非人灵长类动物模型中视网膜色素上皮移植治疗退行性视网膜疾病

注意：所有动物实验均根据视觉和眼科研究协会（ARVO）进行，用于眼科和视觉研究动物。伦理学批准来自新加坡新加坡兴业医疗机构动物护理和使用委员会。动物被安置在经实验动物护理评估和认证协会（AAALAC）批准的SingHealth实验医学中心。该批准强调，所有动物实验均符合新加坡农业食品和兽医局制定的国家实验动物研究咨询委员会指南的标准。以下实验方案是根据在6只 猕猴 （4只男性和2只雌性，4至6岁，2.8至4.0公斤）的6只眼睛中进行的实验建立的 。 1. 在NHP模型中实现免疫抑制 手术前 7 天开始免疫抑制，并在整个随访期间继续免疫抑制。 在给予全身免疫抑制之前称量NHP，以确保准确的药物剂量。在基线时对动物进行称重，此后每周称重一次。 口服西罗莫司、多西环素和米诺环素实现全身免疫抑制。 给予2mg口服西罗莫司的负荷剂量，然后每日维持剂量为1mg。在给药前获得基线血西罗莫司水平，并在整个随访期间进行监测。确保浓度至少为5μg/L，以获得充分的免疫抑制。注意：西罗莫司剂量不适应体重。 每天口服多西环素7.5mg / kg的剂量，每天两次。 每天口服米诺环素7.5mg / kg的剂量，每天两次。 在免疫抑制期间，监测所有非传染性疾病药物的不良全身效应。寻找显着的体重减轻（>10%），食欲和饮水量下降，脱发以及异常行为，如攻击性和嗜睡。评估将在第3天，第14天和第1个月进行，然后是每月评估。 2. 器械灭菌 使用蒸馏水冲洗手术器械。 将仪器放入装有 500 mL 蒸馏水和 2 mL 器械消毒剂的超声波浴中。使用超声波浴的扫描功能清洁仪器15分钟。 从超声波浴中取出仪器。用蒸馏水彻底冲洗两次，每次冲洗5分钟。冲洗后风干仪器。 将仪器放入仪器盒中。使用通用程序设置对盒子进行高压灭菌（在134°C下对器械灭菌50分钟：高压灭菌30分钟，干燥20分钟）。 3. 制备不含防腐剂的曲安奈德（40毫克/毫升） 使用1 mL注射器，取出1mL曲安奈德溶液（10mg / mL）。将其转移到15 mL锥形管中，并与4 mL无菌平衡盐溶液（BSS）混合。 将溶液以120× g 离心5分钟。确保所有曲安奈德颗粒都在锥形管的底部。从锥形管中丢弃上清液（BSS）。 将曲安奈德颗粒与5mL无菌BSS重新悬浮在锥形管中。将溶液以120× g 离心5分钟。再次丢弃上清液。 重复步骤3.3，用BSS（3x）完成曲安奈德颗粒的洗涤。 用0.25mL无菌BSS重新悬浮曲安奈德颗粒以达到40mg / mL的浓度。 用新的1 mL注射器吸出重新悬浮的曲安奈德（40mg / mL）。连接25 G钝头凹槽针头，并保持注射器与曲安奈德溶液准备术中使用。 4. 使用玻璃体内纤溶酶原（0.25μg/μL）预处理NHP眼睛 手术前一周，给予玻璃体内注射（20μL）猴纤溶酶原（0.25μg/ μL）。 手术前，肌内注射氯胺酮（10-20 mg / kg BW）和皮下注射阿托品（0.05 mg / kg BW）镇静NHP。给予丁卡因滴眼液进行局部麻醉。 在玻璃体内注射前，用10%聚维酮碘消毒眶周区域。通过对NHP的结膜补品施用5%聚维酮碘来消毒眼睛。确保溶液在补品中停留至少1分钟，然后用无菌BSS彻底冲洗。 使用250μL注射器从小瓶中吸出预稀释的猴子纤溶酶原（0.25μg/ μL）。将30G针头连接到注射器上，并保持猴子纤溶酶原准备好玻璃体内给药。 使用一对卡尺识别眼睛上的注射部位。在距离边缘3mm的地方进行玻璃体内注射。 继续注射，针头朝向地球中心。从球体上取出针头后，使用棉膏棒填塞注射部位并防止眼内内容物反流。 施用润滑凝胶或软膏，以减少术后立即对眼表的刺激。 5. 手术台和设备设置 建立无菌领域。在无菌区时，请始终佩戴外科磨砂膏、面罩和护发器。 准备不含防腐剂的曲安奈德（40 mg / mL）用于术中玻璃体的可视化（见第3节）。在10 mL注射器中准备无菌BSS，在5 mL注射器中准备润滑剂。将它们放在垂坠物上。 将其他仪器放在悬垂物上，包括 3-0 丝、7-0 针线、棉胶棒、缠绕闭合条和枝形吊灯内发光纤维线。 使用无菌技术将玻璃体切除术套件（包括高速玻璃体切除器、文丘里盒和 25 G 枝形吊灯内腔发光器）连接到玻璃体切除术机。 打开一个 500 mL 眼科级 BSS 瓶，并根据制造商的说明将其连接到文丘里盒。继续启动系统。 打开 miOCT/手术显微镜。选择手术显微镜的预设配置，用于后段手术和照明。输入程序的详细信息，包括 ID、性别、动物眼睛的侧向性和程序的名称。 安装非接触式广角 128 度眼底透镜。 将无菌的一次性手柄盖连接到手术显微镜/ miOCT上。调整显微镜位置并使用脚踏板对焦。继续进行手术。 6.动物麻醉和定位的准备（最好由兽医团队进行） 确保在诱导麻醉之前禁食NHP至少8小时，以防止反流和呕吐。在诱导麻醉之前镇静NHP（参见步骤4.2了解镇静说明）。 使用1%托吡卡胺和2.5%去氧肾上腺素滴眼液至少3次，间隔5分钟，以实现瞳孔扩张。 在手术前30分钟肌内注射丁丙诺啡（0.005-0.03mg / kg BW）以达到镇痛。 用气管插管插管照管NHP，通常大小为3-5毫米。尝试插管时，请确保有几种尺寸可用。使用可以穿过喉部而不会造成创伤的最大尺寸。测量末端潮气 CO2，以确保气管插管的适当放置。 通过气管插管输送2%异氟烷气体以诱导全身麻醉。通过评估NHP对周围刺激（包括声音和触摸）的反应来确认全身麻醉的状态（对触摸缺乏反应）。使用0.5-2%异氟烷气体维持全身麻醉状态。 在整个手术过程中持续监测NHP心电图，呼吸频率，血压和血氧饱和度。 将NHP放置在手术台上，使眼睛垂直于手术显微镜。将润滑凝胶或软膏敷在眼睛上，不要对其进行手术以减少麻醉期间的眼表刺激。 用剪刀剪掉睫毛，以减少感染的机会。 用10%聚维酮碘消毒眶周区域。通过对NHP的结膜补品施用5%聚维酮碘来消毒眼睛。确保溶液在补品中停留至少1分钟，然后用无菌BSS彻底冲洗。 放置无菌悬垂物，使预切开口居中于眼睛进行手术。用粘性手术切口悬垂物覆盖眼睛。 对眼睛进行侧切开术以进行手术。 插入利伯曼窥器，以确保眼睑充分打开，以显示眼睛。 7. 玻璃体切除术 注意：为了进入视网膜下腔进行PET支架RPE移植物的输送，本方案建议使用标准玻璃体视网膜手术装置和非接触式广角128°眼底镜进行4端口（瓣膜）25 G玻璃体切除术。该协议还建议使用配备miOCT的手术显微镜来指导几个关键的手术步骤，包括中央凹脱离的诱导，RPE移植物的植入和视网膜下液体引流。 使用一把vannas剪刀切开边缘附近的结膜，进行360°结膜围膜检查。通过钝性解剖扩大腹膜。 使用25 G微玻璃视网膜刀片，在8点钟对右眼或4点钟对左眼进行硬质疏松术。从眼睛的边缘进行3毫米的硬化切开术。 使用7-0 vicryl缝合线插入并缝合25 G定制侧端口输液套管。确认玻璃体内位置后，启动BSS输注并将系统设置为保持20 mmHg的IOP。 使用25 G平头镜，在2点钟对右眼或10点钟对左眼进行绝育，如步骤7.2。 将 25 G 枝形吊灯插入平头灯槽，并用胶带固定。将光源调节到约60%。 在右眼10点钟或左眼2点钟进行另一次类似于步骤7.2的绝育器切开术。在硬质切开术周围放置U形的维克里7-0缝合线，而不打结。将玻璃体切除术切刀尖端插入该硬质切开术。 在入口处周围开始玻璃体切除术，然后进行短核玻璃体切除术，设置如下：每分钟最多切口5000次，最大吸气量为400 mmHg。 注射20-50μL曲安奈德（40mg / mL）以获得更好的玻璃体可视化。 通过将玻璃体与视网膜分离来诱导后玻璃体脱离（PVD）。 将玻璃体滴管放置在视盘上方，以允许轻柔地诱导PVD。玻璃体仅在抽吸时保持在最大400 mmHg的设置下，不涉及任何切割。 如果需要，使用25 G眼内镊子操纵椎间盘边缘的玻璃体，在玻璃体皮层中形成撕裂，以促进脱离。注：如果曲安奈德晶体在视网膜表面上不受阻碍地滑动，则PVD被认为是成功的。 用切刀打开后舌膜，取出脱落的玻璃体裙，直到玻璃体基底（视网膜赤道处）。抽吸视网膜表面任何剩余的曲安奈德。 8. miOCT引导式中央凹脱离 注射 1-2 mL PFCL，覆盖后极直至前外周视网膜。 用视网膜下注射套管进入眼睛。在玻璃体切除机上将IOP设置为0-4 mmHg（确保完美的水密系统;如果需要，在端口周围系上缝合线）。 使用25/41 G定制的双孔视网膜下注射套管或连接到250μL注射器的25/38 G视网膜下注射套管，轻轻地进行视网膜下注射BSS以诱导局部视网膜脱离。一旦水疱刚好穿过中央凹，停止注射。从单独的方向创建第二个气泡。合并两个凸块以完全分离中央凹。 启用 miOCT 功能以可视化水疱形成。确保线和立方体扫描处于高清模式，并设置（512 x 128像素，扫描宽度4 mm）以在中央凹处获取图像。观察miOCT图像，使神经视网膜与中央凹处的RPE层完全分离。 用一把垂直的25 G玻璃体视网膜剪刀将视网膜切开术扩大至1.5mm，以允许进入视网膜下空间进行移植。 9. 去除天然 RPE 在玻璃体切除机上将IOP设置为50 mmHg。 使用拉丝硅胶吸头套管通过活性挤出去除PFCL。 用1.4毫米切口刀延长硬膜切开术，以允许20 G器械进入。 使用定制的20 G可扩展环路仪器，刮擦黄斑下宿主RPE以进行移除。刮擦至少 2 x 3 mm 的区域。 10. 装载用于递送RPE细胞单层移植的射手 有关在PET细胞载体上加载从RPE培养物中切割的子弹形移植物的一般说明，请参阅先前的出版物22。 11. miOCT引导下移植物植入和位置调整 将射手装置的尖端以20 mmHg的IOP通过硬质疏松术插入。通过视网膜表面形成的视网膜切开术边缘将植入物注射到视网膜下间隙。 注射植入物时，细胞载体侧面向Bruch膜，RPE异种移植物侧面向光感受器。 启用miOCT功能，可视化种植体位置。确保植入物平放在视网膜下空间的Bruch膜上，并且视网膜上覆完整。确保它距离创建的视网膜切开术有合理的距离，并且不会撞击视网膜切开术部位。 使用视网膜下注射插管或25 G弯曲的眼内剪刀调整植入物位置，以确保其在黄斑下位置良好。 12. miOCT引导下输注视网膜下腔积液 使用拉丝硅胶尖端插管，进行液-空气交换和仔细的视网膜下液体引流。尝试从睑板视网膜脱离和视网膜切开术边缘进行轻柔的视网膜下液体抽吸。 启用 miOCT 功能，实时可视化视网膜下液体的充分引流，直到视网膜重新附着在植入物上。 13. 结束操作 使用预先放置的7-0 vicryl缝合线关闭工作端口巩膜切开术。取下 25 G 枝形吊灯和 25 G 输液插管。用7-0个维克里缝合线关闭这些硬化切片。 在缝合前8点进行玻璃体内注射防腐剂游离曲安奈德（40mg / ml）中的2mg。 触诊眼睛以确保眼压在可接受的范围内。如果需要，通过30 G针注入过滤空气（或BSS）。 用7-0个玻璃酰缝合线缝合结膜，用5-0个丙烯缝合结膜（10-14天后取出）。 14. 术后动物护理 手术后将 NHP 正面朝下放置 1 小时。在恢复意识之前，不要让动物无人看管。确保兽医和动物护理技术人员在术后过程中可以进行观察和支持。 术后每日两次，局部应用抗生素（妥布霉素）、类固醇（地塞米松）软膏和高马托品滴眼液，持续 5 天。 术后6小时另施用另一种皮下注射丁丙诺啡（0.005-0.03mg / kg BW）以充分控制疼痛。 只有当NHP完全恢复意识时，才将NHP归还给其他动物的陪伴。 在手术后的第3天，第14天和第1个月进行多模式成像随访，然后每月进行检查。手术后每月执行 ERG。在第14天移除5-0个用于切口术的prolene缝合线，同时使用用于多模态成像的镇静期。其余的缝合线是可吸收的，7-0个玻璃缝合线，不需要移除。 15. 多模态成像的术后监测方法 在一夜之间禁食NHP。在影像学检查前镇静NHP（见步骤4.2了解药物和镇静剂浓度）。如果镇静不足以阻止眼球运动，请考虑使用全身麻醉。 在影像学检查前，使用1%托吡卡胺和2.5%去氧肾上腺素滴眼液以实现瞳孔扩张（见步骤6.2）。 使用具有 55° 视场透镜和 30° 视场透镜的高分辨率 OCT 机进行自发荧光 （AF）、眼底荧光素血管造影 （FFA） 和光学相干断层扫描 （OCT）。 静脉注射 10% 荧光素（0.1 mL/kg BW）治疗 FFA。要获得早期阶段的图像，请在注射后30秒内捕获图像。对于后期图像，在注射后5-10分钟捕获图像。 在FFA的早期和晚期阶段之间使用眼底相机进行眼底摄影。 16. 全场视网膜电图（ERG）研究的术后监测方法 在一夜之间禁食国家人类健康计划。在ERG研究之前镇静NHP（见步骤4.2的药物和镇静浓度）。在整个ERG记录中，在适当的时候重新施用镇静剂。 将多模态成像和ERG记录分开，间隔至少为2-3天。 镇静后，确保NHP在ERG记录前30分钟处于黑暗适应状态。 将不锈钢皮下针电极放置在左右侧坎（参比电极）和NHP主体（接地电极）的背面。使用活性凝胶将ERG隐形眼镜电极放在NHP角膜上，以帮助接触和粘附。 所有ERG测试均基于国际视觉临床电生理学会（ISCEV）推荐的人体方案14。在暗视觉条件下开始ERG记录，并从调光器闪光开始。遵循 ISCEV 建议的推荐刺激间隔。 在光像测试之前，确保NHP经过10分钟的光适应，再次使用标准ISCEV建议的背景强度。 17. 新药的安乐死 为了安乐死NHP进行去核，按照美国兽医协会安乐死小组的建议，静脉注射戊巴比妥钠（75mg / kg）。