ヒト以外の霊長類モデルにおける変性網膜疾患の網膜色素上皮移植

注:すべての動物実験は、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚・眼科研究協会(ARVO)に従って行われました。シンガポールのSingHealthの施設動物管理使用委員会から倫理の承認を得ました。動物は、実験動物ケアの評価と認定協会(AAALAC)によって承認されたSingHealth実験医学センターに収容されました。この承認は、すべての動物実験がシンガポールのアグリ食品獣医局が定めた国立実験動物研究諮問委員会のガイドラインの基準に準拠していることを強調しています。以下の実験プロトコルは、6 マカカのファシキュラリス (4雄と2人の女性、4〜6歳、2.8〜4.0キロ)の6目で行われた実験に基づいて確立された 。 1. NHPモデルにおける免疫抑制の実現 手術の7日前に免疫抑制を開始し、フォローアップ期間を通して免疫抑制を継続します。 正確な投薬量を確保するために、全身性免疫抑制の投与前にNHPを比較検討してください。動物はベースラインで重量を量り、その後毎週体重を量る。 全身性免疫抑制を達成するために経口シロリムス、ドキシサイクリン、およびミノサイクリンを使用してください。 1 mg の毎日の維持投与に続いて経口シロリムスの 2 mg の負荷量を投与します。.投与前にベースライン血液シロリムスレベルを取得し、フォローアップ期間を通じてこれを監視します。適切な免疫抑制のために、少なくとも5μg/Lの濃度を確保してください。注:シロリムス用量は体重適応ではありません。 1日あたり7.5mg/kgの経口ドキシサイクリンを1日2回投与する。 1日あたり7.5mg/kgの経口ミノサイクリンを投与し、1日に2回投与する。 免疫抑制の間、すべてのNHPに有害な全身効果を監視します。体重の大幅な減少(>10%)、食欲と水の消費量の減少、手入れの行きのない脱毛、攻撃性や無気力などの異常な行動を探してください。評価は3日目、14日、1ヶ月に行われ、その後毎月の評価が行われます。 2. 器械の殺菌 蒸留水を使用して手術器具をすすいでください。 500 mLの蒸留水と2 mLの器械消毒剤で満たされた超音波浴に器械を置く。超音波浴のスイープ機能を使用して15分間、器具を清掃してください。 超音波浴から器具を取り外します。蒸留水を2回徹底して、各洗い流しを5分間洗い流します。すすがりの後に器具を空気乾燥させます。 計器を計器ボックスに入れます。ユニバーサルプログラム設定(134°Cで50分間の器具の滅菌:オートクレーブ用30分、乾燥用20分)を使用して箱をオートクレーブします。 3. 防腐剤フリートリアムシノロン(40mg/mL)の調製 1 mL シリンジを使用して、トリアムシノロン溶液 (10 mg/mL) の 1 mL を引き出します。それを15 mLの円錐形の管に移し、4 mLの無菌バランス塩溶液(BSS)と混ぜます。 120× g で5分間遠心します。すべてのトリアムシノロン粒子が円錐管の底にあることを確認してください。円錐管から上清(BSS)を捨てます。 トリアムシノロン粒子を5 mLの無菌BSSを円錐管に再懸濁させる。120× g で5分間の溶液を遠心分離します。上清をもう一度捨てます。 ステップ 3.3 を繰り返して、トリアムシノロン粒子の BSS (3x) の洗浄を完了します。 トリアムシノロン粒子を0.25 mLの無菌BSSで再懸濁し、40mg/mLの濃度を達成する。 再懸濁したトリアムシノロン(40mg/mL)を新しい1 mLシリンジで吸引する。25Gの鈍い先端のフルート針を取り付け、トリアムシノロン溶液で注射器を術中使用の準備を整えます。 4. 硝子体内プラスミノーゲン(0.25 μL)によるNHP眼前処理 手術の1週間前に、サルプラスミノーゲン(0.25 μg/μL)のビトリアルインジェクション(20 μL)を投与します。 ケタミンの筋肉内注射(10-20 mg/kg BW)およびアトロピン(0.05 mg/kg BW)の皮下注射で処置の前にNHPを鎮静する。局所麻酔用テトラカイン点眼薬を投与する。 ビトリアル注射の前に、10%ポビドネヨウ素で眼窩周囲領域を消毒する。NHPの結膜に5%ポビドネヨウ素を投与することにより眼を消毒する。溶液が滅菌BSSで十分に洗い出す前に、少なくとも1分間フォルニスに留まるようにしてください。 250 μL のシリンジを使用して、あらかじめ希釈されたサルプラスミノーゲン(0.25 μg/μL)をバイアルから吸引します。注射器に30G針を取り付け、サルのプラスミノーゲンをビジトリアル投与の準備を整える。 目の注射部位を識別するためにキャリパーのペアを使用します。四肢から3mm離れたところに対するビトリアル内注射を投与する。 針を地球の中心に向けて注射を進めます。針を地球から取り出す際には、綿アプリケータースティックを使用して注入部位をタンポネードし、眼内内容物の逆流を防ぎます。 潤滑剤ゲルまたは軟膏を投与して、術後眼表面刺激を即座に軽減します。 5. 手術台と機器のセットアップ 滅菌場を確立します。無菌の分野では、外科用スクラブ、マスク、ヘアカバーを常に着用してください。 防腐剤を含まないトリアムシノロン(40mg/mL)を準備し、口腔内のビリゾアの可視化を行います(セクション3参照)。5 mL シリンジで 10 mL の注射器と潤滑剤に無菌 BSS を準備します。ドレープの上に置きます。 3-0シルク、7-0のvicryl縫合糸、綿アプリケータスティック、創傷閉鎖ストリップ、シャンデリア内照明繊維ワイヤーなど、ドレープに他の機器を用意してください。 高速ビトレクター、ベンチュリカセット、25Gシャンデリアエンドイルルミネターを含む、生殖器技術を使用して、vitttomyのセットを、ヴィトレクトミのマシンに接続します。 500 mLの眼科グレードのBSSボトルを開き、メーカーの指示に従ってベンチュリカセットに接続します。システムのプライミングを続行します。 miOCT/手術用顕微鏡のスイッチを入れます。後部区分の外科および照明のための外科顕微鏡の事前設定された構成を選びなさい。ID、性別、動物の目の横性、手順の名前など、手順の詳細を入力します。 非接触、広角、128度の眼深度レンズを取り付けます。 手術用顕微鏡/miOCTに無菌使い捨てハンドピースカバーを取り付けます。フットペダルを使用して、顕微鏡の位置とフォーカスを調整します。手術を進める。 6. 動物の麻酔と位置の調製 (好ましくは獣医チームによって行われる) 逆流や嘔吐を防ぐために、麻酔の誘導前にNHPが少なくとも8時間断食されていることを確認してください。麻酔の誘導前にNHPを鎮静する(鎮静指示のステップ4.2を参照)。 1%の熱帯アミドと2.5%フェニレフリン点眼薬を5分間隔で少なくとも3倍塗布し、瞳孔拡張を達成する。 鎮痛を達成するために手術前にブプレノルフィン(0.005-0.03 mg/kg BW)の30分の筋肉内注射を投与する。 気管チューブ(通常3~5mm)でNHPを挿管します。挿管を試みる場合は、複数のサイズが使用可能であることを確認します。外傷を引き起こすことなく喉頭を通過できる最大のサイズを使用してください。末端の潮汐CO2を測定して、気管内チューブの適切な配置を確保します。 気管チューブを介して2%のイソフルオランガスを送達し、全身麻酔を誘発する。音やタッチを含む周囲の刺激に対するNHPの反応を評価することによって、全身麻酔の状態(触覚に対する応答の欠如)を確認します。全身麻酔の状態を維持するために0.5〜2%のイソフルオランガスを使用してください。 手術中のNHP心電図、呼吸数、血圧、酸素飽和度を継続的に監視します。 眼が外科用顕微鏡に対して垂直になるように、手術台の上にNHPを置く。麻酔中の眼表面刺激を軽減するために手術されていない潤滑剤ゲルまたは軟膏を眼に投与する。 はさみを使ってまつげを切って感染の可能性を減らします。 10%ポビドネヨウ素で眼窩周囲領域を消毒する。NHPの結膜に5%ポビドネヨウ素を投与することにより眼を消毒する。溶液が滅菌BSSで十分に洗い出す前に、少なくとも1分間フォルニスに留まるようにしてください。 前カット開口部が手術を受けるために目の上に中央に置くように、無菌ドレープを配置します。粘着性外科切開ドレープで目を覆います。 眼の上で横管間間術術を行い、手術を受ける。 リーバーマン鏡を挿入して、眼の可視化のためにまぶたを十分に開きます。 7. ヴィトレミトミー 注:PET-足場RPE移植片の送達のための副レチナル空間にアクセスするために、このプロトコルは、標準的なビトレチナル外科セットアップと非接触、広角、128°ファンダスレンズを使用して実行される4ポート(バルブ)25 Gビトレクトミーを推奨しています。このプロトコルはまた、窩の剥離の誘導、RPE移植片の移植、および網膜下液排液を含むいくつかの重要な外科的ステップを導くためにmiOCTを装備した外科顕微鏡の使用を推奨する。 バンナハサミを使用して、手足の近くの結膜を切開することによって360°結膜周囲を行います。鈍い解剖を行うことによって、腹間術を拡大する。 25Gマイクロビトレオレティナルブレードを使用して、右目の場合は8時、左目では4時に硬化切開術を行います。眼の手足から3mmの硬化を行います。 7-0ビクリル縫合糸を使用して25Gカスタム側ポート注入カニューレを挿入および縫合する。ビトリアル内の位置を確認した後、BSS注入を開始し、20mmHgのIOPを維持するようにシステムを設定します。 25 G の平らなヘッド トロチャーを使用して、右目の場合は 2 時、左目は 10 時に、手順 7.2 のように硬化を行います。 25Gシャンデリアライトをフラットヘッドトロチャーに挿入し、粘着テープで固定します。光源を約60%に調整します。 右目の場合は10時、左目では2時に、ステップ7.2と同様に別の強膜切断術を行います。結び目を結ぶことなく、硬化性の周りにU字型のvicryl 7-0縫合糸を配置します。この強膜切開術を通して、ビトレクトミーカッターチップを挿入します。 エントリーポートの周囲でvit>tmymyを開始し、続いて短いコアのvit>tmymymyを次の設定で開始します:最大5000カット/分、最大吸引回数は400 mmHgです。 20~50 μL のトリアムシノロン(40 mg/mL)を注入して、より良いビリゾアブルを実現します。 網膜から亜大体を分離することによって後部膜外剥離(PVD)を誘導する。 PVDの穏やかな誘導を可能にするために、光ディスクの上にビトレクターを置きます。切断を伴わずに、最大400 mmHgの吸引でのみヴィトレターを維持します。 必要に応じて、25 Gの眼内鉗子を使用して、ディスクマージンで腹膜を操作し、膜皮質に裂傷を作り出し、剥離を容易にします。注:PVDは、トリアムシノロン結晶が、反射面に妨げられずに滑空した場合に成功したと考えられます。 カッターで後舌膜を開き、取り外した膜状のスカートを、(網膜赤道)まで取り外します。残りのトリアムシノロンを残り、残りは、残り、残りは、その表面に吸引する。 8. miOCT誘導子葉剥離 PFCLの1-2 mLを注入して、後部ポールを前部、中周性のレチナまで覆います。 眼下注射カニューレで眼を入る。Vit>ttmyマシンでIOPを0-4 mmHgに設定します(完全に水密なシステムを確保し、必要に応じてポートの周りに縫合を結びます)。 250 μL シリンジに接続された 25/41 G カスタマイズされたデュアルボア副レチナル注射カニューレまたは 25/38 G サブレチナル注射カニューレを使用して、BSS の副レチナル注射を穏やかに行い、局所的な網膜剥離を誘発します。ブレブが窩を横切ったら、注射を止める。別の方向から 2 番目のブレブを作成します。両方のブレブをマージして、フォビアを完全に取り外します。 miOCT 関数を有効にして、ブレブ形成を視覚化します。ラインスキャンとキューブスキャンが、フォビアで画像を取得するための設定(512 x 128ピクセル、幅4mm)でHDモードになっていることを確認します。miOCT画像を観察して、窩のRPE層から神経網膜を完全に剥離します。 移植のための副腎皮領域へのアクセスを可能にするために垂直25 Gのビトレオレチナルはさみで1.5mmにレチノミ術を拡大する。 9. ネイティブ RPE の除去 Vit>t2 マシンで IOP を 50 mmHg に設定します。 ブラシをかけたシリコーンチップカニューレを使用して、アクティブな押し出しでPFCLを取り外します。 1.4mmの切開ナイフで硬化切開を延長し、20Gの楽器の入り口を可能にします。 カスタム 20 G 拡張可能ループインストゥルメントを使用して、取り外しのために、macular ホスト RPE をスクレイピングします。少なくとも2 x 3 mm の面積を削ります。 10. RPE細胞単層移植の送達のための射手のロード PET細胞キャリア上のRPE培養物から切り取られた弾丸状の移植片のローディングに関する一般的な指示については、前の出版物22を参照してください。 11. miOCT誘導移植と位置調整 シューティングデバイスの先端を20mmHgのIOPで硬化切れに挿入します。レティナル表面から作成されたレティノミ術の縁を介して、眼下腔に向かってインプラントを注入する。 ブルッフの膜に面した細胞キャリア側と、感光体に面したRPE異種移植片側にインプラントを注入します。 miOCT機能を有効にして、インプラントの位置を視覚化します。インプラントが下レチナル空間のブルッフの膜に平らに置かれていることを確認し、無傷で上に残るレチナを持っていることを確認してください。作成されたレティノトミーから離れた合理的な距離にあり、レティノミサイトに影響を与えないようにしてください。 受胎前注射カニューレまたは25G湾曲した眼内はさみでインプラント位置を調整し、黄斑の下に十分に配置されるようにします。 12. miOCT誘導下流域液の排水 ブラシをかけたシリコーンチップカニューレを使用して、流体空気交換と慎重な亜レチナル液の排水を行います。ブレブ網膜剥離および網膜切除エッジアポジメントから穏やかな網膜下流体吸引を試みる。 インプラント上にレティナが再び付着するまで、適切な副レチン流体排液のリアルタイム可視化のためのmiOCT機能を有効にします。 13. 操作の終了 7-0のvicryl縫合を使用して、作業用ポートの硬化性を閉じます。25Gシャンデリアと25G注入カニューレを取り外します。7-0のvicryl縫合糸でこれらの強結膜を閉じます。 8時の硬化切開術で、0.05mlの0.05mlの細胞内防腐剤フリートリアムシノロン(40mg/ml)を縫合する前に投与する。 IOPが許容範囲内であることを確認するために、目を触視します。必要に応じて、30G針を介してフィルタされた空気(またはBSS)を注入します。 結膜を7-0の近傍縫合糸で縫合し、5-0プロレンでカントートミー(10-14日後に除去する)。 14. 術後動物のケア NHPの顔を下に1時間の手術後に置きます。意識が取り戻されるまで、動物を放置しないでください。術後のプロセス中に獣医師および動物ケア技術者が観察とサポートを受けられるようにします。 局所抗生物質(トブラマイシン)、ステロイド(デキサメタゾン)軟膏、およびホマトロピン点眼薬を1日2回、術後5日間塗布する。 十分な疼痛制御のために手術後に別の皮下ブプレノルフィン(0.005-0.03 mg/kg BW)注射6時間を投与する。 NHPを他の動物の会社に戻すのは、意識が完全に回復した場合のみ。 手順の後、3日目、14日、1ヶ月にマルチモーダルイメージングフォローアップを行い、その後毎月の検診を行います。手順の後毎月ERGを実行します。14日目のカントートミーの5-0プロレン縫合糸を、マルチモーダルイメージングに使用される沈め周期と同時に取り除きます。残りの縫合糸は、除去を必要としない7-0のvicryl縫合糸を再ソーブルです。 15. マルチモーダルイメージングの術後モニタリング方法 NHPを一晩で速くします。画像処理の直前にNHPを鎮静する(鎮静のための薬物および濃度についてはステップ4.2を参照)。眼の動きを止めるには十分な場合は、全身麻酔の使用を検討してください。 1%のトロピックアミドと2.5%フェニレフリン点眼薬を適用して、イメージング前に瞳孔拡張を達成する(ステップ6.2参照)。 55°フィールドレンズと30°フィールドレンズを備えた高解像度OCTマシンを使用して、自己蛍光(AF)、眼炎蛍光血管造影(FFA)、光コヘレンストモグラフィー(OCT)を実行します。 静脈内10%フルオレセイン(0.1 mL/kg BW)をFFAに投与する。初期段階の画像を取得するには、射出の 30 s 以内の画像をキャプチャします。遅相画像の場合は、射出後5~10分の画像をキャプチャします。 FFAの初期段階と後期の間にファンダスカメラを使用して眼科写真を実行します。 16. 全界電解電解(ERG)研究のための術後モニタリング法 NHP を一晩で高速にします。ERG研究の前にNHPを鎮静する(鎮静のための薬物および濃度についてはステップ4.2を参照)。ERGの記録全体を通して、適切な場合にセデレーションを再投与する。 マルチモーダルイメージングとERG記録を、少なくとも2〜3日間の間隔で分離します。 鎮静したら、ErG記録の前にNHPが30分間暗く適応していることを確認してください。 ステンレス鋼下皮下針電極を左右横カンティ(参照電極)とNHP本体の背面(接地電極)に配置します。ERGコンタクトレンズ電極を、接触と接着を助けるためにビジシックゲルを使用してNHP角膜に置きます。 すべてのERG試験は、国際臨床電気生理学会(ISCEV)14が推奨するヒトプロトコルに基づいています。発色状態でERG記録を開始し、調光器の点滅から開始します。推奨される刺激間隔に関する ISCEV 勧告に従ってください。 NHPが光のテストの前に10分間光に適応していることを確認し、バックグラウンド強度のための標準的なISCEVの推奨事項を使用して再び。 17. 安楽死 核分のためにNHPを安楽死させるために、米国獣医医師会の安楽死に関するパネルによって推奨されるように、ペントバルビタール(75mg/kg)静脈内ナトリウムを投与する。