本文列出了在先前描述的三维胶原基支架上接种神经母细胞瘤细胞系所需的步骤,在预定的时间范围内维持细胞生长,以及检索支架以进行多种细胞生长和细胞行为分析以及下游应用,可适应满足一系列实验目标。
神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体瘤,占儿童癌症死亡总数的15%。天然肿瘤组织是一个复杂的三维 (3D) 微环境,涉及被细胞外基质 (ECM) 包围的癌细胞和非癌细胞层。ECM 提供物理和生物支持,并有助于疾病进展、患者预后和治疗反应。
本文描述了一种组装基于3D支架的系统的方案,以使用神经母细胞瘤细胞系和基于胶原的支架模拟神经母细胞瘤微环境。支架补充有纳米羟基磷灰石 (nHA) 或糖胺聚糖 (GAG),这些聚糖天然存在于骨骼和骨髓中,是神经母细胞瘤最常见的转移部位。这些支架的 3D 多孔结构允许神经母细胞瘤细胞附着、增殖和迁移,以及细胞簇的形成。在这个3D基质中,细胞对治疗的反应更能反映 体内 情况。
与传统的二维 (2D) 细胞培养相比,基于支架的培养系统可以保持更高的细胞密度。因此,初始接种细胞数量的优化方案取决于所需的实验时间范围。该模型通过DNA定量评估细胞生长,通过代谢测定评估细胞活力,以及通过组织学染色评估支架内的细胞分布来监测。
该模型的应用包括评估基因和蛋白质表达谱,以及使用常规药物和miRNA进行细胞毒性测试。3D 培养系统允许精确操作细胞和 ECM 成分,从而创造一个在生理上与天然肿瘤组织更相似的环境。因此,这种3D 体外 模型将促进对疾病发病机制的理解,并改善 在体外、 动物模型和 人类受试者中获得的结果之间的相关性。
神经母细胞瘤是一种交感神经系统的小儿癌症,在胚胎发育或出生后早期由于神经嵴细胞的转化而引起1。它是儿童中最常见的实体性颅外肿瘤,占 15 岁以下患者诊断出的恶性肿瘤的 8%,占所有儿童癌症死亡的 15%。由于特定的染色体、遗传和表观遗传改变以及组织病理学特征,该疾病表现出高度异质的临床行为。
这些改变导致神经母细胞瘤的侵袭性和儿科患者的不良预后。因此,从长远来看,目前的疗法对近 80% 的临床侵袭性疾病患者无效2,这凸显了对这组患者的治疗仍然具有挑战性的事实。这可能是由于神经母细胞瘤异质性和转移的机制仍未完全了解。然而,肿瘤微环境 (TME) 现在被广泛认为在许多癌症的进展中起作用;然而,它在神经母细胞瘤中的研究仍然不足 3,4。
天然TME是一个复杂的3D微环境,涉及被ECM包围的癌细胞和非癌细胞。ECM 是指组织的脱细胞成分,它为其细胞居民提供结构和生化支持,并有助于疾病进展、患者预后和治疗反应5。这种疾病进展的促进是由于细胞和ECM之间的“动态互惠”或持续的双向通讯6,7,8。随着癌症的进展,基质胶原蛋白通常以垂直于基质-癌界面的线性模式进行重组,癌细胞将其用作转移的迁移途径 9,10,11。
这种天然功能性生物支架的主要成分包括I型和II型胶原蛋白和其他蛋白质的纤维网络,包括弹性蛋白、糖蛋白(如层粘连蛋白)以及一系列蛋白聚糖和其他可溶性成分12,13。这些天然ECM的蛋白质现在已成为开发3D体外模型的有吸引力的天然生物分子3。由于与传统的 2D 单层培养相比,3D 支架具有更强的 TME 生理表现,因此在体外细胞培养中的应用越来越受欢迎。制造的 3D 支架有助于细胞附着、增殖、迁移、代谢和对体内生物系统中观察到的刺激的反应。
这些 3D 支架的主要成分是胶原蛋白,胶原蛋白是许多正常生物过程的关键参与者,包括组织修复、血管生成、组织形态发生、细胞粘附和迁移11。基于胶原蛋白的 3D 基质已显示出其强大的 ECM 建模功能,可作为体外仿生微环境,同时实现细胞-ECM 相互作用以及细胞迁移和侵袭。在许多癌症模型 14,15,16(包括神经母细胞瘤17,18)中,这些 3D 基质还比传统的 2D 或“平面”培养物更准确地分析了细胞对化疗药物的反应 14,15,16。据报道,即使与动物模型相比,3D 细胞培养物的遗传分析也与人体组织图谱具有更高的相关性19。总体而言,这些 3D 支架的基石是为细胞提供合适的体外环境,这概括了天然组织结构并促进了双向分子串扰8。
为了增加基于胶原蛋白的模型的复杂性,在组织工程过程中加入了其他常见的ECM成分,从而创建了更具生理学相关性的模型,以反映不同组织的生态位TME。例如,GAGs,存在于所有哺乳动物组织中的带负电荷的多糖20,促进细胞附着、迁移、增殖和分化。硫酸软骨素是在骨骼和软骨中发现的一种特殊类型的 GAG,以前已用于骨修复的组织工程应用 21,22,23,24,25。纳米羟基磷灰石(nHA)是人体骨组织矿物质成分的主要无机成分,占骨骼重量的65%26,因此广泛用于骨替代和再生27。因此,GAG 和 nHA 是重建原发性神经母细胞瘤 ECM 和模拟神经母细胞瘤、骨髓 (70.5%) 和骨 (55.7%) 最常见的转移部位的有吸引力的复合材料28。
包含这些 ECM 组件的支架最初是为骨组织工程应用而开发的,对其生物相容性、毒性以及骨传导和骨诱导特征进行了广泛分析29,30。它们是多孔的胶原蛋白基质,使用冷冻干燥技术生产,以控制其物理和生物特性。补充有 nHA (Coll-I-nHA) 或软骨素-6-硫酸盐 (Coll-I-GAG) 的胶原支架在模拟乳腺癌31 的原发性 TME 和前列腺癌15 以及神经母细胞瘤17 的骨转移方面显示出成功。用于制造这些复合支架的冷冻干燥技术在支架内的孔径和孔隙率方面产生了可重复的均匀性22,23,24。简而言之,通过将纤维状胶原蛋白与0.05M乙酸混合来制备胶原蛋白浆液(0.5wt%)。对于Coll-I-GAG,在混合时将0.05wt%的从鲨鱼软骨中分离出的chrondoitin-6-sulfate添加到胶原浆液中。对于复合Coll-I-nHA支架,如前所述合成纳米级羟基磷灰石颗粒27,并在混合过程中以与胶原重量的2:1比例添加到胶原浆液中。所有支架均进行物理交联,并使用105°C的脱水热处理灭菌24小时25。使用活检打孔器获得圆柱形支架(直径6mm,高度4mm),并且可以在蒸馏水(dH2O)中与3mM N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐和5.5mM N-羟基琥珀酰亚胺(EDAC / NHS)化学交联,以改善构建体的机械性能30。这种由两个胶原支架精心优化的制造工艺创造了具有可重复机械性能的支架,包括孔径、孔隙率和刚度 (kPa)。Coll-I-GAG 和 Coll-I-nHA 支架具有不同的物理特性,从而产生不同的环境条件。每个脚手架的属性如表 1 所示。
COLL-I-GAG系列 | Coll-I-nHA型 | |
脚手架尺寸 (直径 [mm] x 高度 [mm]) |
6 x 4 17 | 6 x 4 17 |
胶原蛋白浓度 (wt. %) | 0.5 17 | 0.5 17 |
底物浓度 (wt. %) [基于胶原蛋白的重量] |
0.05 15.17 | 200 17 |
平均孔径 (mm) | 96 22 | 96 – 120 29 |
孔隙率 (%) | 99.5 23 | 98.9 – 99.4 27 |
刚度 (kPa) | 1,5 27 | 5.5 – 8.63 29 |
表 1:用于研究神经母细胞瘤生物学的两种支架的机械性能概述。
本文描述了一种组装基于 3D 支架的系统的方案,以使用神经母细胞瘤细胞系和先前描述的补充有 nHA (Coll-I-nHA) 或软骨素-6-硫酸盐 (Coll-I-GAG) 的基于胶原的支架更好地模拟神经母细胞瘤微环境。该协议包括下游方法,使用先前优化的、廉价的方法在更具生理相关性的环境中分析神经母细胞瘤细胞的生长机制,这些方法改编自2D单层培养 图1。
图 1:整体协议工作流程。 (A) 细胞生长到足够数量,分裂、计数并重悬于适当体积的培养基中。(B) 然后对该细胞原液进行连续稀释,以制备总共 4 种不同密度的细胞悬液。(C)将基于胶原的支架无菌接种在非贴壁的24孔板中,并将(D)将20μL细胞悬液添加到每个支架的中心,并在37°C,5%CO2和95%湿度下孵育3-5小时。 (E)然后将完全生长培养基(1mL)缓慢添加到每个支架中,并将板放回培养箱中以使细胞在所需的时间范围内生长。(F)在每个预定时间点,取回几个支架进行细胞活力和生长评估、基因表达分析和组织学染色。 请点击这里查看此图的较大版本.
3D 支架癌细胞模型已被证明是一种有价值的多功能工具,可用于在简化的 TME32 中获得神经母细胞瘤细胞生长、活力和细胞浸润的机制见解。这里描述的 3D 神经母细胞瘤模型模拟最小的 TME,并提供比 2D 单层培养物更多的生理相关数据。3D细胞培养的一个主要缺点是实验复杂性增加,时间框架较长。这里描述的是一种优化的方案,用于在基于胶原的支架上接种、生长和维持神经母细胞瘤细胞,然后进行下游分析和应用,从而产生细胞生长的稳健表征。我们旨在深入了解支架的最佳细胞接种密度,以创建一个可预测和可控的环境,用于在快速的 14 天实验窗口中评估抗癌药物治疗。所有这些描述的简单方案的组合提供了对基于支架的 体外 培养系统中神经母细胞瘤细胞生长的全面评估。
强调了协议设置中的关键点,以使科学家能够在他们的实验室中快速建立相同的信息。例如,为了更好地进行比色细胞活力测定,指示的孵育时间允许试剂更深入地渗透到支架孔中,以到达所有细胞。此外,荧光dsDNA染色技术稳健而简单;然而,从支架中释放的DNA需要剧烈的细胞裂解,因为细胞被“捕获”在胶原纤维中。
使用所描述的简单 DNA 定量测定,我们可以使用该模型鉴定基于胶原蛋白的支架上的对数生长阶段,用于抗癌药物筛选。在所描述的实验环境中,使用了 4 种初始细胞接种密度,总周期为 14 天,分析时间点分别为 1、7 和 14 天。我们发现,在第 4 天× 105 个细胞/支架上接种的 KellyLuc 细胞在第 7 天和第 14 天之间具有最显着的活性增殖窗口。这种对数期生长数据将允许对各种细胞毒性实验进行可靠的解释。它消除了对 3D 多孔平台上的生长抑制而不是药物毒性导致生长下降或细胞死亡的猜测。细胞活力也是广泛使用的评估 3D 平台是否适合支持不同细胞类型生长的评估 33,34。虽然有许多测定方法可以测量细胞活力,包括活/死染色、ATP 测定、增殖测定,但我们发现使用 Alamar Blue 比色细胞活力测定是一种简单有效的技术来支持 DNA 定量数据。
DNA定量和细胞活力的联合使用提供了互补的证据,表明平均而言,在支架上接种细胞以实现14天内持续生长的最佳密度为2-4×105 个细胞/支架。然而,该协议可以很容易地适应不同的实验时间框架、分析时间点和下游应用。尽管该方案描述了在支架上评估神经母细胞瘤细胞的单一培养细胞生长,但支架易于修改以用作共培养的平台,由do Amaral等人描述,他们利用胶原-GAG支架在伤口愈合研究中共培养角质形成细胞和成纤维细胞35。
所描述的 3D 模型能够使用不同的众所周知的技术(例如免疫荧光和标准 H&E)可视化细胞生长和浸润。由于支架上细胞形态和生长模式的多样性,使用生化测定法可视化细胞以及表征生长非常重要。了解生长模式可以深入了解生长行为和未来对抗癌药物的反应。例如,使用 DNA 定量的 IMR32 生长产生与 Kelly 相似的模式,尽管在使用 H&E 可视化时,IMR32 的生长簇比 Kelly 大,后者显示出更分散的生长(图 9)。支架中细胞系的这些不同生长模式反映了肿瘤异质性的临床情况。在 3D 支架中使用一组具有不同形态的细胞系检查抗癌药物反应将增加患者对相同药物反应的预测价值。
如果分泌了目标蛋白,也可以使用其他方法(例如RT-qPCR或ELISA)检测基因或蛋白质表达。神经母细胞瘤进展的替代标志物嗜铬粒蛋白 A (CgA)36 用于另外表征神经母细胞瘤细胞的 3D 生长。如先前的工作17所述,随着细胞增殖,CgA分泌增加(图10)。虽然单层细胞培养无法捕捉到这种增加,因为增殖意味着细胞在培养皿中达到完全汇合,但使用 3D 胶原支架可以延长对 CgA 分泌的评估。
这种 3D 体外 模型可能不适合研究神经母细胞瘤生物学和对治疗反应的所有研究问题。其中一个局限性是支架内的细胞渗透不均匀,以及形成不同大小的细胞簇,这取决于给定的细胞系,并可能导致营养物质和测试药物的不可控扩散。这一特征会影响治疗性筛查的稳健性。然而,尽管存在这种局限性,但重要的是要考虑到天然肿瘤在大小和癌细胞分布方面也是异质的,并且在肿瘤组织内包含许多其他细胞类型。为了克服这一限制,我们建议将每个细胞填充的支架用作单个微组织,其参数将得到优化:(a)细胞活力试剂到达细胞和细胞簇的孵育时间,以及(b)通过用组织裂解器对支架上的细胞进行预处理,在Triton X-100缓冲液中裂解细胞,以释放支架深处所含细胞的DNA。
该协议的另一个技术限制是缺乏对该模型的每批新制造的脚手架的机械测试。然而,使用支架的稳健制造工艺,该工艺已广泛表征与支架的物理和化学特性有关,例如压缩和拉伸模量、孔隙率和视觉孔结构以及均匀性,确保支架质量在批次21、24、27、30、37 中保持不变。
综上所述,本文提出了一系列分析胶原基支架细胞生长的简单方法。实验时间线和分析点都可以根据具体的研究问题进行互换。该协议也适用于其他细胞类型。上述结果提供了证据,说明该方法汇编如何深入了解各种神经母细胞瘤细胞系的最佳接种密度,以在 14 天内产生连续生长。从该协议中的所有方法获得的结果的合并产生了对3D胶原基质内细胞生长的更好理解。该模型的未来使用可能涉及神经母细胞瘤TME特异性共培养系统以及各种新型抗癌药物的测试。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了国家儿童研究中心(NCRC),爱尔兰研究委员会(IRC)和英国神经母细胞瘤的支持。插图是使用 BioRender 创建的。
Cells | |||
IMR-32 | ATCC | CCL-127 | |
Kelly | ECACC | 82110411 | |
KellyCis83 | Made in lab – derived from Kelly (Piskareva et al., 2015) | – | Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired |
SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | |
Disposable | |||
0.22 µm syringe filter | Millex | SLHP033RS | |
1.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 0030 120.086 | |
100 mL sterile Pot | Starstedt | – | |
10 mL plastic pipette | Cellstar | 607 180 | |
15 mL Falcon tube | Starstedt | 62.554.502 | |
25 mL plastic pipette | Cellstar | 760 180 | |
50 mL Falcon tube | Starstedt | 62.547.254 | |
5 mL plastic pipette | Cellstar | 606 180 | |
6 mm Biopsy punches | Kai Medical | BP-60F | |
Aluminium foil | – | – | |
Cover Slip | Menzel-Glaser | – | |
HYPERflask | Corning | CLS10030 | |
Microscope slides | Thermo Scientific | J1840AMNT | |
Opaque black 96-well plate | Costar | 3915 | |
Sterile P10 tips | Starlab | S1121-3810 | |
Sterile P1000 tips | Starlab | S1122-1830 | |
Sterile P20 tips | Starlab | S1123-1810 | |
Sterile P200 tips | Starlab | S1120-8810 | |
T-175 (175 cm2 flask) | Sarstedt | 83.3912 | |
T-75 (75 cm2 flask) | Sarstedt | 83.3911.302 | |
Translucent clear 96 well plate | Cellstar | 655180 | |
Translucent non-adherent 24 well plates | Cellstar | 83.3922.500 | |
Equipment | |||
Autoclave | Astell | – | |
Automatic tissue processor | Leica | TP1020 | |
Centrifuge 5804 | Eppendorf | – | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | – | |
Incubator | ThermoScientific | – | |
Microtome | Leica | RM2255 | |
Oven | Memmert | Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd | |
P10 pipette | Gilson | ||
P100 pipette | Gilson | ||
P1000 pipette | Gilson | ||
P20 pipette | Gilson | Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd | |
P200 pipette | Gilson | Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd | |
Paraffin section flotation bath | Electrothermal | MH8517 | Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd |
Pipette electronic dispenser | Corning | StripipetterUltra | Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd |
Plate cooler | Leica | EG1140C | Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd |
Refrigerator -20 °C | Liebherr | – | |
Refrigerator -80 °C | Liebherr | – | |
Refrigerator 4 °C | Liebherr | – | |
Seesaw Rocker | DLAb | SK-D1807-E | |
Spectrophotometer – Victor3V Platereader | PerkinElmer | 1420 | |
Tissue culture hood/Laminar flow hood | GMI | 8038-30-1044 | |
Tissue Lyser | Qiagen | TissueLyser LT | |
Tweezers | – | – | |
Water bath | Grant | – | |
Wax embedder | Leica | EG1140H | |
Materials | |||
1 L Water | Adrona – Biosciences | 568 | |
1% Triton-X | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | |
10x PBS tablets | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | |
37% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Alamar Blue Cell Viability Reagent | Invitrogen | DAL1100 | |
Collagen- glycosaminoglycan scaffold | Tissue engineering research group (TERG) | ||
Collagen-nanohydroxyapatite scaffold | Tissue engineering research group (TERG) | ||
dH20 | Adrona – Biosciences | 568 | |
Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005) |
EtOH | Sigma-Aldrich | 1.00983.2500 | Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005) |
F12 | Gibco | 21765-029 | |
FBS | Gibco | 10270-106 | |
Hemaytoxylin | Sigma-Aldrich | HHS32-1L | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
MEM | Gibco | 21090-022 | |
miRNA easy Kit | Qiagen | 217004 | |
MNEAA’s | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 015140-122 | |
Qiazol | Qiagen | 79306 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | |
RPMI | Gibco | 21875-034 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | |
Tissue embedding Medium | Sigma | A6330-4LB | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
Software | |||
Excel | – | Excel 2016 | |
ImageJ | – | – | |
Prism | – | Version 9 |