真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速な インビボ 固定と分離

1. 酵母細胞プロトコル 酵母細胞培養と固定注意:細胞の固定および収穫は修正と10、38から合わせられます。 適切な培地(酵母エキスの1%w/v)で0.05 AU以下(OD600)の開始光学密度を有する軌道シェーカーに1 L酵母細胞培養(野生型(WT)BY4741が例として与えられる)を設定し、 ペプトンの2/v、デキストロース(グルコース)の2/v、例として使用されるアデニン硫酸(YPD)の40mg/L)を所望の条件下(30°C)で使用実験)。 酵母細胞の液体懸濁液培養液をペレット化するための、適合ローターおよび遠心分離ボトルを備えた先入遠心分離機を設置します。グルコース飢餓実験では、600 nmで0.6-0.8 AUの光学密度に達すると細胞をペレットにし、30°Cで短い遠心分離を使用し、1分間5,000 x gを使用する。注: 成長する細胞の OD の記録を保持し、指数成長フェーズが関心がある場合は、OD600 が 0.6-0.8 AU に達するまで細胞を成長させます。 ペレットを、無または低(0.25%w/v)を含むYP培地で直ちにグルコースを添加し、30°Cで30°Cでさらに10分間培養を軌道シェーカーインキュベーターに再懸濁させます。注: メディア構成は、その後のクロスリンク効率に影響を与える可能性があります。このプロトコルは、YPD のみを使用してテストされました。飢餓実験を行う場合、タイミングを遵守し、手順間の遅延を最小限に抑えることは重要です。 細胞の準備ができたら、250gのきれいな砕いた水氷を含むビーカーでヒュームフードの中にアイスボックスを設置します。25 mLのストペットと購入したばかりのメタノール安定化37%w/vホルムアルデヒド溶液がフード内でアクセス可能であることを確認してください。砕いた水氷の25%w/vを含むビーカーに1 L培養物を注ぎます。注: 特に指定がない限り、セルが凍結されるまで、その後のすべての操作を通して、細胞を氷の上に置いてください。 ホルムアルデヒド溶液の77%w/vの75 mLを2.2%w/vの最終濃度に加え、氷が溶けるまで混合物を激しく攪拌します。 氷が溶けたら、タイマーを10分間設定します。注:再現性のある固定結果を得るために推奨されるタイミングと温度のレジメンに従ってください。 10分間培養した後、培養液を予め冷却された遠心分離器ボトルに移し、4°Cで遠心分離して細胞をペレット化し、5,000 x gで 5分間培養します。このスピンがオンになっている間、50 mLチューブをプレクールし、準備したての緩衝液A(残りのホルムアルデヒドを中和するためにグリシンを含む)を氷の上に保管します。注: 正確なバッファー構成については、提供されている表を参照してください。 遠心分離機の後、遠心管を氷に接触したペレット側の氷の上に置きます。チューブをヒュームフードに入れ、上清をホルムアルデヒド廃棄物容器に捨てます。 25 mLのストリッパーを使用して、50 mLのチューブに移すバッファー A の 20 mL ですべてのチューブから細胞ペレットを再懸濁します。注:この洗浄は、再現不可能な架橋を避けるために重要であり、バッファの添加は、細胞の収穫から20分を超えてはなりません。 バッファーAで最大40mLの体積を作り、4°Cで遠心分離して洗浄した細胞を5分間5,000xgで回収します。 上清を捨て、グリシンを含まない緩衝液A1の40mLの細胞ペレットを再懸濁し、グリシン汚染を除去する。 ペレット細胞は4°Cで遠心分離することにより再び、5分間5,000xgとした。 バッファー A1 でのこのス述をもう一度繰り返します。上清を捨て、細胞ペレットを氷の上に置きます。ペレットでチューブの重量を量る(湿った細胞塊は、細胞培養の1Lあたり〜1 gでなければならない)。 酵母細胞破壊と細胞ゾルの収集 アルミニウムホイルを裏打ちしたポリスチレンフォームボックスに液体窒素を約3cmの深さまで充填します。箱の中に50mLのチューブを直立して置きます。 ペレット(1g湿潤細胞質量)を550μLのバッファーA2に再懸濁し、10秒の渦を10秒にする。RNase阻害剤の40 U/μLの10 μLと10秒の渦を再び加えます。注意: 液体窒素を取り扱う場合は、熱絶縁手袋などの適切な保護具を着用してください。液体窒素を保持するために使用される容器が漏れないようにし、内部のチューブラックが浮いたり、横に落ちたりしないようにしてください。酸素の枯渇を避けるために換気の良い領域で働く。 1 mL ピペットを使用して、液体窒素を含む 50 mL チューブに細胞懸濁液を滴下します。注: 滴下は、液滴の凝集を避けるためにゆっくりと慎重に行う必要があります。新しい液滴を導入する前に、液滴が凍結することを確認してください。 凍結した細胞懸濁液を用いて50mLチューブを室温に移し、液体窒素が完全に蒸発するまで待ちます。チューブをキャップで密封し、セルペレットを-80°Cで保管するか、すぐにさらに進みます。注意: チューブを密封する前に、液体窒素が完全に蒸発していることを確認してください。密閉チューブに残った液体窒素は、危険な圧力の蓄積を引き起こす可能性があります。 次のステップに備えて、ドライアイス上で1.5 mLヌクレアーゼフリーチューブと10 mLステンレススチール研削瓶をプレクールします。 凍結した細胞懸濁液を清潔で無菌のヘラを使用して瓶に移します。注意: 研削瓶がしっかりと密閉されていることを確認してください。 粉砕瓶を液体窒素に1分間沈め、液相が接合部の下に残っていることを確認します。27 Hzのクライオミキサーミルを1分間攪拌します。注: 加工に 1 つのキャニスターのみがサンプルで必要な場合でも、粉砕キャニスターと同じモデルの別のモデルのバランスを常に調整してください。 ミキサーミルで1分間27 Hzで密閉された研削瓶を攪拌します。 粉砕瓶を液体窒素で以前のように再冷却し、ミキサーミルでさらに1分間27 Hzで振ります。 1.5 mLヌクレアーゼフリーチューブと一緒にドライアイスを含む氷箱に瓶を移します。小さなスチールヘラを使用して、得られた粉末サンプルを〜100mgのアリコートでチューブに移し、チューブを-80°Cで保存します。注:実験ごとに、ポリソーム沈積プロファイル分析、翻訳された分画と非翻訳画分へのサイトゾルの分離、およびRNase消化時のSSU、リボソーム、および二数分分への翻訳された分画をさらに分離して構成するサンプルの約600mgを使用することをお勧めします。 固定(ポリ)リボソーム複合体と非翻訳分画の分離注: 以前に確立された手順10,38一般的に、(ポリ)リボソームとの共沈下に基づいて翻訳されたRNAを濃縮するために続く。翻訳された細胞質と非翻訳された細胞質の分画を分離するためのより洗練されたアプローチがここに導入され、材料を沈殿させ、その後再溶解する必要性を排除する。薄い壁の超遠心チューブ(5 mL、13 x 51 mm)で凍結融解法43を使用して、バッファBで2.5 mLリニア10%〜20%のショ糖勾配を調製します。注: フリーズ融解法は、互いの上に直線的に退行する濃度を持つバッファ付きスクロース層の順次付加と凍結によって行われます。詳細については 、補足表 1 を参照してください。 不連続な50%w/vスクロースクッションを作成するには、線形勾配の解凍と安定化時に、19 G x 1.5インチ針に取り付けられた1mLシリンジまたは同様の寸法/適切な寸法のガラス毛細血管を使用して、バッファBの50%スクロースの0.5mLをチューブの底に直接分配します。分配する前に、慎重かつゆっくりとそれがチューブ底に到達するまで、任意の妨害を避け、事前形成されたスクロース勾配の上から下に針または毛細血管の先端を駆動します。メモ:バッファBの準備手順については 、補足表1 を参照してください。 慎重に上部を除去するか、バッファーBにスクロースの10 w/vを重ね、氷冷または4°Cに保つことによって、勾配のバランスを取ります。注: 下の 50% スクロース層を持つ不連続勾配は、チューブ壁に沈殿することなく、より高い沈降率で材料を収集するために必要です。 凍結細胞粉末試料の解凍〜100mgを室温で、すぐに氷の上に置きます。150 μLのバッファーA2にピペットを加え、RNase阻害剤を1 U/μLに加え、ボルテックス(過度の発泡と気体相と混合を避ける)で10秒混合します。注: 特に断らない限り、氷上に材料を保持しながら、すべての操作を続行します。 4°Cでチューブを遠心分離して細胞デブリをペレットにし、13,000 x g で5分間、新しい1.5 mLの低タンパク質結合チューブで清澄化上清(約150μL)を回収します。 ステップ1.3.3から不連続なショ糖勾配チューブに得られた透明化混合物をロードし、慎重にそれらをバランスさせます。 4°Cの中容スイングバケットローターでチューブを超遠回しにし、平均gフォース287,980 x g(k ファクター49)で1時間30分間。注:これらの条件は、底部(50)リボソーム分を濃縮しながら、勾配の上部(10%-20%スクロース)の上部(10%-20%スクロース)の部分に自由(非(ポリ)リボソームサブユニット)を保持するために(超遠心後の遠心勾配UV吸光度解析分析を使用して)事前に最適化されています。 翻訳された細胞質の分画を集めるために19 G x 1.5″の針が装備されている新しい生殖不能1 mLのスポイトを使用してください。安定したラックに 5 mL の勾配を配置し、チューブの底面が見えるようにします。 チューブの上から、針を勾配の底にまっすぐに突き刺し(チューブを穿刺せずに)、気泡を作らずに穏やかに、翻訳されたRNAプールを含む底液の正確に0.5 mLを引き出します。注:このステップは、冷たい部屋で行われ、チューブがしっかりと保持されていることを確認してください。グラデーションの乱れを避けるために、1 回のアップストロークモーションで 0.5 mL 全体を描画することをお勧めします。 超遠心分離の際にショ糖勾配の吸光度読み出しにより、得られた混合物中の(ポリ)リボソーム存在と、SSU、LSUおよび軽い分率の枯渇を確認する。 10 kDaカットオフ再生セルロース膜を備えたマイクロ濃度デバイスでの限外濾過を使用して、収集した翻訳されたRNAプールを前のステップから100 μLに濃縮します。メモ:マイクロ濃度デバイスの膜を0.5mLのバッファ1( 図2a)で事前洗浄し、メーカーが推奨するスピン条件(g)を使用します。 さらに、バッファー1で前のステップから材料を5回希釈し(400 μLを追加)、200 μLに濃縮して、スクロースの部分的な除去と同様に、より小さなボリュームを可能にします。注: 得られた混合物を-80 °Cで6ヶ月まで保存し、’総翻訳RNA’RNA-seqライブラリ構造、またはTCP-seqライブラリ構造のRNase消化ステップの入力材料として使用することをお勧めします。「翻訳されていない」細胞質の分画は、同様の手順を使用して勾配の上端から回収し、-80°Cで保存することができます。 固定(ポリ)リボソーム複合体のRNase消化と、消化された物質を小さなリボソームサブユニット(SSU)、モノリボソーム(リボソーム、RS)、およびディリボソーム(ジソーム、DS)分数に分離する注: 一般に、この手順は前述の方法に従います。10,38しかし、3つの全ての単離された分数にわたって最良の分解能を達成するために、変更された勾配タイプ、分離時間、加速度およびRNase消化条件が採用される。慎重にバランスのとれた12.5 mL線形10%-40%w/vショ糖勾配を調製し、13 mL薄壁ポリプロピレンチューブの緩衝1、14 x 89mm、ステップ1.3.1に記載されているフリーズ融解法43を使用して、その中に注意してください。 室温で解凍し、すぐに氷の上にサンプルを移すか、またはステップ1.3.12から濃縮され、スクロース枯渇翻訳サイトゾル分率を取ります。注:特に明記されていない限り、氷上のすべての手順を続行します。 翻訳された細胞質の分率を、23°Cで30分間の分 画の 1OD260 単位当たり4.5 Uで混合して消化する。 RNase Iを不活性化できるRNase阻害剤を混合物に0.25 U/μLにして、RNase Iを不活性化させることですぐに加えて混合する。注:AU 260=(μL中のライセートの1cmの光路x体積に相当する光学密度単位に標準化された260nmでの吸光度)/1,000を使用して、RNase I.誘導AU260を誘導するRNase阻害剤を使用してください。 すぐにサンプルを氷に移します。注意: 消化の推奨条件に従い、慎重に追加されたRNase Iの量を測定することが重要です。ここでいうRNase I単位は、37°Cで30分でマウス肝臓RNAから1μgの酸可溶性物質を生成するのに必要な酵素の量と定義され、RNase Iバッチは、活性に未定の変動を有し、最適な消化条件を達成するための実験を必要とすることがある。酵素ストックが濃縮しすぎる場合は、溶液の非常に少量のピペットを避けるためにバッファー1でそれを希釈することをお勧めします。 ステップ 1.4.1 から 10%-40% w/v ショ糖勾配に反応混合物をロードします。注:グラデーションごとに150〜300 μLの範囲の最終ボリュームを使用してください。各精製には、最小の2つの勾配が必要です。材料の異なる入力量(低いAU260、10-11AU 260、DS、SSUまたはRSの比較的高いAU260、13-14AU260)を使用して最適な分離を達成します。 4 °Cの中容スイングバケットローターのチューブを超遠回しに、平均g-force 178,305 x g(k ファクター143.9)で3時間30分間超遠回しにします。注意: 予備のバランスチューブが必要な場合は、サンプル含有チューブで質量と質量分布を均等にします。スペアスクロース勾配は、サンプルオーバーレイと同等の量のバッファーと、均一なスクロース濃度のチューブと同等の量でオーバーレイして使用してください。 0.2 μmろ過重チェイス溶液(例えば、ここで使用される脱イオン水中の60%スクロース)を変位ポンプに充填するなど、超遠心分離スピン完了の少なくとも30分前に勾配分画装置を設定します。注:脱イオン水を使用して分画器のラインとチューブを除染し、続いて脱イオン水、脱イオン水、および最後に80%エタノールを除イオン化水で1%-2%SDS溶液を除成することが推奨されます。 吸光度読み出しベースラインを調整するには、最初にシステムに脱イオン水を充填し、メーカーの推奨事項に従って光学系をゼロにし、サンプルチューブと同じバッファ(例えば、バッファ1)で作られた14 x 89 mmのスクロース勾配を使用してベースラインシフトを補正します。注: 1.5 mL/min などのサンプルの読み出しと同じ変位速度を使用して調整を行います。 最初に検出器の光路に入り、最初に分数コレクタ出力に現れる溶液との間の時間を正確にカウントすることにより、変位システムのデッドボリュームを測定する。メモ:推奨速度は1.5 mL/minで、分画は室温で行うことができます。採取した分数を氷上で直ちに移すことをお勧めします。 254 nmでの生光度読み出し、1.5 mL/min変位速度、サンプルの予想される沈み込み位置と吸光度プロファイルに基づくインライン画分検出を使用して分画を行います。前に測定したデッドボリュームに対応する時間遅延でコレクタチューブ切り替えを使用します。 SSU、RS、DS複合体の位置と移動度に対応する分画を分離し、新しい低タンパク質結合1.5 mLマイクロ遠心チューブにそれらを収集します。すぐに氷上の単離された分画を移し、すぐにさらに処理されない場合は凍結する。注:採取した分画をドライアイスまたは液体窒素で直ちにフラッシュフリーズし、-80°C以下で最大6ヶ月間保存することをお勧めします。 リボソーム複合体の架橋解除とRNA-seqライブラリーの構築に用いられるRNAの単離 クロスリンクを逆ブロック/逆にして、関連するタンパク質からRNAを分離するには、スクロースの勾配分の約半分を、蓋の安全/ロッキングデバイスを備えた新しい低核酸結合ヌクレアーゼフリーポリプロピレン1.5 mLマイクロ遠心チューブ(1チューブあたり350 μL)に移します。 40 μLの100%停止溶液(10%SDS w/vおよび100 mM EDTA)、25°C(10mM)で1 Mトリス-HCl pH 2の4μL、2.5Mグリシン(10mM)の1.6μL(10mM)および脱イオン化された核を得る40μLの体積に混合液を補う。 管の内容物をピペットで混ぜ、室温で管を移す。 酸性フェノールの等量を加える:クロロホルム:イソアミルアルコール125:24:1(pH 4.0-5.0)混合物を各チューブに加える。ボルテックスミキサーを使用して、最大速度に設定して2分間激しく混合物を振ります。注意:フェノールとクロロホルムは腐食性および毒性がある。液体との物理的な接触を避け、換気の良い場所や煙のフードの下で働きます。フェノールやクロロホルムを使用する場合は、手袋、ラボコート、保護ゴーグル、またはフェイスシールドを使用してください。 チューブをサーモシェーカーに入れ、65°C、1,400rpmで30分間連続的に振ります。 室温で10分間12,000 x g で混合物を遠心することにより、相凝集を促進します。 上の水相を収集し、新鮮な低核酸結合1.5 mLチューブに移します。注: クロスコンタミネーションを避けるために、水相を完全に回収しないでください。適切なリカバリボリュームは300~350μLです。 収集した水相を、0.1容量の3 M酢酸ナトリウム(pH 5、25°C)、グリコーゲン20μg(5μg/μLストックを使用)、2.5体積の絶対エタノールで補います。慎重に1分間チューブをボルテックスして溶液を混合します。 RNAを沈殿させるため、サンプルを-20°Cで2時間以上インキュベートします(一晩推奨)。 チューブを室温まで温め、渦を混ぜて混ぜます。注:チューブの事前の温暖化と室温でのその後の遠心分離(強制冷却なし)は、塩とフェノールの共沈殿と持ち越しを減らすのに役立ちます。これらの条件は、記載されているように、十分に純粋なエタノールを使用して行う場合、RNA採取の物質的損失または非効率をもたらさない。 ペレットRNAは、チューブを12,000 x g で室温で30分間遠心して沈殿する。 上清を捨て、80%v/vエタノールでペレットを2回洗浄し、室温で10分間12,000 x g で遠心分離して毎回回収します。 チューブ蓋を開け、開いたチューブを45°Cに設定して10分間乾燥ブロックに入れ、RNAペレットを乾燥させます。得られた乾燥ペレットを20 μLの1x HEバッファーに溶解します。 UV吸光度スペクトル測定を用いて、得られたRNA濃度を推定する。注:RNA断片の長さおよび全量は、自動蛍光ベースのキャピラリーゲル電気泳動装置などで変性ゲル電気泳動を使用してさらに評価することができます。 SSU濃縮のタグ付きeIFおよびウェスタンブロット分析によるSSUの選択的共免疫精製注:磁気IgGビーズを使用して親和性精製を行うために、ステップ1.4.11から消化および沈降分離SSU分率の〜15 AU(260 nm)を使用してください。SSU 分数の 5% を入力コントロールとして保存します (入力端数、I)。eIF4A タグ付け (TIF1-TAP;タンデムアフィニティー精製タグ)酵母株を用いた酵母株は、抗TAP抗体を用いてTAPタグをプローブすることによりeIF4Aを検出することも可能である。100 μL の磁気 IgG ビーズ懸濁液(1 mg のビーズを、各 15 AU (260 nm) のライセートまたは分数に使用した) を新しい低タンパク質結合1.5 mLチューブに移します。磁気ラックを使用してビーズを収集し、それらを吸引します。 磁気ラックを使用してピペット処理と回収により、1 mLのバッファー1で磁気ビーズを2回洗浄します。 洗浄後、マグネットラックに保管しながら、ビーズを回収してデカンにします。 洗浄ビーズにSSU分数を加え、〜20rpmに設定したシクロミキサーで4°Cで回転して4時間培養します。 4 °Cの磁気ラックを使用してビーズを収集し、上清(フロースルー画分、FT)を保存します。 4 mM DTTを加えたバッファー1でビーズを4°Cで2回洗浄し、各時間はシクロミキサーで10分間回転し、磁気ラック上のビーズを収集してデカントします。このスタイ(W1とW2の分数)を保存します。 ウェスタンブロッティングなどの分析用途では、PH 8.5~1x、DTTを用いたLDS(ドデシル硫酸リチウム)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)サンプルバッファーを2mMに添加して、変性および還元条件下で結合材料を溶出します。 95°Cで熱ブロックで5分間加熱し溶出を確定します。 磁気ラックを使用してビーズを回収し、新鮮な低タンパク質結合1.5 mLマイクロ遠心分離管で変性溶出物(E分率)を回収します。 前のステップのE分を使用して、変性ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)PAGEを直ちに実行するか、E分を-20°Cで保存します。注:その後のアプリケーションに対するTAPタグ濃縮翻訳複合体の準備コレクションについては、タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼを使用する代替溶出アプローチを使用してください。詳細については 、補足表 1 を参照してください。 希釈FT、W1およびW2画分を濃縮するために、3倍の量の氷冷アセトンを加えて材料を沈殿させる。サンプルアセトンミックスを-20°Cで3時間インキュベートします。 ペレットは、4°Cで10分間13,000xgでチューブを遠心して沈殿する。 上清を捨て、開いたチューブのペレットを室温で30分間乾燥させます。 ペレットを2 mM DTTで補った1x LDSローディングバッファの7 μLに溶解します。95°Cに設定した熱ブロックでサンプルを5分間加熱します。 すべてのI、FT、W1、W2、およびEサンプルをアクリルアミド勾配の4%-12%w/v、ビストリスポリアクリルアミド変性ゲルにロードします。80 Vでバッファーを実行する1x MES SDS(2- [N-mopholino]エタンスルホン酸、ドデシル硫酸ナトリウム)を使用してゲルを実行し、タンパク質マーカー(10-250 kDa)がうまく解決し、鉛染料がゲルの底部に達するまでゲルを実行します。注:コントロールとして、WCL(全細胞溶出)(2-10 μg)のシリアル希釈液をゲルにロードすることをお勧めします。分画材料全体にわたってゲルの同等の荷重を達成するために、いくつかの試みが必要な場合があります。 ウェスタンブロッティング装置メーカーの推奨通り、冷たい部屋で100Vで1時間の湿式転写法によりゲルのタンパク質含有量をポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜に移します。 一定の揺れの下で室温で適切なブロッキングバッファー(リン酸緩衝生理食塩水ベース)を使用して膜をブロックします。 抗体希釈に関する製造業者の指示に従って、タグ付きeIF4Aタンパク質、抗Pab1p抗体または抗βアクチン抗体(または他の望ましい標的)を検出するための抗TAP抗体で膜をプローブし、ブロックバッファー(PBS)希釈抗体(1:1,000希釈)を用いた膜を一晩でインキュベーションします。注:1:1,000抗体希釈は良い出発点です。 膜を1xリン酸緩衝生理食塩液で3回洗浄し、0.2%v/v Tween 20(PBST)をそれぞれ10分間洗浄します。 室温でシクロミキサーで1時間インキュベートすることにより、製造業者の指示に従って蛍光標識二次抗体で膜をプローブします。注:1:20,000抗体希釈は良い出発点です。 1x PBSTで膜を3回洗浄し、それぞれ10分間洗浄します。膜を脱イオン水で簡単にすすいで、次に絶対メタノールですすいます。メーカーの指示に従って、蛍光イメージングシステムで膜を乾燥し、可視化します。注:他のタンパク質の染色は、異なる蛍光チャネルに一致する色素を有する二次抗体(ここで使用されるeIF4A-TAP 対 β-アクチン対など)を使用して、同じ膜をシーケンシャル染色またはストリッピングして染色するか、または同じ分画のパターンを繰り返し含むゲルから膜を切断し、各部分をそれぞれの抗体で個別に検出することによって達成できます(ここで使用されるPab1p例のように)。 2. 哺乳類細胞プロトコル 哺乳動物細胞培養と固定 2 T-175フラスコでは、HEK293細胞をダルベッコの修飾イーグル培地で60%-70%合流し、37°Cで10%v/v胎児牛血清を37°C、5%v/v二酸化炭素で増殖させます。注:完全な培地は、L-グルタミン、フェノールレッド、重炭酸ナトリウムを含む500mLの商業的に購入したDMEMに55mLの市販FBSを加えることによって作られていますが、HEPESまたはピルビン酸ナトリウムはありません。合流率70%でのT-175フラスコ当たりの細胞数は、1.7-2.0 x 107の範囲内にする必要があります。 所望の固定時間の少なくとも3時間前に、T-175フラスコの培地を完全な媒体の正確に30 mLに交換し、細胞インキュベーター内のフラスコを交換してください。メモ:新鮮なメディアがフラスコの反対側にピペットでセルの単層にピペット化されていることを確認して、セルの剥離を避けてください。最小限のガスと温度バランスの乱れを導入し、できるだけ早くメディア交換を行うようにしてください。 細胞培地を交換したら、固定に必要なバッファーと化学物質を調製します。DPBSの500 mLボトルに2.5Mグリシンストックの10.2 mLを加えて混合することで、50 mMグリシンでダルベックコのリン酸緩衝塩(DPBS)を準備します。 DMEMのボトルを、非滅菌条件で使用するステップ2.1.1と0.25%トリプシン-EDTAの100 mLアリコートとして10Sを補充して調製します。市販のDPBSの追加ボトルを塩化カルシウム(CaCl2)および塩化マグネシウム(MgCl2)であらかじめ配合した。注:ソリューションは、最大2週間4°Cで保存することができます。 T-175フラスコが上に均等に収まり、準備されたバッファと一緒にヒュームフードに入れておくことができるように、砕いた水氷で満たされた氷箱を準備します。注:環境変化に対する翻訳の迅速な応答により、インキュベーターからの細胞フラスコの除去とホルムアルデヒド溶液の添加との間のすべてのタイミングを最小限に抑える必要があります。 細胞を冷却するために、インキュベーターからT-175フラスコを取り出し、氷にしっかりと押し付けて最大の表面接触を確保します。化学煙フードの内側で、フラスコを横に傾け、メディアが細胞の反対側に集まるようにします。ピペット168 μLの37%w/vホルムアルデヒドを直接プールされた培地に入れます(最終濃度は0.2%w/v)。フラスコを前後に軽く揺らすことですぐに混ぜ、フラスコを氷の上に閉じて再配置し、水平にして細胞が均等に覆われていることを確認します。注意:ホルムアルデヒドは、長期的な悪影響を及ぼす可能性のある有害物質であり、呼吸器系と皮膚の両方に刺激を与えます。それは適切な化学発煙フードで扱われるべきである。ホルムアルデヒドの容器は、フームフードの外側で常に密封されなければなりません。メモ:ホルムアルデヒドがフラスコの壁に直接添加され、フラスコの壁に追加されていないことを確認してください。ステップ 2.1.6 は 1 分未満かかります。 さらに10分間氷の上にフラスコをインキュベートします。細胞とは反対側のフラスコ側を通して適切な廃棄物容器に媒体を注ぎ出す。 ストレペットを使用して、カルシウムとマグネシウムイオンなしでダルベックコのリン酸緩衝生理食塩水の30 mLのピペットを使用し、さらに50 mMグリシンを含み、細胞と反対側の側に優しく含む。フラスコを揺らすことで混ぜます。フラスコを水平位置に戻し、氷の上でさらに10分間インキュベートします。 細胞とは反対側のフラスコ側から溶液を注ぎ、標準的な0.25%w/vトリプシン-EDTA溶液の7 mLを静かに加えて、細胞を取り外して再懸濁させます。フラスコを室温で5〜10分間インキュベートします。注:トリプシンEDTAソリューションがすべてのセルを均等にカバーしていることを確認してください。細胞の剥離を促進するために、定期的な穏やかな傾きと揺りを使用してください。 フラスコを垂直に移動し、ストリップレットを使用してフラスコの壁から残りの細胞を静かに洗浄することによって、切り離された細胞を収集します。懸濁液を氷上にセットした50mLチューブに移します。メモ:固定セルはより脆弱になる可能性があります。フラスコ壁から細胞を取り外すために必要なもの以上に、強くまたはそれ以上のピペットをしないでください。 収集した細胞懸濁液を20 mLの完全な培地(10Sの非滅菌性の氷冷培地)ですぐに補い、チューブを軽くひっくり返して混ぜます。注:完全な細胞培養培地(10Sを含む)を添加してトリプシンを中和し、細胞膜や細胞崩壊にさらなるダメージを与えないようにします。 ペレットは、チューブを100xgで5分間及び4°Cで遠心して細胞をペレット化した。 細胞ペレットははっきりと見える必要があります。 培地を流し、細胞ペレットを10mLの氷冷DPBSでCa2+、Mg2+、グリシンなしで穏やかに再懸濁します。 ステップ 2.1.12 を繰り返します。 洗浄バッファーを注ぎ、氷の上にグリシンなしでCa2+、Mg2+を使用して氷冷DPBSの800 μLで細胞ペレットを穏やかに再懸濁します。再懸濁した細胞を新しい低タンパク質結合1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移します。 チューブを100xgで3分間、4°Cで遠心分離する。 1 mL ピペットを使用して上清を慎重に廃棄します。この段階では、細胞ペレットを-80°Cで凍結するか、細胞のリシスステップに進むことができる。注:凍結細胞ペレットは、1年まで-80°Cで保存することができます。細胞ペレットの凍結は、その後のリシスを促進し、長期保存が計画されていない場合でも凍結を推奨することを発見した。 哺乳類細胞破壊と細胞ゾルの収集 バイオセーフティキャビネットに、非イオン性の非否定洗剤に基づく300μLのリシスバッファーと、40 U/μL RNase阻害剤の7 μLを加えます。1 mL チップを使用してピペット処理を行い、よく混ぜます。 慎重に1-3 mLの注射器に25G針を取り付け、少なくとも7つの遅い上向きの摂取量と速い下向きの排気ストロークを使用して、混合物を激しくピペットします。 注射器と針をシャープビンに捨て、31G針を装備した0.3 mLシリンジを使用して手順を繰り返します。 注射器と針をシャープビンに捨てます。4°Cでチューブを遠心分離し、12,000 x g で5分間細胞の破片をペレットします。 上清を新しい低タンパク質結合1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。両方を保管し、細胞デブリ(制御目的)と得られた透明化細胞のリセートを-80°Cで保管します。注:2つのT-175フラスコを組み合わせ、推奨されるボリュームに続く場合、ライセートの光学密度は25-30 AU260 の範囲です。ライセートおよび細胞デブリは、1年まで-80°Cで保存することができます。 固定(ポリ)リボソーム複合体と非翻訳分画の分離 13 mL薄壁ポリプロピレンチューブで15%-45%w/vショ糖勾配を調製し、14 x 89mm、一般的に酵母プロトコルのステップ1.3.1に記載されているように凍結融解法を使用するが、緩衝液2を用いた(図2a)。注:分画の前の夜4°Cの冷たい部屋で一晩勾配を解凍してください。 前のステップ2.2.5からバランスの取れた勾配に細胞のライセートの150-250(最大300)μLをロードします。残りのライセートを-80°Cで保存し、コントロール目的で使用してください。注: ここでは、多染色体、リボソーム、および’自由’SSU画分への沈下ベースの分離の例が提供されています。代替の方法については、提供 されている補足表 1 を参照してください。 4°Cの中容振動バケットローターのチューブを超遠回しに、平均g-force 178,305 x g(k ファクター143.9)で1時間45分間。 30分のスピン完了の前に、酵母プロトコルステップ1.4.7-1.4.9で説明されているように、勾配分数を設定し、ベースライン化する。 一般的に、酵母プロトコルステップ1.4.10-1.4.11に記載されているように、勾配を分数する。注:このステップは、多染色体、リボソーム、および’自由な’SSU分数を分離します。多染色体画分は、ポリソームプロファイリング実験で使用され得る。 すぐに氷の上に収集された分数を移し、さらに処理されない場合は、-80°Cで6ヶ月まで保存します。注:分数コレクタチューブの変更が、オンラインの端数識別および偏析と同期している場合は、最大800 μL分数(1.5 mL/min での分数当たり32秒の回収時間)を使用することをお勧めします。インライン吸光度読み出しを使用せずに分画を行う場合は、250~500 μLの画分(1.5 mL/minで10~20秒/分)を使用することをお勧めします。分離後、分画は、免疫精製、電子顕微鏡、変性PAGEおよびウェスタンブロッティングにすぐに使用するか、またはその後のRNAおよび/またはプロテオミクス分析のために架橋反転を行うことができます。