Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Ivan Seah; Zengping Liu; Daniel Soo Lin Wong; Wendy Wong; Graham E. Holder; Veluchamy Amutha Barathi; Gopal Lingam; Xinyi Su; Boris V. Stanzel

doi:10.3791/62638

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Tıp

השתלת אפיתל פיגמנט רשתית במודל פרימטים לא אנושי למחלות רשתית ניוונית

Published: June 14, 2021

doi:

10.3791/62638

Ivan Seah*^1,2, Zengping Liu*^1,3,4, Daniel Soo Lin Wong¹, Wendy Wong², Graham E. Holder^1,2,5, Veluchamy Amutha Barathi^1,4,6, Gopal Lingam^1,2,4, Xinyi Su^1,2,3,4, Boris V. Stanzel^1,7,8

¹Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine,National University of Singapore, ²Department of Ophthalmology,National University Hospital, Singapore, ³Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB),Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), ⁴Singapore Eye Research Institute (SERI), ⁵UCL Institute of Ophthalmology, ⁶Academic Clinical Program in Ophthalmology,Duke-NUS Medical School, ⁷Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach,Knappschaft Hospital Saar, ⁸Department of Ophthalmology,University of Bonn

Özet

הפרימט הלא אנושי (NHP) הוא מודל אידיאלי לחקר טיפולי תאי רשתית אנושית בשל הדמיון האנטומי והגנטי. כתב יד זה מתאר שיטה להשתלה תת-עינית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית בעין NHP ואסטרטגיות למניעת סיבוכים תוך ניתוחיים הקשורים למניפולציה מקולרית.

Abstract

השתלת אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) טומנת בחובה הבטחה גדולה לטיפול במחלות ניווניות רשתית תורשתית ונרכשות. תנאים אלה כוללים רטיניטיס פיגמנטוזה (RP) וצורות מתקדמות של ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD), כגון ניוון גיאוגרפי (GA). יחד, הפרעות אלה מייצגות חלק משמעותי של עיוורון שאינו ניתן לטיפול כיום ברחבי העולם. צרכים רפואיים אלה ללא מענה יצרו עניין אקדמי מוגבר בפיתוח שיטות להחלפת RPE. בין המודלים החייתיים המשמשים בדרך כלל לבדיקות פרה-קליניות של טיפולים, הפרימט הלא אנושי (NHP) הוא המודל החייתי היחיד שיש לו מקולה. כפי שהוא חולק דמיון אנטומי זה עם העין האנושית, עין NHP היא מודל בעלי חיים פרה קליני חשוב ומתאים לפיתוח של מוצרים רפואיים טיפול מתקדם (כספומטים) כגון טיפול בתא RPE.

כתב יד זה מתאר שיטה להשתלה תת-עינית של מונולייר RPE, בתרבית על נושאת תאים פוליאתילן טרפתלט (PET), מתחת למקולה על פצע RPE שנוצר בניתוח ב- NHPs מדוכא חיסוני. הגומה – החלק המרכזי של כלי הדם של המקולה – הוא האתר של החולשה המכנית הגדולה ביותר במהלך ההשתלה. טראומת גבעול תתרחש אם הזרקת הנוזל התת-רשתית הראשונית תיצור כוח מוגזם על הרשתית. לפיכך, הזרקה איטית תחת טמפונדה נוזלית perfluorocarbon (PFCL) מומלץ עם צינורית הזרקה תת-יבשתית כפולה בלחץ תוך עיני נמוך (IOP) הגדרות כדי ליצור bleb רשתית.

טיפול מקדים עם הזרקת פלסמינוגן intravitreal כדי לשחרר הידבקויות RPE-photoreceptor parafoveal מומלץ גם. אסטרטגיות משולבות אלה יכולות להפחית את הסבירות לדמעות גומה בהשוואה לטכניקות קונבנציונליות. ה- NHP הוא מודל בעלי חיים מרכזי בשלב הפרה-קליני של פיתוח טיפול בתאי RPE. פרוטוקול זה מטפל באתגרים הטכניים הקשורים לאספקת טיפול תאי RPE בעין NHP.

Introduction

השתלת RPE טומנת בחובה הבטחה גדולה לטיפול במחלות ניווניות רשתית תורשתיות ונרכשות. תנאים אלה כוללים רטיניטיס פיגמנטוזה (RP, ניוון רוד-חרוט) וצורות מתקדמות של AMD כגון GA. באופן קולקטיבי, הפרעות אלה מייצגות חלק משמעותי של עיוורון שאינו ניתן לטיפול כיום ברחבי העולם ^1,2. השלבים המתקדמים של AMD מסווגים ל- AMD ניאו-וסקולרי (nAMD) ו- GA. אמנם יש אפשרויות טיפול יעיל עבור nAMD, כגון זריקות גורם גדילה אנדותל אנטי וסקולרי (אנטי VEGF), חולים עם GA יש אפשרויות טיפול מוגבלות. RP היא קבוצה הטרוגנית מאוד של הפרעות רשתית תורשתית המאופיינת על ידי ניוון קולטני אור רשתית מתקדמת. בחלק מהחולים, הפגם הגנטי הסיבתי ממוקם בתוך RPE ולא קולטני האור; לפיכך, טיפול בתחליפי RPE עשוי להיות אסטרטגיה חלופית אם טיפול גנטי אינו אפשרי.

יש עניין משמעותי בפיתוח טיפולים יעילים עבור תנאים אלה. בפרט, השתלת RPE כבר צובר תאוצה כגישה טיפולית פוטנציאלית3,4,5,6,7,8. מאז הדיווחים הראשונים על השתלת RPE הופיעו בשנות ^{השמונים,} התחום התרחב לכלול מקורות תאי RPE שונים, אסטרטגיות משלוח, ומודלים ניסיוניים של מחלות והשתלות10,11,12,13,14. בין המודלים השונים של בעלי חיים, רק ל- NHP יש ‘מקולה לוטאה’ עם ‘מרכז גומה’, התמחות אנטומית בקוטב האחורי של הרשתית המשותפת לבני אדם. הגומה מכילה צפיפות גבוהה מאוד של קולטני אור חרוט המאפשרים ראייה מרכזית ברזולוציה ^גבוהה15. ל- NHP יש גם איפור גנומי ופרוטאומי ^דומה16 בהשוואה לבני אדם. קווי דמיון אלה הופכים אותו למודל בעלי חיים חשוב ומתאים לחקר מחלות עיניים המשפיעות על הרשתית ^{האנושית17,18}.

כתב יד זה מתאר שיטה להשתלה תת-עינית של קסנוגרפט RPE, הנתמך על ידי נושא תא PET, ב- NHPs מדוכאים. טכניקה טרנס-ויראלית להשתלת RPE תת-רשתית בארנבות תוארה בכתב יד ^קודם19. עם זאת, ב- NHPs, נוכחות הגומה דורשת טיפול מסוים במהלך מניפולציה תוך ^{ניתוחית20}. בפרט, קיים סיכון גבוה של קרע גבעול אם שיטות הזרקת נוזלים subretinal ליצור כוח מוגזם על ^{הרשתית20}. המוקד של כתב יד זה הוא, אם כן, על אסטרטגיות כדי להפחית את הסיכון לטראומה גחמת בשוגג ב- NHP.

אלה כוללים את השימוש של הזרקת פלסמינוגן תוך ניתוחית לשחרור הידבקויות parafoveal וטומוגרפיה קוהרנטיות אופטית משולבת מיקרוסקופ כירורגית (miOCT) תוך ניתוחי להדמיה בזמן אמת של האנטומיה של הגומה. צינורית תת-יבשתית דו-מושבית 25/41 G בהתאמה אישית עם טמפונדה תוך עינית של PFCL תחת הגדרות IOP נמוכות מוצעת כדי לאפשר תהליך מבוקר יותר של ניתוק הגומלין. יתר על כן, הסרה כירורגית של RPE מקומי מומלץ לפני ההשתלה כדי לאפשר שילוב טוב יותר בין תאי RPE מושתלים קולטני אור מארח. לבסוף, פרוטוקול דיכוי חיסוני מערכתי פרי ולאחר הניתוח עבור מודלים של NHP מתואר כדי לשפר את ההישרדות של קסנוגרפט RPE לאחר ההשתלה11,21.

Protocol

הערה: כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לאיגוד המחקר בראייה ורפואת עיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. אישור אתיקה התקבל מהוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש, SingHealth, סינגפור. בעלי חיים שוכנו במרכז הרפואה הניסיונית SingHealth שאושר על ידי האגודה להערכה והסמכת טיפול בבעלי חיים במעבדה (AAALAC). אישור זה מדגיש כי כל הניסויים בבעלי חיים עומדים בסטנדרטים של הנחיות הוועדה המייעצת הלאומית לחקר בעלי חיים במעבדה שנקבעו על ידי הרשות למזון חקלאי ווטרינרי של סינגפור. הפרוטוקול הניסיוני הבא הוקם על סמך ניסויים שנערכו ב -6 עיניים של 6 פשיזם מקאקה (4 זכרים ו -2 נקבות, בני 4 עד 6, 2.8 עד 4.0 ק”ג) . 1. השגת דיכוי חיסוני במודל NHP התחל את הדיכוי החיסוני 7 ימים לפני הניתוח ולהמשיך דיכוי חיסוני לאורך כל תקופת המעקב. שקול את NHP לפני מתן דיכוי חיסוני מערכתי כדי להבטיח מינון תרופות מדויק. החיה נשקלת בקו הבסיס ובשבועון לאחר מכן. השתמש sirolimus אוראלי, דוקסיציקלין, מינוציקלין, כדי להשיג דיכוי חיסוני מערכתי. לנהל מינון טעינה של 2 מ”ג של sirolimus אוראלי ואחריו מינון תחזוקה יומי של 1 מ”ג. להשיג את רמת סירולימוס הדם הבסיסי לפני מתן ולפקח על זה לאורך כל תקופת המעקב. להבטיח ריכוז של לפחות 5 מיקרוגרם / L עבור דיכוי חיסוני נאות.הערה: מינון Sirolimus אינו מותאם למשקל. לנהל מנה של 7.5 מ”ג/ק”ג של דוקסיציקלין אוראלי ליום, פעמיים ביום. לנהל מנה של 7.5 מ”ג/ק”ג של מינוציקלין אוראלי ליום, פעמיים ביום. במהלך דיכוי חיסוני, לפקח על כל NHPs עבור השפעות מערכתיות שליליות. חפש ירידה משמעותית במשקל הגוף (>10%), ירידה בתיאבון וצריכת מים, נשירת שיער לא מרווחת, והתנהגות חריגה כגון תוקפנות ועייפות. ההערכות ייעשו ביום 3, 14 וחודש, ולאחר מכן הערכות חודשיות. 2. עיקור מכשירים יש לשטוף את המכשירים הכירורגיים באמצעות מים מזוקקים. מניחים את המכשירים באמבטיה קולית מלאה עם 500 מ”ל של מים מזוקקים ו 2 מ”ל של חומר חיטוי מכשירים. לנקות את המכשירים באמצעות פונקציית לטאטא של האמבטיה הקולית במשך 15 דקות. הסר את המכשירים מהאמבטיה הקולית. יש לשטוף פעמיים ביסודיות במים מזוקקים למשך 5 דקות כל שטיפה. ייבשו את המכשירים באוויר לאחר השטיפה. מניחים את הכלים בקופסת כלים. Autoclave את התיבה באמצעות הגדרת התוכנית האוניברסלית (עיקור של מכשירים ב 134 °C (50 °F) במשך 50 דקות: 30 דקות עבור autoclaving, 20 דקות לייבוש). 3. הכנת טרימצינולון ללא חומרים משמרים (40 מ”ג/מ”ל) באמצעות מזרק 1 מ”ל, למשוך 1 מ”ל של פתרון triamcinolone (10 מ”ג / מ”ל). מעבירים אותו לצינור חרוטי של 15 מ”ל ומערבבים אותו עם 4 מ”ל של תמיסת מלח סטרילית מאוזנת (BSS). צנטריפוגה הפתרון ב 120 × גרם במשך 5 דקות. ודא שכל חלקיקי הטרימצינולון נמצאים בתחתית הצינור החרוטי. השליכו את הסופר-נאנט (BSS) מהצינור החרוטי. להשעות מחדש את חלקיקי triamcinolone עם 5 מ”ל של BSS סטרילי בצינור החרוטי. צנטריפוגה הפתרון ב 120 × גרם במשך 5 דקות. תזרוק את הסופר-נאנט שוב. חזור על שלב 3.3 כדי להשלים את הכביסה של חלקיקי triamcinolone עם BSS (3x). להשעות מחדש את חלקיקי triamcinolone עם 0.25 מ”ל של BSS סטרילי כדי להשיג ריכוז של 40 מ”ג / מ”ל. שאפו את הטריאמצינולון המושעה מחדש (40 מ”ג/מ”ל) עם מזרק חדש של 1 מ”ל. חבר מחט חליל קהה 25 גרם, ולשמור על המזרק עם פתרון triamcinolone מוכן לשימוש תוך ניתוחי. 4. טיפול מקדים של עיני NHP עם פלסמיניוגן תוך-ויטמין (0.25 מיקרוגרם/μL) שבוע לפני הניתוח, לנהל זריקה intravitreal (20 μL) של פלסמיניוגן קוף (0.25 מיקרוגרם / μL). להרדים את NHP לפני ההליך עם הזרקה תוך שרירית של קטמין (10-20 מ”ג / קילוגרם BW) וזריקה תת עורית של אטרופין (0.05 מ”ג / קילוגרם BW). יש לתת טיפות עיניים לטטרקאין להרדמה מקומית. לפני הזרקה תוך-ויטמית, לחטא את האזור periorbital עם 10% povidone-יוד. לחטא את העין על ידי מתן 5% povidone-יוד לנוזלים הלחמית של NHP. ודא שהפתרון נשאר בפורים לפחות 1 דקות לפני שטיפה יסודית עם BSS סטרילי. השתמש מזרק 250 μL לשאוף את פלסמינוגן קוף prediluated (0.25 מיקרוגרם / μL) מן הבקבוקון. חבר מחט 30 G למזרק, ולשמור על פלסמינוגן קוף מוכן לניהול intravitreal. השתמש בזוג כיול כדי לזהות את אתר ההזרקה בעין. לנהל את הזריקה התוך-צדדית במרחק 3 מ”מ מהלימבוס. המשך עם הזריקה עם המחט מכוונת לכיוון מרכז הגלובוס. עם הסרת המחט מהגלובוס, השתמש במקל אפליקטור כותנה לטמפונד באתר ההזרקה ולמנוע ריפלוקס של התוכן התוך עיני. יש לתת ג’ל חומר סיכה או משחה כדי להפחית גירוי מיידי בפני השטח של העין לאחר הניתוח. 5. הגדרת שולחן כירורגי וציוד להקים שדה סטרילי. כאשר בשדה הסטרילי, ללבוש סקראבס כירורגי, מסכה, כיסוי שיער בכל עת. הכן את הטריאמצינולון ללא חומרים משמרים (40 מ”ג/מ”ל) להדמיה תוך ניתוחית של זגוגית (ראה סעיף 3). הכינו את ה-BSS הסטרילי במזרק של 10 מ”ל וחומר סיכה במזרק של 5 מ”ל. מניחים אותם על וילון. שמור על מכשירים אחרים מוכנים על וילון, כולל 3-0 משי, 7-0 תפרי ויקריל, מקלות אפליקטור כותנה, רצועות סגירת פצעים, חוט סיבי אנדוילציה נברשת. חברו את ערכת הנברשת vitrectomy, כולל vitrector במהירות גבוהה, קלטת Venturi, ואת אנדוילומינטור נברשת 25 G למכונת vitrectomy באמצעות טכניקה סטרילית. פתח בקבוק BSS באיכות עיניים 500 מ”ל וחבר אותו לקסטה של ונטורי בהתאם להוראות היצרן. תמשיך עם התחלה של המערכת. הפעל את המיקרוסקופ miOCT / כירורגי. בחר תצורות מוגדרות מראש של המיקרוסקופ הכירורגי לניתוח ותאורה של מקטע אחורי. הזן את פרטי ההליך, כולל תעודת זהות, מין, רוחביות של עין החיה ושם ההליך. התקן עדשת פונדוס ללא מגע, בעלת זווית רחבה ו-128 מעלות. חברו כיסויים סטריליים חד פעמיים למיקרוסקופ הכירורגי/miOCT. התאם את מיקום המיקרוסקופ ואת המיקוד באמצעות דוושת כף הרגל. תמשיך בניתוח. 6. הכנת הרדמה ומיצוב של החיה (רצוי מבוצע על ידי צוות וטרינרי) ודא NHP הוא צום לפחות 8 שעות לפני אינדוקציה של הרדמה כדי למנוע regurgitation והקאות. להרדים את NHP לפני אינדוקציה של הרדמה (ראה שלב 4.2 עבור הוראות הרגעה). החל 1% טרופיקמיד ו 2.5% פנילפרין טיפות עיניים לפחות 3x עם מרווחי 5 דקות כדי להשיג התרחבות אישון. לנהל הזרקה תוך שרירית של buprenorphine (0.005-0.03 מ”ג / קילוגרם BW) 30 דקות לפני הניתוח כדי להשיג משככי כאבים. לצנרר את NHP עם צינור אנדוטרכאלי, בדרך כלל 3-5 מ”מ בגודל. בעת ניסיון לצנרור, ודא שמספר גדלים זמינים. השתמש בגודל הגדול ביותר שניתן להעביר דרך הגרון מבלי לגרום לטראומה. מדוד סוף גאות ושפל CO2 כדי להבטיח מיקום מתאים של צינור אנדוטרכאלי. לספק 2% גז איזופלואורן באמצעות צינור אנדוטרכאל כדי לגרום להרדמה כללית. אשר את מצב ההרדמה הכללית (חוסר תגובה למגע) על ידי הערכת תגובת ה- NHP לגירויים שמסביב, כולל צלילים ומגע. השתמש 0.5-2% גז איזופלואורן כדי לשמור על מצב של הרדמה כללית. ניטור רציף של אלקטרוקרדיוגרמה NHP, קצב נשימה, לחץ דם ורוויה חמצן במהלך הניתוח כולו. מקם את ה- NHP על שולחן הניתוחים כך שהעין תהיה מאונכת למיקרוסקופ הכירורגי. תן ג’ל חומר סיכה או משחה לעין, אשר אינו מנותח על מנת להפחית גירוי משטח העין במהלך הרדמה. חותכים את הריסים באמצעות מספריים כדי להפחית את הסיכוי לזיהומים. לחטא את האזור periorbital עם 10% povidone-יוד. לחטא את העין על ידי מתן 5% povidone-יוד לנוזלים הלחמית של NHP. ודא שהפתרון נשאר בפורים לפחות 1 דקות לפני שטיפה יסודית עם BSS סטרילי. מקם וילון סטרילי כך שהפתח החתוך מראש מרוכז מעל העין כדי לעבור ניתוח. לכסות את העין עם וילון חתך כירורגי דבק. בצע קנטוטומיה לרוחב על העין כדי לעבור ניתוח. הכנס את הספקולום של ליברמן כדי להבטיח פתיחה נאותה של העפעפיים להדמיה של העין. 7. ויטרקטומיה הערה: כדי לגשת לשטח התת-יבשתי לאספקת שתל RPE של פיגום PET, פרוטוקול זה ממליץ על 4 יציאות (שסתום) 25 G vitrectomy להתבצע באמצעות התקנה כירורגית vitreoretinal סטנדרטית ללא מגע, זווית רחבה, 128 ° fundus עדשה. הפרוטוקול ממליץ גם על שימוש במיקרוסקופ כירורגי המצויד ב- miOCT כדי להנחות מספר שלבים כירורגיים קריטיים, כולל אינדוקציה של ניתוק הגומה, השתלת שתל RPE וניקוז נוזלים תת-יבשתי. בצע פריטום הלחמית 360 ° על ידי חתך הלחמית ליד הלימבו באמצעות זוג מספריים vannas. הגדל את הפריטטומיה על-ידי ביצוע ניתוח בוטה. באמצעות להב microvitreoretinal 25 G, לבצע sclerotomy בשעה 8 עבור העין הימנית או 4: 00 עבור העין השמאלית. בצע את sclerotomy 3 מ”מ מן הלימבוס של העין. הכנס ותפר צינורית חיצונית מותאמת אישית 25 גרם בצד פורט-עירוי באמצעות תפר 7-0 vicryl. לאחר אישור המיקום התוך-תכליתי, הפעל את עירוי ה- BSS והגדר את המערכת לשמירה על IOP של 20 מ”מ כספית. באמצעות טרוצ’אר ראש שטוח 25 גרם, בצע sclerotomy בשעה 2 עבור העין הימנית או 10 בערב עבור העין השמאלית, כמו בשלב 7.2. הכנס את אור הנברשת 25 G לתוך trochar שטוח הראש ולאבטח אותו עם סרט דביק. כוונן את מקור האור לכ-60%. בצע sclerotomy אחר, בדומה לשלב 7.2, בשעה 10 עבור העין הימנית או 2: 00 עבור העין השמאלית. מניחים ויקריל בצורת U 7-0 תפרים סביב sclerotomy מבלי לקשור את הקשרים. הכנס את קצה חותך הגיטרקטומיה דרך הסקלרוטומיה הזו. התחל את vitrectomy סביב יציאות הכניסה, ואחריו vitrectomy הליבה קצרה עם ההגדרות הבאות: מקסימום 5000 חתכים לדקה, שאיפה מקסימלית ב 400 מ”מ כספית. הזרקו 20-50 μL של טריאמצינולון (40 מ”ג/מ”ל) להדמיה זגוגית טובה יותר. לגרום ניתוק זגוגית אחורית (PVD) על ידי הפרדת הגוף הזגוגי מהרשתית. מקם את הויקטור מעל הדיסק האופטי כדי לאפשר אינדוקציה עדינה של PVD. שמור על vitrector רק על שאיפה בסביבה המרבית של 400 מ”מ כספית ללא כל חיתוך מעורב. במידת הצורך, השתמש במלקחיים תוך עיניים של 25 גרם כדי לתפעל את הזגוגית בשולי הדיסק כדי ליצור קרע בקליפת המוח הזגוגית כדי להקל על ניתוק.הערה: PVD נחשב מוצלח אם גבישי triamcinolone להחליק ללא הפרעה על פני הרשתית. פתחו את קרום היאלויד האחורי עם החותך, והסירו את החצאית הזגוגית המנותקת עד לבסיס הזגוגי (בקו המשווה של הרשתית). שאפו כל טרימצינולון שנותר על פני הרשתית. 8. ניתוק גומה מונחה miOCT הזריקו 1-2 מ”ל של PFCL כדי לכסות את הקוטב האחורי עד לרשתית הקדמית, באמצע ההיקפי. הזן את העין עם צינורית הזרקה תת יבשתית. הגדר את ה- IOP ל- 0-4 מ”מ כספית במכונת vitrectomy (להבטיח מערכת אטומה למים באופן מושלם; במידת הצורך, לקשור תפרים סביב היציאות). באמצעות 25/41 G מותאם אישית כפול נשא הזרקת צינוריות או 25/38 G צינורית הזרקה תת-יבשתית מחובר מזרק 250 μL, בעדינות לבצע הזרקה subretinal של BSS כדי לגרום ניתוק רשתית מקומית. ברגע שהפעימה פשוט חוצה את הגומה, לעצור את הזריקה. צור bleb שני מכיוון נפרד. למזג את שני blebs לנתק לחלוטין את הגומה. אפשר לפונקציה miOCT לדמיין היווצרות bleb. ודא שסריקות הקו והקוביות נמצאות במצב HD עם ההגדרות (512 x 128 פיקסלים, רוחב סריקה 4 מ”מ) כדי לרכוש תמונה בגומה. שימו לב לתמונת ה-miOCT לניתוק מלא של הרשתית העצבית משכבת ה-RPE בגומה. הגדל את הרטינוטומיה ל -1.5 מ”מ עם זוג מספריים ויטריורטינאליים אנכיים 25 גרם כדי לאפשר גישה לחלל התת-יבשתי להשתלה. 9. הסרת RPE מקומי הגדר את ה- IOP ל- 50 מ”מ כספית במכונת הגיטרקטומיה. הסר את PFCL באמצעות שחול פעיל באמצעות צינורית קצה סיליקון מוברש. להאריך את sclerotomy עם סכין חתך 1.4 מ”מ כדי לאפשר את הכניסה של מכשיר 20 G. באמצעות מכשיר לולאה מורחב מותאם אישית של 20 G, גרד את RPE המארח התת-עיני להסרה. לגרד שטח המודד לפחות 2 x 3 מ”מ. 10. טעינת היורה למסירה של השתלת Monolayer תא RPE לקבלת הוראות כלליות לגבי טעינת שתל בצורת כדור שנחתך מתרביות RPE במובילים סלולריים PET, עיין בפרסום קודם22. 11. השתלת שתל מונחה miOCT והתאמת מיקום הכנס את קצה התקן היורה דרך sclerotomy ב IOP של 20 מ”מ כספית. הזריקו את השתל לכיוון החלל התת-רשתי דרך קצה הרטינוטומיה שנוצרה מפני השטח של הרשתית. הזרקו את השתל עם צד נושא התא הפונה לממברנה של הברוך ולצד הקסנוגרפט RPE הפונה לצולי האור. אפשר לפונקציית miOCT לדמיין את מיקום השתל. ודא שהשתל מונח על קרום הברוך בחלל התת-יבשתי, עם רשתית מעל שלם. ודא שהוא ממוקם במרחק סביר מן retinotomy שנוצר ולא פוגע באתר retinotomy. התאם את מיקום השתל עם צינורית הזרקת תת-רשתית או מספריים תוך עיניות מעוקלות של 25 גרם כדי להבטיח שהיא ממוקמת היטב מתחת למקולה. 12. ניקוז מונחה miOCT של נוזל תת-יבשתי באמצעות צינורית קצה סיליקון מוברש, לבצע חילופי נוזלים אוויר וניקוז נוזלים תת-יבשתי זהיר. נסה שאיפה עדינה של נוזל תת-רשתי מניתוק רשתית bleb וקצה retinotomy קצה. אפשר את פונקציית miOCT להדמיה בזמן אמת של ניקוז נוזלים תת-רשתי נאות עד שהרשתית מחוברת מחדש מעל השתל. 13. סיום הפעולה סגור את sclerotomy יציאת העבודה באמצעות תפר 7-0 vicryl preplaced. הסר את נברשת 25 גרם ו 25 G צינורית אינפוזיה. סגור את הסקלרוטומיות האלה עם תפרי ויקריל 7-0. לנהל 2 מ”ג ב 0.05 מ”ל של טרימצינולון ללא חומרים משמרים intravitreal (40 מ”ג /מיליליטר) ב 8 o’clock sclerotomy לפני התפירה. מישוש העין כדי להבטיח כי IOP נמצא בטווח המקובל. הזרקו אוויר מסונן (או BSS) באמצעות מחט של 30 גר’ במידת הצורך. תפרו את הלחמית עם תפרי ויקריל 7-0 וקנתוטומיה עם 5-0 פרולין (הסר לאחר 10-14 ימים). 14. טיפול בבעלי חיים לאחר הניתוח מקם את NHP עם הפנים כלפי מטה למשך שעה אחת לאחר הניתוח. אין להשאיר את החיה ללא השגחה עד להכרה. ודא כי וטרינר וטכנאי טיפול בבעלי חיים זמינים לתצפית ותמיכה במהלך התהליך שלאחר הניתוח. החל אנטיביוטיקה אקטואלי (tobramycin), משחה סטרואידים (dexamethasone), טיפות עיניים homatropine פעמיים ביום במשך 5 ימים לאחר הניתוח. לנהל עוד buprenorphine תת עורית (0.005-0.03 מ”ג / קילוגרם BW) הזרקה 6 שעות לאחר הניתוח לשליטה נאותה בכאב. החזר את NHP לחברה של בעלי חיים אחרים רק כאשר הוא חזר להכרה מלאה. בצע מעקב הדמיה רב-מודלית ביום 3, 14 וחודש 1 לאחר ההליך, ולאחר מכן בדיקות חודשיות. בצע ERGs כל חודש לאחר ההליך. הסר את התפרים 5-0 פרולן עבור קנטוטומיה ביום 14 במקביל עם תקופת ההרגעה המשמשת להדמיה מולטימודלית. התפרים הנותרים ניתנים לשינוי, 7-0 תפרי vicryl, אשר אינם דורשים הסרה. 15. שיטות ניטור לאחר הניתוח להדמיה רב-מודאלית מהר NHP לילה. להרדים את NHP ממש לפני הדמיה (ראה שלב 4.2 עבור סמים וריכוז עבור הרגעה). אם הרגעה אינה מספיקה כדי לעצור את תנועת העיניים, שקול את השימוש בהרדמה כללית. החל 1% טרופיקמיד ו 2.5% פנילפרין טיפות עיניים כדי להשיג התרחבות אישון לפני הדמיה (ראה שלב 6.2). בצעו ניתוח אוטומטי (AF), אנגיוגרפיה פלואורסצ’ין של פונדוס (FFA) וטומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית (OCT) באמצעות מכונת OCT ברזולוציה גבוהה עם עדשת שדה של 55° ועדשת שדה של 30°. ניהול תוך ורידי 10% פלואורסצ’ין (0.1 מ”ל / קילוגרם BW) עבור FFA. כדי לקבל תמונת שלב מוקדם, ללכוד תמונה בתוך 30 שניות של הזרקה. לתמונת שלב מאוחר, צלם תמונה 5-10 דקות לאחר ההזרקה. בצע צילום פונדוס באמצעות מצלמת fundus בין השלבים המוקדמים והמאוחרים של FFA. 16. שיטות ניטור לאחר הניתוח למחקרי אלקטרורטינוגרמה שדה מלא (ERG) מהר NHPs לילה. להרדים את NHP לפני מחקרי ERG (ראה שלב 4.2 עבור סמים וריכוז הרגעה). לאורך הקלטות ERG, יש לתת שוב הרגעה בעת הצורך. הפרד הדמיה רב-מודאלית והקלטות ERG עם מרווח של 2-3 ימים לפחות. לאחר ההרחקה, ודאו שה-NHP מותאם בחושך למשך 30 דקות לפני הקלטת ה-ERG. מקם את אלקטרודות המחט התת עורית נירוסטה בקנתי לרוחב שמאל וימין (אלקטרודות התייחסות) ואת החלק האחורי של הגוף NHP (אלקטרודה הקרקע). מניחים את אלקטרודות עדשות המגע ERG על קרנית NHP באמצעות ג’ל vidisic כדי לסייע במגע והידבקות. בסס את כל בדיקות ה- ERG על הפרוטוקולים האנושיים המומלצים על ידי האגודה הבינלאומית לאלקטרופיזיולוגיה קלינית של ראייה (ISCEV)14. התחל הקלטה ERG בתנאים scotopic ולהתחיל עם הבזקי עמעום. פעל בהתאם להמלצות ISCEV עבור מרווחי זמן ביניים מומלצים. ודא שה-NHP מותאם לאור למשך 10 דקות לפני הבדיקה הפוטוגרפית, שוב תוך שימוש בהמלצות ISCEV סטנדרטיות לעוצמת הרקע. 17. המתת חסד של NHP כדי להרדים את NHP עבור enucleation, לנהל נתרן תוך ורידי פנטוברביטל (75 מ”ג /ק”ג), כפי שהומלץ על ידי הפאנל על המתת חסד של האגודה הרפואית הווטרינרית האמריקאית.

Representative Results

שיטות ההדמיה המולטימודליות (צילום פונדוס, הדמיית פונדוס אוטופלואורסצנטית (FAF), אנגיוגרפיה פלואורסצ’ין של פונדוס פלואורסצ’ין (FFA) – טומוגרפיה בשלב מוקדם ומאוחר, וטומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית (OCT)) מדגישות את התכונות של השתלת שתל RPE תת-עינית מוצלחת (איור 1). צילום פונדוס מראה את המיקום של השתלת שתל RPE בגומה ללא הגירה לאורך זמן. הדמיית FAF מראה שינויים מינימליים בהיפר-אוטופלואורסצנטיות (המודגמים על-ידי אזורים לבנים בעצימות גבוהה) החופפים לשתל RPE. FFA בשלב מוקדם ומאוחר אינם מראים דליפה ברורה (המודגמת על ידי אזורים לבנים בעצימות גבוהה הגדלים עם הזמן) המקיפים את שתל ה- RPE. תמונות ראשוניות ביום 3 מציגות פגם בחלון עקב הסרת RPE מקורי לפני השתלת השתלה. תמונות מקולרי OCT מראות את השימור של שכבות הרשתית החיצונית (בפרט, שכבת קולטן האור) מעל שתל RPE ככל שהזמן מתקדם. כתמי המטוקסילין והאאוזין מראים שכבות רשתית שלמות ללא ראיות למיקרו-טארים. שימור השכבה הגרעינית החיצונית מעל הפריפריה של השתל מצביע על כך שתאי ה- RPE מבצעים את תפקידיהם הפיזיולוגיים בשמירה על בריאות קולטני האור. התצוגות התוך עיניות והחיצוניות של הצינורית הדו-דורית 25/41 G מדגישות את המנגנון שבאמצעותו נשלט ה-IOP במהלך הזרקה תת-יבשתית (איור 2). BSS נכנס לחלל התת-יבשתי במהלך הזרקת נוזלים תת-יבשתיים דרך הצינורית המרכזית הארוכה יותר. עלייה משמעותית בלחץ התוך עיני גורמת ל- BSS בתוך חלל הזגוגית לצאת מהעין באמצעות שעמום המתכת הגדול יותר של הצינורית. לאחר מכן BSS נוסע לאורך הצינורית ובסופו של דבר נפלט מיציאת היציאה ליד רכזת הצינורית. כדי להעריך אם הצינורית פועלת כצפוי, ודא שהנוזל זורם מיציאת היציאה ליד רכזת הצינורית. ה-miOCT מאפשר הדמיה של מידות ה-bleb וקריעה פוטנציאלית של הגומה תוך ניתוחית במהלך ניתוק הגומה (איור 3). איור 3A1.A3 מדגיש מארז של bleb עם קרע בגבעול. באיור 3A1, בעוד הבלימה הנחותה נראית מתחת למיקרוסקופ הניתוחי, קשה לדמיין את הקרע. איור 3A2 מציג את קטע האורך של bleb ללא כל קרעים. איור 3A3 מציג קרע בגבעול בעת הערכת החלק האנכי של הבלימה. איור 3B1.B3 מראה bleb שנוצר בהצלחה ללא נוכחות של דמעות. היעדר הידרדרות משמעותית בצורת הגל של ERG מצביע על כך שהתפקוד הגלובלי של קולטני האור של מוט וחרוט נשמר עם קסנוגרפטים תת-יבשתיים של RPE (איור 4). צורות הגל של ERG מראות את הפונקציה הכוללת של הרשתית. בפרט, יש לשים לב לגלים A כדי לקבוע כל אובדן של פונקציית קולטן אור. איור 1: ניתוח לאחר הניתוח בניתוח vivo עם הדמיה רב-מודאלית. (A) הדמיית vivo של השתלת שתל RPE תת-עינית של העין השמאלית (צהובה על צילום פאנדוס) על שיטות הדמיה שונות (משמאל לימין עמודות: צילום פונדוס, autofluorescence, אנגיוגרפיה פלואורסצ’ין fundus fluorescein בשלב מוקדם, פונדוס פלואורסצ’ין אנגיוגרפיה מאוחרת, טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית) עבור נקודות זמן עד 3 חודשים (שורות מלמעלה למטה: ימים 3, 14; חודשים 1, 3). הכוכבית על תמונת הפונדוס מציינת את אתר הרטינוטומיה; החץ המקווקו הלבן מציין את כיוון סריקת הקו. הצורה הצהובה המצוירת בהדמיית פונדוס autofluorescence מדגישה את מיקום ההשתלה. המשולשים הלבנים בתמונות OCT מציינים את הקצוות הצדדיים המתאימים של השתל (בהתאם לסריקת הקו בתמונת הפונדוס הצבעונית). (B) הכתמת המטוקסילין ואאוזין של ההשתלה תחת גומה אטרופית (עקב קרע תוך ניתוחי) עם שכבות המסומנות. סרגלי קנה מידה = 1 מ”מ ב – A (תמונות autofluorescence ו- FA), 200 מיקרומטר ב – A (תמונות OCT) ו- 100 מיקרומטר ב – B. קיצורים: FA = אנגיוגרפיה של פונדוס; OCT = טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית; RGC = שכבת תא גנגליון רשתית; INL = שכבה גרעינית פנימית; ONL = שכבה גרעינית חיצונית; RPE = אפיתל פיגמנט רשתית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: תצוגות תוך-עיניות וחיצוניות של הצינורית הדו-עמומה 25/41 G. (A) מבט תוך עיני על הצינורית הדו-מושבית 25/41 G במהלך יצירת bleb תת-יבשתי. החץ הלבן מצביע על הצינורית המרכזית הארוכה יותר להזרקת תת-רשת. החץ המקווקו מצביע על פתיחת צינורית היציאה שדרכה עובר ה- BSS כדי לצאת מהעין. (B) מבט חיצוני על הצינורית הדו-עמומה 25/41 גרם. הכוכבית מסמנת את יציאת היציאה ליד רכזת הצינורית שממנה מנוקז ה- BSS התוך עיני. קיצור: BSS = פתרון מלח מאוזן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: תמונות מיקרוסקופ תוך ניתוחיות ותמונות miOCT של bleb תת-יבשתי המסובך על ידי קרע בגומה. (A1) תמונת מיקרוסקופ תוך ניתוחית המציגה את המיקום של סריקות אורך (כחול) ורוחב (אדום) בלב עם קרע בגבעול עם קרע בגבעול. (A2) סריקת miOCT אורכית המציגה bleb תת-יבשתי באזור הגומה (חץ צהוב). (A3) סריקת miOCT רוחבית הלוכדת קרע גחמני (ראש חץ לבן), יחד עם רטינוטומיה (כוכבית וbleb תת-יבשתי (חץ צהוב). (ב1) תמונה מיקרוסקופית תוך ניתוחית המציגה את המיקום של סריקות אורך (כחול) ורוחב (אדום) בbleb שנוצר בהצלחה. (ב2) סריקת miOCT אורכית המציגה bleb תת-יבשתי באזור הגומה (חץ צהוב). (ב3) סריקת miOCT רוחבית המציגה bleb תת-רשתי שנוצר בהצלחה עם גומה שלמה עדיפה (יהלום לבן). קיצור: miOCT = טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית משולבת מיקרוסקופ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: ERG של עין מושתלת קסנוגרפט RPE. להערכה הפונקציונלית של הרשתית, הערכות ERG שדה מלא של העין RPE-xenografted המבוצעות בקו הבסיס (שורה עליונה) ו 3 חודשים לאחר ההשתלה (שורה תחתונה) לא להראות שום השפעה משמעותית של השתלת קסנוגרפט RPE על כל משרעת תגובה, תזמון, או צורת גל בתנאים מותאמים כהה או אור מותאם. קיצורים: RPE = אפיתל פיגמנט רשתית; ERG = אלקטרורטינוגרמה; DA = מותאם כהה; לוס אנג’לס = מותאם לאור. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

ישנן שתי גישות עיקריות להיות מוערך להשתלת RPE תת-עינית – הזרקת השעיית RPE והשתלת שתל RPE monolayer. השוואה מפורטת בין שתי השיטות היא מעבר להיקף כתב היד הזה. עם זאת, ההשתלה של שתל RPE monolayer עשוי להיות יתרון כמו תאי RPE מאורגנים יותר monolayer מאשר בהשעיה. תאי RPE בשתל מאורגנים במונוליינר משולב, הדומה לארגון שכבת תאי ה- RPE הפיזיולוגית ומאפשר לתאי RPE המושתלים לבצע את תפקידיהם הפיזיולוגיים. זה מאפשר פרמטרי מינון מדויקים יותר בהשוואה למתלי תאים, שרלוונטיים מאוד לעבודה רגולטורית ולהרחבה תעשייתית.

מסירת שתל תיקון RPE לחלל התת-יבשתי דורשת מניפולציה זהירה של המקולה והכנסה מדויקת של השתל בחלל התת-יבשתי. ההתקדמות הטכנולוגית במיקרו-כירורגיה, כגון miOCT, והבנה טובה יותר של דינמיקת רקמת הרשתית התוך ניתוחית הפחיתו את עקומת הלמידה של הליך זה. בדיון זה, את הרציונלים של ההיבטים הבאים יוסבר: i) הזרקת פלסמינוגן טרום ניתוחי; ii) השימוש ב- miOCT תוך ניתוחי; iii) השימוש בצינורית דו-מושבית מותאמת אישית של 41 G, הגדרות IOP נמוכות ו-PFCL ליצירת bleb תת-יבשתי; iv) גירוד של שכבת התא RPE המקומי לפני ההשתלה; v) השימוש בסירולימוס, טרימצינולון, דוקסיציקלין ומינוציקלין כדי להפחית את דחיית השתל האימונוגני.

זריקות פלסמינוגן טרום ניתוחיות משחררות הידבקויות ברשתית parafoveal
בניסויים הראשונים, זה היה מאתגר לנתק את הגומה עם גל נוזל אחד. בהערכה עם miOCT, התמונות חשפו את הנוכחות של הידבקויות ברשתית החיצונית parafoveal ל- RPE המקומי יחד עם ראיות של טראומה תוך ^{יבשתית20}. הידבקויות אלה אולי הובילו להתרחבות אנכית של הבלם ולא לגל הנוזלים התת-יבשתי שהתפשט לאורך קווי המתאר של הרשתית, וכתוצאה מכך נגרם טראומה מגחמת. פלסמינוגן הוא הקדמה לא פעילה של פלסמין, פרוטאז מיקוד פיברונקטין ולמנין. Ocriplasmin הוא גרסה מהונדסת ביולוגית של פלסמין אנושי, שאושרה על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) וסוכנות התרופות האירופית (EMA) לטיפול במתיחה vitreomacular סימפטומטי עם או בלי חור מקולרי בו זמנית. עם זאת, דיווחים לאחר אישור של התפתחות בצקת ציסטואיד מקולה לאחר הזרקת ocriplasmin הציעו השפעה נרחבת יותר של האנזים על ^{הרשתית23}.

למרות המנגנונים המדויקים לא זוהו, הוצע כי פלסמין יכול להחליש הידבקות ברשתית באמצעות השפלה של אלמנטים מטריצה interphotoreceptor אחראי על הידבקות photoreceptor-RPE24. בפרוטוקול זה, עיני NHP טופלו עם פלסמינוגן intravitreal 1 שבוע לפני הניתוח כדי לשחרר את הידבקויות הרשתית החיצונית parafoveal. תחת ההנחה כי הידבקות photoreceptor-RPE נחלש, כוח נמוך יותר נדרש לנתק את הרשתית הנוירו-חושית, כולל טבעת parafoveal דיסטלי, אשר בדרך כלל מתנגד גל נוזל ^subretinal20. לפיכך, הכוח המנוהל במהלך ניתוק bleb רשתית תוצאות התרחבות של bleb על פני קווי המתאר של הרשתית במקום למתוח את הרשתית משיק. זה מפחית את הסיכון של דמעות גומה. עם זאת, יש לציין כי ההשפעה של פלסמינוגן על הישרדות השתל לטווח ארוך לא נחקר בפרוטוקול זה. מחקרים עתידיים צריכים לנסות לקבוע את האפקט הזה.

miOCT מספק משוב אנטומי כדי להנחות יצירה bleb subretinal, השתלת שתל, ניקוז נוזלים subretinal
מניפולציה תוך ניתוחית ואטראומטית של המקולה היא המפתח להשגת תוצאות השתלה טובות. עם זאת, שינויים מיקרו-מבניים של המקולה הקשורים למניפולציה לא תמיד ניכרים במיקרוסקופ ההפעלה. בהליכים כאלה, miOCT הוא כלי חשוב המספק משוב בזמן אמת, תלת מימדי, תוך ניתוחי של המבנה המקולרי. miOCT שימושי במיוחד במהלך השלבים של ניתוק הגומלין, השתלת שתל, ניקוז של נוזל תת-רשתי באמצעות חילופי נוזלים-אוויר. במהלך ניתוק הגומלין, miOCT יכול לקבוע את הממדים האנכיים והאופקיים של ה- bleb. מיקרוטארים של הגבעול, שייתכן שלא ניתן לדמיין בבירור במיקרוסקופ הכירורגי, יכולים להיות מאושרים על ידי miOCT (איור 3). במהלך השתלת השתל, תמונות miOCT מנחות על ידי הצגת מיקום השתל או קרבתו לגומה, דרך הרשתית המנותקת והשקופה לעתים קרובות פחות. miOCT יכול גם להדגיש אזורים אפשריים של הידבקות ברשתית במהלך תהליך השתלה ^קשה25. לבסוף, בתהליך ניקוז נוזלים subretinal, miOCT יכול להנחות באופן אמין ניקוז נוזלים subretinal עד מגע מלא רשתית-RPE שתל מושגת.

השילוב של צינורית דו-עמומה, הגדרות IOP נמוכות וטמפונדה זגוגית PFCL מפחיתה באופן סינרגטי טראומה מקולרית במהלך יצירת bleb תת-יבשתי
מתיחה משיקה ברשתית ומערבולת נוזלים יכולות להתרחש במהלך הזרקת BSS תת-רשתית לניתוק גפן המוביל לדמעות גומה לא רצויות. כדי לנטרל תופעות אלה, גורמים, כגון המיקום היחסי והמרחק ממרכז הגומה שבו הזריקה מופעלת, נפח הזרקה ומהירות, טמפונדה זגוגית, בחירה של מכשור תת-רשתי, ו- IOP הוכחו כולם כרלוונטיים20,26,27. bleb subretinal עבור ניתוק הגומה צריך להיות ממוקם במיקום רחוק מספיק מן הגומה, כמו מתיחה ברשתית עשוי להיות הגבוה ביותר באתר החניכה ^bleb27. IOP צריך גם להישמר נמוך לאורך כל היצירה של bleb subretinal. כאשר IOP של העין הוא גבוה, עלייה אנכית גבוהה יותר בגודל bleb במקום הרחבה לאורך קווי המתאר של הרשתית הוא ציין, ואילו blebs הם רדודים יותר בלחצים נמוכים ^יותר20. יתר על כן, למרות הזרקה תוך-תכליתית של 50 μL יהיה למעשה להכפיל את IOP בבני ^אדם28, בהתחשב באורך העיניים הקצר יותר ב- NHPs, עליית IOP במהלך הזרקת subretinal יהיה כנראה גבוה ומהיר יותר מאשר בבני אדם. בעוד שרוב מכונות הגיטרקטומיה מתאימות את עצמן לתנודות IOP, ההתאמה אינה בו זמנית אלא תהליך תגובתי המתרחש עם המשך הזרקת הרשתית. לפיכך, ככל שה- IOP גבוה יותר, כך גדל הסיכון של משיכת יתר ברשתית וטראומה גחמת הנובעת מכך. לכן, זה חיוני כדי לשמור על IOP נמוך יציב במהלך הזרקת subretinal.

צינורית תת-יבשתית מסחרית 20/41 G (DORC) או צינורית תת-יבשתית דו-מושבית 25/41 G בהתאמה אישית מומלצת להזרקה תת-יבשתית. הצינורית מאפשרת לנוזל לצאת מחלל הזגוגית בתמורה ל- BSS המוזרק לחלל התת-יבשתי. זה מבטיח את הרגולציה ‘סימולטנית’ של IOP במהלך הזרקת subretinal. באיור 2 ניתן לראות שרטוט של הצינורית הדו-מושבית. לבסוף, PFCL מנוצל כדי להפחית את הסיכון של דמעות גבעול20,26,27. כמו PFCLs, כגון אוקטלין, יש כבידה ספציפית גבוהה יותר, הם מפעילים כוח כלפי מטה על הרשתית במהלך ניתוק ^הגומה29. זה מייצב עוד יותר את תהליך יצירת bleb ניתוק הגומה ומשפר את התרחבות הבלם לאורך קווי המתאר של הרשתית. טכניקה זו שימשה בהצלחה עבור הזרקה תת-רשתית של rtPA בהגדרה של דימום תת-עיני מסיבי עקב ^nAMD30.

הסרת קדם-שתלה של RPE מקורי מאפשרת שחזור של קומפלקס RPE-קולטן פוטורצפטור
יש להסיר את RPE המארח לפני השתלת השתלה. הסיבה לכך היא ששחזור של קומפלקס RPE-photoreceptor נדרש כדי לאפשר להשתלת RPE לבצע את הפונקציות הפיזיולוגיות שלה של תמיכה ^{photoreceptors21}. RPE המארח, אם לא הוסר, עשוי להוות מחסום מכני, אשר מונע את השחזור של קומפלקס זה. זה יכול להיות מוסר או באמצעות הממשל של כימיקלים רעילים RPE או באמצעות אמצעים פיזיים של הסרה. שיטות הסרה כימית כוללות ניהול מערכתי או תת-רשתי של נתרן ^יוד31,32. כמו נתרן יוד גורם ניוון נרחב של קולטני אור, תאי RPE, Choriocapillaris כאשר מנוהל, הרעילות הרשתית והמערכתית שלה מונעת את השימוש בו לניסויים בבני ^אדם32,33. לפיכך, טכניקות תוך ניתוחיות פיזיות עדיפות. שיטות פיזיות שונות הומשו. כאשר נעשה שימוש בשיטות פיזיות, חיוני שהממברנה של הברוך תישאר ללא פגע. מחקרים רבים במבחנה הוכיחו את התלות של הישרדות שתל RPE על ממברנה של ברוך שלם34,35,36.

ניסיונות לפירוק הידראולי קושרו עם הפסקות בממברנה של ברוך, שיעור מוגבר של התפתחות ממברנה אפירטינלית, ו vitreoretinopathy שגשוג, וכתוצאה מכך ניתוק רשתית ^{המתיחה37}. מרית מאובקת יהלומים שהוצעה לפסולת RPE הובילה גם היא לשברים בממברנה של הברוך, וכתוצאה מכך התפשטות תאית מהכורואיד לחלל התת-יבשתי38. מעניין, מכשיר לולאה מותאם אישית יכול להסיר את RPE overlying עם שימור של הממברנה של ברוך בעיני ארנבות וחזירים11,39. הסרת RPE הבסיסי הוא גם שימושי להקמת מודלים בעלי חיים עם RPE ניוון רשתית חיצונית, בדומה לצורה האטרופית המתקדמת של AMD. כאשר אזור מוקד של RPE מוסר מהמקולה, פצע RPE נסגר באמצעות היפרטרופיה של תאי RPE הנותרים. עם זאת, תגובת ריפוי הפצעים הזו קשורה לניוון של השכבה הגרעינית ^{החיצונית40}. בעוד יצירת מודל בעלי חיים היא מעבר להיקף של כתב יד זה, הליך דומה יכול ליצור מודל בעלי חיים של פנוטיפ AMD אטרופי מתקדם לבדיקת טיפולי תאים שמקורם RPE.

השימוש בסירולימוס, טרימצינולון, דוקסיציקלין ומינוציקלין להפחתת דחיית שתל אימונוגני
המרחב התת-רשתי נחשב לאתר בעל זכויות חיסוניות, המתוחזק על ידי מחסום רשתית דם שלם וגורמים ^אחרים41. במחקרים רבים הקשורים להשתלה תת-רשתית של נגזרות תאי גזע עם מחסום רשתית דם שלם, תרופות מדכאות חיסון ממלאות תפקיד זניח בהישרדות ^השתל42. מחסום רשתית הדם החיצונית הוא חשב להיות נוצר על ידי שכבת RPE המקומית ואת הצמתים ההדוקים בין תאי RPE. בעוד הסרת RPE המקומי מאפשר שילוב טוב יותר של RPE מושתל קולטני אור מארח, מחסום רשתית הדם הוא שיבש בתהליך, להגדיל את הסבירות של דחייה חיסונית. באופן קלאסי, תאי T הם מרכזיים בתהליך של דחיית ההשתלה של איברים אחרים כגון הכליה ^והכבד43. לפיכך, משטרי דיכוי חיסוני ראשוניים להשתלת רקמת רשתית היו ממוקדים להפחתת תגובות חיסוניות מסתגלות אלה.

סירולימוס, מטרה מכאניסטית של מעכבי ראפאמיצין, וטקרולימוס, מעכב קלסינורין, הם דוגמאות לתרופות מדכאות חיסון המתמקדות בתגובות חיסוניות אדפטיביות. עם זאת, למרות דיכוי נאות של תאי T, שיעורי ההישרדות של השתל נשארים נמוכים. בנוסף, תאי RPE ידועים לדכא את הפעלת תאי T באמצעות שחרור של גורמים מעכבים ולקדם את הדור של תאי T ^{רגולטוריים44}. לפיכך, זה הפך יותר ויותר ברור כי חסינות אדפטיבית לא יכול להיות התורם היחיד לדחיית ^השתל42. השתלה תת-רשתית של מוצרים תאיים יכולה לגרום להצטברות והפעלה של ^microglia45.

מיקרוגליה הם המקרופאגים של הרשתית. הם מורכבים משתי אוכלוסיות עיקריות: 1) מיקרוגליה פרי וסקולרית של כלי הדם ברשתית הפנימית ו -2) המיקרוגליה בתוך הפרנצ’ימה של רקמת הרשתית. כמו microglia הם חלק מהתגובה החיסונית המולדת, glucocorticoids intravitreal, כגון triamcinolone, יכול לדכא התפשטות בתיווך ^{ציטוקינים46}. דוקסיציקלין ומינוציקלין יכולים גם לדכא הפעלה מיקרוגליאלית ויש לשקול אותם ^47,48. לבסוף, ההבדלים בדחייה החיסונית של אלוגרפטים RPE לעומת קסנוגרפטים אינם מובנים באופן חלקי ⁴⁹. לדוגמה, אלואנטיבודיות נגד תאי RPE פלואוריפוטנטיים המושרים בתאי גזע דווחו בסרום של מודלים לדחייה חיסונית in vivo. עם זאת, תפקידם של נוגדנים אלה ואת החשיבות של דחייה בתיווך נוגדנים בהישרדות השתל עדיין לא ^ידוע50. לפיכך, משטר multidrug ניצול sirolimus לדיכוי של חסינות אדפטיבית ושילוב של triamcinolone, דוקסיציקלין, מינוציקלין עבור דיכוי חסינות מולדת מוצע. משטר זה שימש בהצלחה ארנבות עם תוצאות הישרדות השתל טוב ואפקטים מערכתיים ^{מינימליים11}.

מגבלות של טכניקה כירורגית זו
מאמר זה מתאר שיטה כירורגית אפשרית כדי לספק גיליון שתל RPE לתוך החלל התת-יבשתי של NHP; עם זאת, אין זה אומר שזו הדרך הממוטבת היחידה. מנתחי רשתית שונים עשויים להיות העדפות אחרות עבור מכשור וטכניקה. לדוגמה, עיצוב התקן השתלה זה יכול לספק רק שתלים שטוחים הנתמכים עם נושא תא נוקשה יותר ולכן לא יכול להיות מתאים לשתלים גמישים יחסית (או מגולגלים). השתלות השעיית RPE יכולות להשמיט חלק גדול מהטכניקה הזו. בהתאם לכך, פרטים כירורגיים ידרשו שינוי בהתבסס על כל אסטרטגיית לידה.

ככל שהעניין בטיפולים תאיים לטיפול במחלות רשתית ניוונית ממשיך לגדול, מודל בעלי החיים של NHP יהיה חיוני במחקרים פרה-קליניים לחקר הגורמים המשפיעים על הישרדות שתל RPE. בכתב יד זה, מוצעות אסטרטגיות כדי לאפשר את המסירה החלקה יותר של שתל RPE חד-שכבתי תת-עיני בעין NHP. שיטות להדמיה טובה יותר של סיבוכים תוך ניתוחיים מומלצות גם כן. צפוי כי שיטות אלה ימשיכו להשתפר ככל שהשימוש בטיפולים תאיים יתרחב. ניירות שיטה עתידיים צריכים גם לשקול להציע רשימה מקיפה של חקירות כדי להעריך היבטים מבניים ותפקודיים שונים של השתל.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי IAF-PP (HMBS Domain) (OrBID): OculaR BIomaterials and Device, A*STAR, סינגפור (H17/01/a0/013), מענק הסטארט-אפ NUHSRO/2016/100/SU/01, מענק NUHS Clinical Scientist Program (NCSP) ותוכנית המחקר התחרותית של קרן המחקר הלאומית, סינגפור (NRF-CRP21-2018-20008) ל- X.S., הונג לאונג העניקה קרנות פרופסור ל- G.E.H ו- B.V.S. ברצוננו להכיר לצוות הווטרינרי בפלטפורמת המודל הטרום-קליני התרגומי (מכון סינגפור לחקר העיניים, סינגפור) על מתן תמיכה בהכנת ניתוח NHP ומעקב אחר בעלי חיים. ברצוננו להרחיב את הערכתנו לג’יל טאו ועמיתיו מ- C. Zeiss Meditec Singapore לתמיכה טכנית עבור OPMI-Lumera 700 עם התקן OCT תוך ניתוחי משולב.

Materials

1% Mydriacyl (Tropicamide 1.0%) Sterile Ophthalmic preparation	Alcon	SIN 4715P	Surgical procedure
10% Neutral buffered formalin	Leica	3800598	Histology procedure
2.5% Mydfrin (Phenylephrine hydrochloride) Ophthalmic solution	Alcon	No. 01785	Surgical procedure
25 G AWH Vivid Chandelier	Synergetics	56.54.25P	Surgical procedure
25 Ga Bi-Blade Vitreous Cutter Combined Wide-Field Stellaris Elite Pack	Bausch & Lomb	SE5525WVB	Surgical procedure
AMO ENDOSOL Balanced Salt Solution for ophthalmic irrigation	Abbott Medical Optics	15020	Surgical procedure
Apo-minocycline	Apotex Inc	2084104	Immunosuppression
AUROVISC – Hypromellose Ophthalmic Solution USP 2% w/v	Aurolab	TN 00002387	Surgical procedure
Autoclave MELAG, Vacuklav	MELAG	1131-B2300	Surgical procedure
Autostainer XL (ST5010)	Leica	2433	Histology procedure
Balanced Saline Solution	Beaver Visitec	581732	Surgical procedure
Cotton Bud	WINNER MEDICAL	1NA6-100	Surgical procedure
Diagnosys Espion E3 Console	Diagnosys	272	Ophthamic imaging
Doxycycline	Yung Shin	MAL 19950403AEZ	Immunosuppression
Eosin Y	Merck Millipore	1.15935.0100	Histology procedure
ERG-Jet contact lens electrodes	Fabrinal	F-06	Ophthamic imaging
Extendable PolyTip Cannula 25 G/38 G	MedOne	3247	Surgical procedure
FlexTip Brush (25 g) 1.5 mm	MedOne	3222	Surgical procedure
Fluoresceine 10% Faure	Curatis AG	5030376	Ophthamic imaging
Gauze Swab	WINNER MEDICAL	1NP3275	Surgical procedure
Hamilton gas tight syringe 250 µL	Hamilton	81101	Surgical procedure
Heidelberg Spectralis HRA + OCT Computer System	Heidelberg Engineering	N.A.	Ophthamic imaging
Hematoxylin Gill II	Merck Millipore	3801520	Histology procedure
Inverted microscope eclipse Ti-E main body (100-240V)	Nikon	33131	Histology procedure
Ketamin injection	Ceva	37711/58317	Surgical procedure
Lithium carbonate	Merck Millipore	1.05680.0250	Histology procedure
Monkey plasminogen	Molecular Innovations	SKU-CYPLG	Surgical procedure
Non-contact wide angled 128 degree fundus lens	C. Zeiss Medtech	Resight 700	Surgical procedure
Non-woven Ophthalmic Drape	Alcon	8065103120	Surgical procedure
Ophthalmic Corneal/Scleral V-Lance Knife 20 G	Alcon	8065912001	Surgical procedure
Paraffin Embedding Station	Leica	EG1150 H	Histology procedure
Paraplast High Melt Paraffin	Leica	39601095	Histology procedure
Phloxin B	Merck Millipore	1.15935.0025	Histology procedure
Prepowdered Surgical Gloves	MAXITEX	85-173-2/85-173-3/85-173-4	Surgical procedure
PRODINE Povidone-Iodine Solution BP	ICM PHARMA	PMLBLP20-01	Surgical procedure
Righton Slit Lamp Model MW50D (RAA133CB)	Righton-Oph	5200162	Ophthamic imaging
Rotary microtome	Leica	RM2255	Histology procedure
Safil Polyglycolic acid, braided, coated, absorbable surgical suture 7/0	B.Braun	G1048711	Surgical procedure
SHINCORT I.M. INJ. Triamcinolone Acetonide 40 mg/mL	Yung Shin	SHI40 SGP-2610015-001	Surgical procedure
Single-Use Hypodermic Needle 21 G	B.Braun	4657527	Surgical procedure
Single-Use Hypodermic Needle 23 G	B.Braun	4657667	Surgical procedure
Sirolimus	Pfizer	SIN12034P	Immunosuppression
Stainless steel subdermal needle electrode	OcuScience	F-E2	Ophthamic imaging
Stellaris Elite vision enhancement system	Bausch & Lomb	BL15455	Surgical procedure
Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 27 G 12 mm	B.Braun	4665406	Surgical procedure
Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 30 G 12 mm	B.Braun	4656300	Surgical procedure
Surgical gown + 2 Hand Towels	STERIL	APP10 00 01	Surgical procedure
Tegaderm Film	3M	1626W	Surgical procedure
TERUMO Syringe 1 cc/mL Luer SlipTip with needle 26 G	Teruma	SS-01S	Surgical procedure
TERUMO Syringe 3 cc/mL Luer LockTip	Teruma	SS-03L	Surgical procedure
TERUMO Syringe 5 cc/mL Luer LockTip	Teruma	SS-05L	Surgical procedure
TobraDex (Tobramycin, Dexamethasone) Sterile Ophthalmic Ointment	Alcon	No. 01577	Surgical procedure
Topcon Retinal Camera TRC-50DX	Topcon	948605	Ophthamic imaging
Vidisic Gel	Bausch & Lomb	GB41789155517	Surgical procedure
Xylazil-20	Ilium	38653/50276	Surgical procedure
Zeiss Opmi Rescan 700	Carl Zeiss Meditec AG	7210	Surgical procedure

Referanslar

Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
Verbakel, S. K., et al. Non-syndromic retinitis pigmentosa. Progress in Retinal and Eye Research. 66, 157-186 (2018).
Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
Sugita, S., et al. HLA-matched allogeneic iPS cells-derived RPE transplantation for macular degeneration. Journal of Clinical Medicine. 9 (7), 2217 (2020).
Gouras, P., Flood, M. T., Kjeldbye, H. Transplantation of cultured human retinal cells to monkey retina. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 56 (4), 431-443 (1984).
Koster, C., et al. A systematic review on transplantation studies of the retinal pigment epithelium in animal models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2719 (2020).
Stanzel, B., et al. Surgical approaches for cell therapeutics delivery to the retinal pigment epithelium and retina. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1186, 141-170 (2019).
Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
Ben M’Barek, K., et al. Clinical-grade production and safe delivery of human ESC derived RPE sheets in primates and rodents. Biomaterials. 230, 119603 (2020).
Fujii, S., et al. A strategy for personalized treatment of iPS-retinal immune rejections assessed in cynomolgus monkey models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (9), 3077 (2020).
The Architecture Of The Human Fovea. Webvision. Moran Eye Center Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-ii-anatomy-and-physiology-of-the-retina/the-architecture-of-the-human-fovea/ (2021)
Francis, P. J., et al. Rhesus monkeys and humans share common susceptibility genes for age-related macular disease. Human Molecular Genetics. 17 (17), 2673-2680 (2008).
Picaud, S., et al. The primate model for understanding and restoring vision. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26280-26287 (2019).
Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
Al-Nawaiseh, S., et al. A step by step protocol for subretinal surgery in rabbits. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e53927 (2016).
Tan, G. S. W., et al. Hints for gentle submacular injection in non-human primates based on intraoperative OCT guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10 (2021).
Liu, Z., et al. Surgical transplantation of human RPE stem cell-derived RPE monolayers into non-human primates with immunosuppression. Stem Cell Reports. 16 (2), 237-251 (2021).
Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
Shaikh, M., Miller, J. B., Papakostas, T. D., Husain, D. The efficacy and safety profile of ocriplasmin in vitreomacular interface disorders. Seminars in Ophthalmology. 32 (1), 52-55 (2017).
Johnson, M. W., Fahim, A. T., Rao, R. C. Acute ocriplasmin retinopathy. Retina. 35 (6), 1055-1058 (2015).
Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: experience from a phase 1/2a study. Ophthalmology. Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber’s congenital amaurosis. New England Journal of Medicine. 358 (21), 2240-2248 (2008).
Xue, K., Groppe, M., Salvetti, A. P., MacLaren, R. E. Technique of retinal gene therapy: delivery of viral vector into the subretinal space. Eye. 31 (9), 1308-1316 (2017).
Grzybowski, A., et al. Update on intravitreal injections: Euretina Expert Consensus Recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
Wong, D., Williams, R., Stappler, T., Groenewald, C. What pressure is exerted on the retina by heavy tamponade agents. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 243 (5), 474-477 (2005).
Steel, G. B., Kearns, V., Stanzel, B. V., Wong, D. Subretinal injection under perfluorocarbon liquids to avoid foveal dehiscence. Retina. , (2021).
Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
Koh, A. E. -. H. Retinal degeneration rat model: A study on the structural and functional changes in the retina following injection of sodium iodate. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 196, 111514 (2019).
Bürgi, H., Schaffner, T. H., Seiler, J. P. The toxicology of iodate: a review of the literature. Thyroid. 11 (5), 449-456 (2001).
Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch’s membrane. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 235 (1), 41-47 (1997).
Castellarin, A. A., et al. In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch’s membrane. Experimental Eye Research. 66 (1), 49-67 (1998).
Lopez, P. F., et al. Retinal pigment epithelial wound healing in vivo. Archives of Ophthalmology. 113 (11), 1437-1446 (1995).
Lopez, R., Gouras, P., Brittis, M., Kjeldbye, H. Transplantation of cultured rabbit retinal epithelium to rabbit retina using a closed-eye method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (7), 1131-1137 (1987).
Thieltges, F., et al. Localized RPE removal with a novel instrument aided by viscoelastics in rabbits. Translational Vision Science & Technology. 5 (3), 11 (2016).
Phillips, S. J., et al. Autologous transplantation of retinal pigment epithelium after mechanical debridement of Bruch’s membrane. Current Eye Research. 26 (2), 81-88 (2003).
Sugita, S., Mandai, M., Kamao, H., Takahashi, M. Immunological aspects of RPE cell transplantation. Progress in Retinal & Eye Research. , (2021).
Xian, B., Huang, B. The immune response of stem cells in subretinal transplantation. Stem Cell Research & Therapy. 6, 161 (2015).
Issa, F., Schiopu, A., Wood, K. J. Role of T cells in graft rejection and transplantation tolerance. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (1), 155-169 (2010).
Yan, F., et al. Transforming growth factor-β2 increases the capacity of retinal pigment epithelial cells to induce the generation of regulatory T cells. Molecular Medicine Reports. 13 (2), 1367-1372 (2016).
Singhal, S., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans and microglia prevent migration and integration of grafted Müller stem cells into degenerating retina. Stem Cells. 26 (4), 1074-1082 (2008).
Singhal, S., Lawrence, J. M., Salt, T. E., Khaw, P. T., Limb, G. A. Triamcinolone attenuates macrophage/microglia accumulation associated with NMDA-induced RGC death and facilitates survival of Müller stem cell grafts. Experimental Eye Research. 90 (2), 308-315 (2010).
Santa-Cecília, F. V., et al. Doxycycline suppresses microglial activation by inhibiting the p38 MAPK and NF-kB signaling pathways. Neurotoxicity Research. 29 (4), 447-459 (2016).
Scholz, R., et al. Minocycline counter-regulates pro-inflammatory microglia responses in the retina and protects from degeneration. Journal of Neuroinflammation. 12, 209 (2015).
Sugita, S., Makabe, K., Iwasaki, Y., Fujii, S., Takahashi, M. Natural killer cell inhibition by HLA-E molecules on induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (5), 1719-1731 (2018).
Sugita, S., et al. Detection of retinal pigment epithelium-specific antibody in iPSC-derived retinal pigment epithelium transplantation models. Stem Cell Reports. 9 (5), 1501-1515 (2017).

Etiketler

Retinal Pigment Epithelium RPE Transplantation Non-human Primate Degenerative Retinal Diseases Foveal Trauma Retinal Bleb Formation Intravitreal Plasminogen OCT-guided Perfluorocarbon Liquid Tamponade Vitrectomy Triamcinolone Posterior Vitreous Detachment

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Seah, I., Liu, Z., Soo Lin Wong, D., Wong, W., Holder, G. E., Amutha Barathi, V., Lingam, G., Su, X., Stanzel, B. V. Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases. J. Vis. Exp. (172), e62638, doi:10.3791/62638 (2021).