 하는 동안, 내장 세그먼트카세트의 길이에 평행 (똑바로 반대) 정량적 이미징에 대 한 더 많은 잠재적인 샘플 영역을 제공 하기 위해 단면 도넛 대신 세로, 횡단 섹션을 제공 하는 핀셋을 사용 하 여 (똑바로 반대) 카세트(~1-2cm 또는 0.5인치)를 약간 열어 파라핀이 조직 세그먼트를 잃지 않고 들어갈 수 있도록 합니다. 손가락의 과열 또는 가벼운 연소를 방지하기 위해이 단계 또는 핀셋에 이중 장갑을 사용합니다. 녹은 파라핀 용기에 카세트를 잠수하고 닫고 용기를 60°C 오븐에 다시 넣습니다. 카세트가 파라핀으로 채워지고 큰 기포가 남아 있지 않도록 하십시오. 60 °C에서 2 시간 동안 인큐베이션 후 오븐에서 용기를 제거하십시오. 집게를 사용하여 카세트를 조심스럽게 제거하고 냉각하기 위해 알루미늄 호일 조각에 개별적으로 놓습니다. 포함 및 단면에 대한 준비가 될 때까지 실온에서 보관하십시오. 미세 절름발이를 사용하여 파라핀 블록을 절제하여 발광 내용이 노출되는 블록깊숙이 충분히 깊게 분리하여 발광 내용 및 점액 외에도 비리 및/또는 토굴의 세로 섹션을 가능하게 합니다. 대변 물질이 조직에 비해 블레이드를 빠르게 무디게하기 때문에 블레이드를 교체하십시오. 면부분을 두께4μm로 잘라 이미지의 최적의 선명도를 제공합니다. 섹션을 코팅되지 않은 일반 슬라이드로 전송합니다. FISH 염색의 경우, 강한 FISH 신호를 달성하기 위해 가능한 한 빨리 장 섹션을 얼룩지게합니다 (즉, 단면의 몇 주 이내에). FISH 염색을 생략하는 경우, 렉틴 + DAPI 염색은 신호의 상당한 손실없이 덜 신선한 (즉, 개월 된) 샘플에서 수행 할 수 있습니다. 3. 박테리아 염색 및 호스트 기능 준비 오븐을 60°C로 가열합니다. 빈 코플린 항아리와 유리 병에 자일렌으로 항아리의 유리 슬라이드를 두 번 덮을 만큼 충분한 부피를 미리 데우고, 자일렌의 증발을 방지하기 위해 뚜껑 주변의 파라필름을 주의하십시오. xylenes의 온도가 60 °C에 도달하도록 허용합니다.참고: 표준 코플린 항아리는 8개의 슬라이드에 적합하며 슬라이드는 약 50mL의 액체로 덮을 수 있습니다(브랜드에 따라 40~60mL 정도 다를 수 있음). 자일렌 대체품은 독성이 적고 다른 그룹에서 왁싱 해제 단계(단계 3.2)8,9에 성공적으로 사용되어 왔다. 별도의 오븐을 사용할 수 있는 경우 혼성화 오븐을 50°C로 미리 데워보시면 미리 데워보실 수 있습니다. 그렇지 않으면, 이 단계는 3.2.3 단계 후에 슬라이드를 굽는 데 사용되는 것과 동일한 오븐으로 수행될 수 있다. FISH 혼성화 솔루션 준비: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 0.9 M NaCl; 0.01 – 0.1%9 (w/v) 나트륨 도데킬술페이트(SDS)가 뉴클레아제없는 물에서. 필요한 경우 5-50%(v/v) 폼아미드를 추가합니다. 이 혼성화 용액을 50°C에서 미리 따뜻하게 하여 파라피화 시.참고: 포르마미드는 테라토겐 역할을 하는 아미드입니다. 장갑과 고글을 곁들인 폼아미드를 처리합니다. 소량으로 눈, 피부 또는 점막에 노출되면 자극적입니다. 다량에서, 포르마이드 증기는 의학적 개입을 요구할 수 있다. 포르마미드는 -20°C 냉동고에 100%로 보관할 수 있다. 염색을 위한 슬라이드 준비: 분리 코플린 항아리에 슬라이드를 배치하여 섹션이 다른 슬라이드 또는 항아리와 접촉하지 않도록하고 슬라이드를 10 분 동안 60 °C에서 굽습니다. 연기 후드에서 코플린 항아리를 오븐에서 미리 데워진 자일렌으로 채우고, 샘플 위에 직접 붓지 않고 조직을 빠져나가지 않도록 주의하십시오. 코플린 항아리를 60°C 오븐에 다시 놓습니다. 연기를 후드에 나머지 자일렌과 병을 둡니다. 사용된 자일렌을 적절한 폐기물 용기에 붓고, 유리 슬라이드의 조직 섹션을 방해하지 않도록 주의하고, 한 쌍의 집게를 사용하여 슬라이드가 코플린 항아리에서 떨어지는 것을 막습니다. 코플린 항아리에 남은 자일렌을 보충하고 연기 후드의 실온에서 10 분 동안 배양하십시오. 실온에서 5 분 동안 99.5 %의 에탄올로 섹션을 배양하십시오. 이 인큐베이션 단계 후, 코플린 항아리에서 슬라이드를 제거하고, 실험실 닦아 또는 종이 타월에 슬라이드의 뒷면을 닦고, 에탄올 방울이 사라질 때까지 잠시 공기 건조.참고: 슬라이드 뒷면을 닦아 건조 진행 상황을 더 잘 시각화할 수 있습니다. 생선으로 세균 염색 액체 차단제 또는 PAP 펜을 사용하여 각 조직 섹션의 영역을 돌면 액체 팽창 영역을 제한하십시오. 잉크가 섹션 자체와 접촉하지 않는지 확인합니다. 혼성화 용액에 의해 커버되어야 하는 표면적을 최소화하기 위해 조직에 접촉하지 않고 가능한 한 각 조직 섹션에 가까운 원을 만듭니다. 혼성화 용액 준비: 사전 웜 하이브리드화 솔루션의 50 μL마다 0.5 μg 프로브(예: 1 μg/μL 프로브의 0.5 μL)를 추가합니다. 슬라이드의 섹션에 혼성화 솔루션을 파이펫(섹션/원 크기에 따라~20 μL/단면). 인큐베이션 단계 및 저장 중에 이 시점부터 하이브리드화 솔루션과 슬라이드를 빛으로부터 보호합니다. 사용된 액체의 부피가 유연한 플라스틱 커버슬립으로 오버레이시 전체 섹션을 덮는지 확인합니다. 습한 챔버에서 슬라이드를 배양하여 증발을 줄입니다. 습도를 제공하기 위해 과도한 혼성화 용액 또는 인산염 완충식식염(PBS)으로 담근 바닥에 물티슈 또는 종이 타월이 있는 파이펫 팁 박스가 있는 습한 챔버를 만듭니다. 프로브 세트에 따라 45-50°C에서 섹션을 배양하여 >3h에 대해 배양합니다. 생선 세척 버퍼를 따뜻하게 : 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 인큐베이션 기간 동안 0.9M NaCl ~ 50°C. 코플린 항아리의 슬라이드를 덮을 수 있는 충분한 세척 버퍼를 준비합니다. 플라스틱 커버립을 제거합니다. 코플린 항아리에 생선 세척 버퍼에 슬라이드를 인큐베이션, 모두 50 °C로 미리 따뜻하게. 코플린 항아리를 50°C 오븐에 다시 넣고 10-20분 간 놓습니다. 두꺼운 샘플의 경우 버퍼를 추가하고 커버립을 부드럽게 분리하여 코플린 항아리의 커버립을 제거하여 슬라이스를 얼룩지게하지 않도록 합니다. 점액 과 호스트 기능을 염색 PBS에서 일반 DNA/점액 카운터스테인을 준비하십시오: 최종 10 μg/mL DAPI + 40 μg/mL 점액 얼룩 UEA-1. 추가 커버립으로 조직을 손상시키지 않도록 커버슬립이 없는 경우 반점을 덮을 충분한 카운터스테인을 준비하십시오.참고: 커버슬립이 없는 경우 반점을 덮는 것은 3.3.2에 사용된 20 μL보다 더 큰 부피가 필요합니다. 평균 크기의 단면(직경~10mm)의 경우 200μL이 한 지점을 커버하기에 충분합니다. 더미 슬라이드에서 이 볼륨을 미리 테스트합니다. FISH 세척 버퍼를 제거하고 코플린 항아리에 PBS로 교체하십시오. 코플린 항아리를 PBS로 리필한 직후 PBS를 장식합니다. 병에서 슬라이드를 제거하고 피펫 끝으로 조직을 만지지 않도록하면서 섹션 의 상단에 있는 카운터스테인을 피펫합니다. 전체 섹션을 거품으로 덮습니다. 어둠 속에서 45 분 동안 4 °C에서 배양하십시오. 신선한 PBS로 얼룩을 3 번 빠르게 씻으십시오 : 핀셋을 사용하여 슬라이드를 제자리에 잡고 싱크대에 PBS를 부어 신선한 PBS로 즉시 리필하십시오. 슬라이드 뒷면을 닦아 서 대부분의 PBS는 피펫 팁에 연결된 진공 라인의 도움으로 섹션에서 증발하게합니다. 다시 한번 파이펫 끝으로 단면을 만지지 마십시오. (DAPI 없이) 마운팅 매체를 사용하여 섹션을 마운트하고 유리 커버립으로 덮여 실온에서 설정하여 커버립이 평평하고 장착 매체에 기포가 없도록합니다. 투명 매니큐어로 커버슬립가장자리를 따라 페인팅하여 슬라이드에 커버립을 부착하고 슬라이드 가장자리에서 벗어나 슬라이드가 이미징 중에 현미경 슬라이드 홀더에 수평을 유지하도록 주의하십시오. 형광이 고갈되기 전에 몇 주 동안 어둠 속에서 4 °C에서 슬라이드를 저장합니다. 4. 이미징 및 이미지 분석 얼룩 시각화 조직과 루멘을 모두 포함하는 조직의 영역을 선택하여 미생물-숙주 인터페이스를 이미지화한다. 점액 두께 및 발광 생물 지리학의 정량적 이미징을 위해 상피 빌리 및/또는 토굴의 조각이 종방향이고 단면이 아닌 관점 필드를 선택합니다. 점액과 상피 사이에 큰 간격이 있는 영역을 피하여 아티팩트를 단면화하지 않도록 하십시오. 물고기를 찾아 서 접경 신호의 사진 표백을 피하기 위해 초점을 맞추기 위해 DAPI 신호를 활용하여 조직을 찾아 초점 평면을 수정합니다. 이미징 설정을 조정합니다. 세균DAPI 얼룩을 시각화하려면 레이저 전력을 증가시키고 상피 세포의 DAPI 신호가 과포화 또는 “날려 버린” 지점까지 얻습니다.참고: 과포화를 하지 마십시오, 이 복구 할 수없는 핵에 표백 및 시각적 유물로 이어질 것입니다. 다른 모든 채널의 경우 백그라운드 위에 선명한 신호를 제공하는 레이저 전력의 최소량을 사용하고 과포화하지 않도록 주의하십시오.참고: 타일 간의 겹침이 이미지될 때 포토표백이 문제가 되기 때문에 타일 스캔을 수행할 때 특히 중요합니다. 개별 박테리아를 이미지하기 위해 40배 이상의 배율을 사용하십시오. 이미지를 획득합니다. 타일 스캔을 획득하여 루멘 내의 미생물의 점액 두께 및 공간 분포에 대한 정량적 데이터를 얻습니다. 타일 사이에 15% 겹쳐야 하고 비네팅/고르지 않은 조명을 확인하여 <1x 줌으로 악화될 수 있습니다. 타일 스캔을 설정할 때, 흐릿 /초점이 외투적인 이미지를 분석 할 수 없기 때문에 조직이 모든 타일에 초점을 맞추고 있는지 여부에주의를 기울이면 (그림 3B). 가능하다면, 상피 및 점액 층이 각도가 아닌 타일과 평행하도록 스캔 영역을 회전하여 상피의 주어진 길이를 이미지하는 데 필요한 타일 수를 최소화한다. 그렇지 않으면, 유사한 효과를 달성하기 위해 이미징 영역에 평행또는 수직인 상피의 단면을 찾아냅니다.