퇴행성 망막 질병을 위한 비인간 영장류 모형에 있는 망막 안료 상피 이식

참고: 모든 동물 실험은 안과 및 시력 연구에서 동물의 사용을 위한 비전 및 안과 연구 협회(ARVO)에 따라 수행되었습니다. 윤리 승인은 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 얻은, SingHealth, 싱가포르. 동물은 실험실 동물 관리 (AAALAC)의 평가 및 인증 협회에 의해 승인 된 SingHealth 실험 의학 센터에 보관되었다. 이 승인은 모든 동물 실험이 싱가포르 농식품 수의학 당국이 정한 실험실 동물 연구 지침에 대한 국가 자문위원회의 기준을 준수한다는 것을 강조합니다. 다음 실험 프로토콜은 마카카 근막 6개 (남성 4개, 여성 2명, 4~6세, 2.8~4.0kg)의 6눈에서 실시된 실험에 기초하여 확립되었다 . 1. NHP 모델에서 면역 억제 달성 수술 7일 전에 면역억제를 시작하고 후속 기간 동안 면역억제를 계속한다. 정확한 약물 투여량을 보장하기 위해 전신 면역 억제를 투여하기 전에 NHP를 계량합니다. 동물은 그 후 기준선과 매주 무게. 경구 시롤리무스, 독시사이클린 및 미노사이클린을 사용하여 전신 면역 억제를 달성하십시오. 2 mg의 경구 시롤리무스를 투여한 다음 1 mg의 일일 유지 보수 투약이 투여됩니다. 투여 전에 기준선 혈액 시롤리무스 수준을 얻고 후속 기간 동안 이를 모니터링하십시오. 적절한 면역 억제를 위해 최소 5 μg/L의 농도를 보장합니다.참고: 시롤리무스 용량은 무게에 적응되지 않습니다. 하루에 7.5 mg/kg의 구강 독시사이클린을 투여하되 하루에 두 번 투여하십시오. 하루에 7.5 mg/kg의 구강 미노사이클린을 투여하되 하루에 두 번 투여하십시오. 면역 억제 하는 동안, 불리 한 전신 효과 대 한 모든 NHP를 모니터링. 상당한 체중 감량 (>10%), 감소 된 식욕과 물 소비, 탈모, 침략과 혼수 와 같은 비정상적인 행동을 찾습니다. 평가는 3일, 14일, 1개월에 진행되며, 월별 평가가 진행됩니다. 2. 기기 살균 증류수를 사용하여 수술 기구를 헹구는 다. 500mL의 증류수와 2mL의 기기 소독제로 가득찬 초음파 욕조에 장비를 놓습니다. 초음파 목욕의 스윕 기능을 사용하여 15 분 동안 악기를 청소하십시오. 초음파 욕조에서 악기를 제거합니다. 각 헹구기 5 분 동안 증류수를 두 번 헹구십시오. 헹구기 후에 악기를 공기 건조시십시오. 악기상자를 놓습니다. 범용 프로그램 설정을 사용하여 상자를 자동 클락 (50 분 동안 134 °C에서 악기의 살균 : 자동 복제30 분, 건조 20 분). 3. 방부제 프리 트라이암시놀론 준비 (40 mg/mL) 1 mL 주사기를 사용하여 트리암시놀론 용액 1mL (10 mg /mL)를 철회하십시오. 15mL 원상 관으로 옮기고 멸균 균형 소금 용액(BSS)의 4mL과 혼합합니다. 120 × g 에서 5분 동안 원심분리. 모든 트리암시놀론 입자가 원뿔 관의 맨 아래에 있는지 확인합니다. 원적 튜브에서 상체(BSS)를 폐기합니다. 원뿔관에서 멸균 BSS의 5mL로 트리암시놀론 입자를 다시 중단한다. 원심 분리는 5 분 동안 120 × g 에서 용액을 원심 분리합니다. 상부체를 다시 버리십시오. BSS(3배)를 가진 트리암시놀론 입자의 세척을 완료하기 위해 3.3단계를 반복한다. 40 mg/mL의 농도를 달성하기 위해 멸균 BSS의 0.25 mL로 트리암시놀론 입자를 다시 중단한다. 다시 중단 트리암시놀론 (40 mg/mL) 새로운 1 mL 주사기와 흡인. 25G 무딘 플루트 바늘을 부착하고 수술 중 사용을 위해 트리암시놀론 용액으로 주사기를 보관하십시오. 4. NHP 눈의 전처리 에트라비트 플라스미노겐 (0.25 μg/μL) 수술 1주일 전에 원숭이 플라스미노겐(0.25 μg/μL)의 인트라비트 주입(20 μL)을 투여한다. 케타민 (10-20 mg/kg BW)의 근육 주사와 atropine의 피하 주입 (0.05 mg/kg BW)의 절차 전에 NHP를 진정. 국소 마취를 위한 테트라카인 점안액을 관리하십시오. 인트라비탈 주사 전에, 10% 포비도요오드로 회리궤도 영역을 소독한다. NHP의 결막 용오리에 5 % 포비도요오드를 투여하여 눈을 소독. 멸균 BSS로 완전히 헹구기 전에 용액이 적어도 1 분 동안 요새에 머물러 있는지 확인하십시오. 250 μL 주사기를 사용하여 유리병에서 미리 희석된 원숭이 플라스미노겐(0.25 μg/μL)을 흡인시합니다. 30 G 바늘을 주사기에 부착하고 원숭이 플라스미노겐을 인트라비티리얼 투여에 대비하십시오. 한 쌍의 캘리퍼를 사용하여 눈에 주입 부위를 식별하십시오. 림두에서 3mm 떨어진 인트라비테리얼 주사를 관리한다. 세계의 중심을 향한 바늘로 주사를 진행합니다. 세계에서 바늘을 제거하면 면 어플리케이터 스틱을 사용하여 주입 부위를 탐포나데드하고 안구 내 내용물의 역류를 방지하십시오. 윤활유 젤 또는 연고를 투여하여 즉각적인 수술 후 안구 표면 자극을 줄입니다. 5. 외과 테이블 및 장비 설정 멸균 필드를 설정합니다. 멸균 장에있을 때, 항상 수술 스크럽, 마스크 및 헤어 커버를 착용하십시오. 유리체의 수술 내 시각화를 위해 방부제 프리 트리암시놀론(40 mg/mL)을 준비한다(섹션 3 참조). 멸균 BSS를 10mL 주사기로 준비하고 윤활유를 5mL 주사기로 준비합니다. 커튼에 놓습니다. 3-0 실크, 7-0 비릴 봉합사, 면 어플리케이터 스틱, 상처 폐쇄 스트립, 샹들리에 엔탈루니션 섬유 와이어 등 다른 악기를 드레이프에 준비하십시오. 고속 비트레토르, 벤투리 카세트, 25 G 샹들리에 엔토루네이터를 멸균 기술을 사용하여 비트레토미 머신에 연결합니다. 500mL 안과급 BSS 병을 열고 제조업체의 지시에 따라 벤투리 카세트에 연결합니다. 시스템을 프라이밍으로 진행합니다. miOCT/수술 현미경을 켭분. 후방 세그먼트 수술 및 조명을 위한 외과 현미경의 사전 설정된 구성을 선택합니다. 신분증, 성별, 동물의 눈의 측면, 절차의 이름을 포함한 절차의 세부 사항을 입력합니다. 비접촉식, 넓은 각도, 128도 fundus 렌즈를 장착합니다. 멸균 일회용 핸드피스 커버를 수술 현미경/miOCT에 부착합니다. 발 페달을 사용하여 현미경 위치와 초점을 조정합니다. 수술을 진행합니다. 6. 동물의 마취 및 위치 의 준비 (바람직하게는 수의사 팀에 의해 수행) NHP가 역류 및 구토를 방지하기 위해 마취를 유도하기 전에 적어도 8 시간 동안 금식되었는지 확인하십시오. 마취의 유도 전에 NHP를 진정 (진정 지침에 대한 단계 4.2 참조). 1% 트로피아미드와 2.5% 페닐레프린 점안액을 5분 간격으로 최소 3배 이상 바르면 동공 팽창을 달성하십시오. 부프레노르핀 (0.005-0.03 mg/kg BW)의 근육 주사를 투여하 30 분 전에 진통을 달성하기 위해 수술. NHP를 엔트라큐아힐 튜브로 삽관, 일반적으로 3-5 mm 크기. 삽관을 시도할 때여러 가지 크기를 사용할 수 있는지 확인합니다. 외상을 일으키지 않고 후두를 통과 할 수있는 가장 큰 크기를 사용합니다. 최종 조수 CO2를 측정하여 엔오트라큐리 튜브의 적절한 배치를 보장합니다. 전신 마취를 유도하기 위해 엔오트라세이힐 튜브를 통해 2% 이소플루오란 가스를 전달합니다. 소리와 터치를 포함하여 주변 자극에 대한 NHP의 반응을 평가하여 전신 마취 상태 (터치에 대한 응답 부족)를 확인하십시오. 전신 마취 상태를 유지하기 위해 0.5-2 % 이소플루오란 가스를 사용합니다. NHP 심전도, 호흡속도, 혈압 및 산소 포화도를 수술 전체 에서 지속적으로 모니터링합니다. NHP를 수술대에 배치하여 눈이 수술 현미경에 수직이 될 수 있도록 합니다. 마취 중 안구 표면 자극을 줄이기 위해 작동하지 않는 윤활유 젤 또는 연고를 눈에 투여하십시오. 가위를 사용하여 속눈썹을 잘라 감염의 기회를 감소시십시오. 10% 포비도네-요오드로 회리궤도 영역을 소독합니다. NHP의 결막 용오리에 5 % 포비도요오드를 투여하여 눈을 소독. 멸균 BSS로 완전히 헹구기 전에 용액이 적어도 1 분 동안 요새에 머물러 있는지 확인하십시오. 사전 컷 개구부가 눈 위에 중심이 되어 수술을 받을 수 있도록 멸균 드레이프를 배치합니다. 접착제 수술 절개 드레이프로 눈을 가다. 수술을 받기 위해 눈에 측면 교정을 수행합니다. 눈의 시각화를 위해 눈꺼풀을 적절하게 열어 두도록 Lieberman 스펙럼을 삽입합니다. 7화 비트레토미 참고: PET-스캐폴드 RPE 이식편 을 전달하기 위한 적재 공간에 액세스하려면 이 프로토콜은 표준 바이트레오레티날 수술 설정 및 비접촉식, 넓은 각도, 128° 펀더러스 렌즈를 사용하여 4포트(valved) 25G 비크레상절제술을 수행할 것을 권장합니다. 이 프로토콜은 또한 편골 분리유도, RPE 이식편 이식, 하수액 배수 등 몇 가지 중요한 수술 단계를 안내하기 위해 miOCT가 장착된 수술 현미경의 사용을 권장합니다. 한 쌍의 반나스 가위를 사용하여 림푸스 근처의 결막 절제술을 절개하여 360 ° 결막 절제술을 수행합니다. 무딘 해부를 수행하여 peritomy를 확대합니다. 25G 미세병칼날을 사용하여 오른쪽 눈을 위해 8시 또는 왼쪽 눈을 위해 4시에 경화증을 수행합니다. 눈의 림부에서 3mm 경화증을 수행합니다. 7-0 비릴 봉합사를 사용하여 25 G 커스텀 사이드 포트 주입 캐뉼라를 삽입하고 봉합합니다. 인트라비탈 위치를 확인한 후 BSS 주입을 시작하고 시스템을 설정하여 20mmHg의 IOP를 유지합니다. 25 G 플랫 헤드 트로카를 사용하여 오른쪽 눈의 경우 2시 또는 왼쪽 눈의 경우 10시, 7.2 단계에서와 같이 경화증을 수행합니다. 25 G 샹들리에 라이트를 플랫 헤드 트로차에 삽입하고 끈적 끈적한 테이프로 고정하십시오. 광원을 약 60%로 조정합니다. 오른쪽 눈을 위해 10시 또는 왼쪽 눈을 위해 2시 방향에 7.2 단계와 유사한 또 다른 경화증을 수행하십시오. 매듭을 묶지 않고 경화절제술 주위에 U자형 비릴 7-0 봉합사를 놓습니다. 이 경화증을 통해 vitrectomy 커터 팁을 삽입합니다. 엔트리 포트 주변의 vitrectomy를 시작하고 다음 설정으로 짧은 코어 vitrectomy: 분당 최대 5000 컷, 최대 포부 400 mmHg. 더 나은 유리체 시각화를 위해 트리암시놀론 (40 mg/mL)의 20-50 μL을 주입하십시오. 망막으로부터 유리체 체체를 분리하여 후방 유리체 분리(PVD)를 유도한다. PVD의 부드러운 유도를 허용하도록 광학 디스크 위에 비트레스터를 배치합니다. 비트레토르는 절단없이 400mmHg의 최대 설정에서 만 포부에 보관하십시오. 필요한 경우 25G 내구 집게를 사용하여 디스크 여백에서 유리체를 조작하여 유리체 피질에 찢어져 분리를 용이하게 합니다.참고: 삼각골 결정망 면에 방해받지 않고 미끄러지면 PVD가 성공한 것으로 간주됩니다. 커터로 후방 히알로이드 멤브레인을 열고 분리된 유리체 스커트를 유리체 베이스(망막 적도)까지 제거합니다. 망막 표면에 남아있는 트리암시놀론을 흡인시합니다. 8. miOCT 유도 포벨 분리 PFCL의 1-2 mL을 주입하여 전방, 중간 주변 망막까지 후방 극을 덮습니다. 피망 주사 캐뉼라로 눈을 입력합니다. Vitrectomy 기계에 IOP를 0-4 mmHg로 설정합니다 (완벽하게 방수 시스템을 보장; 필요한 경우, 포트 주위에 봉합사를 묶어). 25/41 G 사용자 정의 이중 보어 사수 주입 캐뉼라 또는 250 μL 주사기에 연결된 25/38 G 감전 주사 캐뉼라를 사용하여 BSS의 피하 주사를 부드럽게 수행하여 국소화 된 망막 분리를 유도합니다. 일단 흠이 포베아를 교차하면 주사를 중단하십시오. 별도의 방향에서 두 번째 블레브를 만듭니다. 두 블을 병합하여 포베아를 완전히 분리합니다. miOCT 함수를 사용하여 bleb 형성을 시각화합니다. 라인과 큐브 스캔이 설정(512 x 128픽셀, 스캔 폭 4mm)을 사용하여 HD 모드로 되어 있는지 확인하여 포베아에서 이미지를 수집합니다. 포베아의 RPE 층에서 신경 망막의 완전한 분리를 위해 miOCT 이미지를 관찰한다. 망막 절제술을 수직 25 G 유리석 가위로 1.5mm로 확대하여 이식을 위한 피망 공간에 접근할 수 있도록 합니다. 9. 네이티브 RPE 제거 Vitrectomy 기계에 IOP를 50mmHg로 설정합니다. 브러시 실리콘 팁 캐뉼라를 사용하여 활성 압출을 통해 PFCL을 제거합니다. 20G 악기의 입구를 허용하도록 1.4mm 절개 칼로 경화증을 확장합니다. 사용자 지정 20 G 확장 루프 계측기를 사용하여 제거를 위해 서브카반 호스트 RPE를 긁어냅니다. 적어도 2 x 3mm를 측정하는 영역을 긁어 냅니다. 10. RPE 세포 단층 이식의 전달을위한 슈팅 게임의 적재 PET 세포 캐리어의 RPE 배양에서 절단된 총알 모양의 이식편의 적재에 대한 일반적인 지침은 이전 간행물22를 참조하십시오. 11. miOCT 유도 이식 이식 및 위치 조정 20mmHg의 IOP에서 경화증을 통해 슈터 장치의 끝을 삽입합니다. 망막 표면에서 생성된 망막 에지를 통해 임플란트를 적층 공간쪽으로 주입합니다. 브뤼우의 멤브레인을 향한 세포운반선 측과 광수용체를 향한 RPE xenograft 측으로 임플란트를 주입한다. miOCT 함수를 사용하여 임플란트 위치를 시각화합니다. 임플란트가 그대로 오버레이링된 망막과 함께 무수공간에서 브루치의 막에 평평하게 놓여 있는지 확인합니다. 생성된 망토절제술에서 멀리 떨어져 있고 망토절제술 부위에 방해가 되지 않는 적절한 거리에 있는지 확인하십시오. 혈관 분사 캐뉼라 또는 25G 곡선 안구 가위로 임플란트 위치를 조정하여 황반 아래에 잘 배치되도록 합니다. 12. miOCT 유도 감하 유체의 배수 브러시 실리콘 팁 캐뉼라를 사용하여 유체 공기 교환 및 신중한 하수액 배수를 수행합니다. 연실 망막 분리 및 망막 가장자리 압착에서 부드러운 감하 유체 포부를 시도합니다. 망막이 임플란트 위에 다시 부착될 때까지 적절한 침전유체 배수의 실시간 시각화를 위한 miOCT 기능을 활성화합니다. 13. 작업 종료 교체된 7-0 비릴 봉합사를 사용하여 작업 포트 경화증을 닫습니다. 25 G 샹들리에와 25 G 주입 캐뉼라를 제거합니다. 7-0 비릴 봉합사로 이 경화증을 닫습니다. 2 mg에서 0.05 ml의 인트라비티 방부제 프리 트리암시놀론 (40 mg/ml)을 봉합하기 전에 8시 경화증에서 투여하십시오. IOP가 허용 범위 내에 있는지 확인하기 위해 눈을 찌르고 있습니다. 필요한 경우 30G 바늘을 통해 여과 된 공기 (또는 BSS)를 주입하십시오. 결막은 7-0 비릴 봉합사와 5-0 프롤렌으로 캔토절제술을 당부합니다(10-14일 후 제거). 14. 수술 후 동물 관리 NHP는 수술 후 1시간 동안 얼굴을 아래로 향하게 한다. 의식이 회복될 때까지 동물을 방치하지 마십시오. 수술 후 과정에서 수의사와 동물 관리 기술자가 관찰 및 지원을 받을 수 있는지 확인합니다. 국 소 항생제를 적용 (토브라마이신), 스테로이드 (덱사메타손) 연고, 호마트로핀 점안액은 수술 후 5 일 동안 하루에 두 번. 다른 피하 부프레노르핀 (0.005-0.03 mg/kg BW) 주사 6 시간 수술 후 적절한 통증 조절을 관리하십시오. NHP를 다른 동물회사에 반환하는 것은 의식이 완전히 회복된 경우에만 가능합니다. 절차 후 3일, 14일 및 1개월째에 다중 모달 이미징 후속 조치를 실시하고 매월 검진을 실시합니다. 절차 후 매달 ERGs를 수행합니다. 다모달 이미징에 사용되는 퇴사 기간과 동시에 14일째에 칸토절제술을 위한 5-0 prolene 봉합사를 제거하십시오. 나머지 봉합사는 제거가 필요하지 않은 7-0 비릴 봉합사를 다시 굴절할 수 있습니다. 15. 멀티모달 이미징을 위한 수술 후 모니터링 방법 하룻밤 사이에 NHP를 빠르게. 이미징 직전에 NHP를 진정시하십시오(약물 및 진정농도의 경우 4.2단계 참조). 식증이 눈의 움직임을 멈추기에 충분하지 않은 경우 전신 마취의 사용을 고려하십시오. 1% 트로피아미드와 2.5% 페닐레프린 점안액을 적용하여 이미징 전에 동공 팽창을 달성하십시오(6.2단계 참조). 55° 필드 렌즈와 30° 필드 렌즈가 있는 고해상도 OCT 기계를 사용하여 자동 불피성(AF), 펀더플루오레세신 혈관 조영술(FFA), 광학 일관성 단층 촬영(OCT)을 수행합니다. FFA에 대한 정맥 내 10 % 형광실 (0.1 mL / kg BW)을 투여하십시오. 초기 위상 이미지를 얻으려면 30초 이내에 있는 이미지를 캡처합니다. 후반 단계 이미지의 경우 주입 후 5-10분 후에 이미지를 캡처합니다. FFA의 초기 단계와 후반 단계 사이의 fundus 카메라를 사용하여 fundus 사진을 수행합니다. 16. 전장 전전경(ERG) 연구를 위한 수술 후 모니터링 방법 하룻밤 사이에 NHP를 빠르게 할 수 있습니다. ERG 연구 전에 NHP를 진정시하십시오(약물 및 진정농도의 경우 4.2단계 참조). ERG 녹음 전체에서 적절한 경우 식기를 다시 관리합니다. 최소 2-3일 간격으로 다중 모달 이미징 및 ERG 레코딩을 분리합니다. 진정되면 ERG 녹화 전에 NHP가 30분 동안 어둡게 조정되었는지 확인합니다. 스테인레스 스틸 피하 바늘 전극을 왼쪽및 오른쪽 측면 캔티(참조 전극)와 NHP 본체(접지 전극)의 뒷면에 배치합니다. 접촉 및 접착력을 돕기 위해 vidisic 젤을 사용하여 NHP 각막에 ERG 콘택트 렌즈 전극을 배치합니다. 비전의 임상 전기 생리학을 위한 국제 학회 (ISCEV)14에 대한 국제 학회에 의해 추천된 인간 프로토콜에 모든 ERG 시험을 기초하십시오. scotopic 조건에서 ERG 레코딩을 시작하고 조광홍색 깜박임부터 시작합니다. 권장되는 상호 자극 간격에 대한 ISCEV 권장 사항을 따르십시오. 배경 강도에 대한 표준 ISCEV 권장 사항을 사용하여 광사진 테스트 전에 10 분 동안 NHP가 빛으로 조정되었는지 확인하십시오. 17. NHP의 안락사 enucleationNHP를 안락사시키기 위하여는, 미국 수의학 협회의 안락사에 위원회에 의해 추천된 대로 정맥 성 나트륨 pentobarbital (75 mg/kg)를 관리하십시오.