一锅纯无细胞系统

注：该协议描述了从重组组分制备无细胞TX-TL系统的方法。为方便起见，该作品分为五个部分。第一部分描述了准备步骤，应在开始协议之前完成。第二部分描述了OnePot蛋白溶液的制备。第三部分描述了核糖体纯化，第四部分详细介绍了能量溶液的制备，最后一部分提供了建立PURE反应的手册。为方便起见，协议被划分为天，并在 表1中的每日时间表中总结。按照时间表，整个系统可以在1周内由一个人准备。 1. 前期工作 制备细菌培养基和添加剂培养基，如 补充表1所述。准备并消毒所需的材料，包括移液器吸头，96个深孔板。 菌株制备 使用热休克方法将 表2 中所示的表达菌株与相应的表达载体进行变换。 将纯化的质粒加入化学感受态细菌中，并在冰上孵育20-30分钟。 将混合物在42°C下放置30秒（热冲击），然后将其放回冰上2分钟。 将20μL细菌直接移取到含有氨苄西林（AMP）的琼脂平板上，并在37°C下孵育过夜。将板在4°C下储存长达1周。 接种3 mL含有AMP的LB培养基与来自琼脂平板的单个菌落。在37°C下孵育，同时以260rpm振荡过夜。 将250μL培养物与250μL50%（v / v）甘油混合并储存在-80°C。注意：为了将来更快地制备，请将菌株作为甘油储备储存在96孔板中。 通过菌落 PCR 和测序确认所有载体转化。对基因、启动子区域和核糖体结合位点进行测序。 表达测试 在1.3mL深孔板中接种300μL含有AMP的LB培养基和约1μL制备的甘油储备。用透气膜密封板，然后在37°C下孵育，同时以260rpm振荡过夜。注意：此时，所有表达式都是单独完成的。 将300μL含有AMP的新鲜LB培养基接种1μL过夜培养物。在37°C下孵育，同时以260rpm振荡过夜。2小时后，用100μM异丙基β-D-1-硫代乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导细胞并再生长3小时。 将10μL培养物与10μL2x Laemmli缓冲液混合，并加热至95°C10分钟。使用台式离心机旋转样品1分钟，并将10μL上清液上装入PAGE凝胶上。将凝胶在Tris /甘氨酸/SDS缓冲液中以200 V运行30分钟。用去离子水冲洗干净。用考马斯蛋白染色剂覆盖凝胶，孵育1小时。如有必要，将凝胶在水中脱色（ 图1中表达测试的代表性结果）。注意：使用梯度（4%-15%或4%-20%）PAGE凝胶以实现良好的分离。 IMAC琼脂糖树脂修复和清洁 色谱柱制备。 通过涡旋将琼脂糖树脂充分混合。 将所需量的树脂移入空的重力流柱中。注意：所需的树脂量在His-核糖体纯化和蛋白质纯化之间有所不同，并在各自的部分中指定。 用30 mL去离子水洗涤树脂。 继续按照第 1.4.4 节中的规定进行列重新充电。注意：在继续下一步之前，请始终让所有液体通过色谱柱。但是，请确保色谱柱永远不会干涸。每当任何液体流过色谱柱时，请确保在液体到达树脂后立即停止流动或继续下一步。 恢复。 用30 mL去离子水洗涤色谱柱。 应用 10 mL 0.2 M EDTA 和 0.5 M NaCl 溶液。 加入30 mL的0.5M NaCl溶液。 用50 mL去离子水洗涤色谱柱。 在4°C下储存在20%（v / v）乙醇中或继续下一步。 清洗。注意：穿戴防护装备。 用30 mL 0.5 M NaOH洗涤色谱柱。 用30 mL去离子水洗涤色谱柱。 用30 mL 0.1M乙酸洗涤色谱柱。 用30 mL去离子水洗涤色谱柱。 用30 mL的70%（v / v）乙醇洗涤色谱柱。 用50 mL去离子水洗涤色谱柱。 在4°C下储存在20%（v / v）乙醇中或继续下一步。 重新充电。 向色谱柱中加入10 mL 0.1 M硫酸镍溶液。注意：硫酸镍有毒。硫酸镍废物需要按照供应商指示的预防措施进行丢弃。 用50 mL去离子水洗涤色谱柱。 在4°C下储存在20%（v / v））乙醇中或继续与色谱柱平衡。注意：如果色谱柱在步骤之间储存在乙醇中，请确保通过用水清洗色谱柱来除去所有微量乙醇。 2. OnePot蛋白溶液表达与纯化 注意：该协议由三部分组成，分为几天（图2）。理想的制备程序产生1.5 mL的13.5mg / mL OnePot蛋白溶液，相当于超过一千个10μL PURE反应。但是，溶液的量和理想浓度因批次而异。有经验的用户可以一次执行多个OnePot PURE准备工作。 第1天： 制备细菌培养基和添加剂培养基，如 补充表1所述。 准备并消毒所需材料，包括移液器吸头，两个96深孔板和一个1 L挡板锥形瓶。 制备缓冲液和补充剂，如 补充表2中所述。使用瓶顶过滤器（0.45μm）对所有缓冲液进行过滤灭菌，并将其储存在4°C。 除非另有说明，否则在使用前用1mM TCEP补充所有缓冲液。 使用2 mL琼脂糖树脂进行OnePot蛋白纯化。按照第 1.4 节中所述准备列。 要制备起始培养物，将20 mL LB培养基与20μLAMP混合。在无菌的96，1.3mL深孔板中，将300μL培养基加入35孔中。用各自的应变接种它们中的每一个，除了伸长系数热不稳定（EF-Tu），并用透气膜密封板。注意：使用96孔复制器接种板（见 材料表）。深孔板的孔体积和起始培养物的体积至关重要。由于曝气不一致，较大的培养基体积或较小的孔体积将导致不同的细菌密度。 对于EF-Tu培养，在带有卡扣帽的14 mL培养管中接种3 mLLB培养基。单个 3 mL 的 EF-Tu 培养物对于一个 OnePot 表达培养液就足够了。 在37°C下孵育，同时以260rpm振荡过夜。 第2天：注：除非另有说明，否则在室温下执行所有步骤。 将 500 mL LB 培养基和 500 μL AMP 转入无菌挡板烧瓶中。 用1675μLEF-Tu培养物和55μL深孔板中每种培养物接种OnePot PURE培养物（表2）。注意：在此步骤中，可以通过调整接种比例来调整整体蛋白质组成。确保整体接种量保持在3.6 mL不变。可选：为了确认所有菌株都生长过夜，使用读板器在96孔板中以600 nM（OD600）测量过夜培养物的光密度。使用10x的稀释液进行光密度测量。 在37°C下振荡260rpm孵育培养物2小时，或直到培养物的OD600 达到0.2-0.3。 用500μL的0.1mM IPTG诱导培养物并再生长3小时。 通过在4°C和3220×g下离心10分钟收获细胞，并将细胞沉淀储存在-80°C直至进一步使用。注意：为了优化时间，在第2天的孵育时间内准备第4节中描述的能量溶液（表1）。 第3天： 测量以下步骤中描述的纯化所需的缓冲液量，并按照 补充表2所示将TCEP添加到所有缓冲液中。将剩余的不含TCEP的缓冲液储存在4°C以备将来纯化。 用30 mL缓冲液A平衡带电的色谱柱（第2.4节）。25 mL缓冲液A通过后，从底部关闭色谱柱。同时，继续执行步骤 2.15-2.17。 解冻细胞并使用血清学移液管将细胞沉淀重悬于7.5mL缓冲液A中。 使用130瓦探头超声仪（见材料表，探头尖端直径：6 mm）裂解电池，参数如下：4 x 20 s脉冲打开，20 s脉冲关闭，70%振幅。如果超声处理成功，溶液将变暗（图2）。注意：确保在超声处理过程中将细胞保持在冰上。将探头放入溶液中足够深的位置，不要接触管子。如果产生大量的泡沫，能量传递将被阻尼。在这种情况下，让泡沫沉降，将探针更深地降低到溶液中，并延长超声处理时间。 超声处理后立即在4°C下以21130×g离心20分钟，除去细胞碎片。将裂解物放在冰上。 将上清液加入平衡柱中。从顶部关闭柱子，确保没有泄漏。使用管旋转器在4°C旋转下将塔孵育3小时。 从色谱柱中洗脱未结合的组分，并用25 mL缓冲液A洗涤。 用25 mL 25 mM咪唑缓冲液（23.95 mL缓冲液A和1.25 mL缓冲液B）洗涤色谱柱。 用5mL 450mM咪唑缓冲液（0.5mL缓冲液A和4.5mL缓冲液B）洗脱蛋白质。始终将洗脱的蛋白质放在冰上。 用25 mL HT缓冲液稀释洗脱液，将混合物保持在冰上。向 15 mL 离心过滤器中加入 15 mL，浓缩至 1.5 mL 的体积。将剩余的15 mL与浓缩溶液一起加入过滤器中，再次浓缩至1.5 mL。 向浓缩样品中加入10 mL HT缓冲液，浓缩至1 mL。加入等量的储备缓冲液B并储存在-80°C直至进一步使用。注意：一轮交换/浓缩需要大约60分钟，在4°C下以3220×g旋转。 在缓冲区交换期间，按照第 1.4 节中的规定恢复列。 第4天： 使用供应商描述的布拉德福德测定法测量蛋白质浓度。用0.5 mL 3 kDa截止离心过滤器将样品浓缩至20mg / mL。注意：在浓度测量之前，将蛋白质溶液稀释25倍或50倍，以避免布拉德福德测定过度饱和。 为了确定理想的蛋白质浓度，请在此阶段（第5.2节）使用不同浓度的蛋白质溶液进行表达测试。为了进行滴定，保持溶液的总体积恒定，并以五种不同的比例移取OnePot蛋白质溶液，包括储备缓冲液B（补充表7）。 使用SDS-PAGE验证OnePot PURE蛋白质组成（图3A）。用7.5μL水稀释2.5μL样品，与10μL2x Laemmli缓冲液混合，然后将5μL和2.5μL样品上样到凝胶中。按照第 1.3.3 节中的指定运行 SDS-PAGE。 在验证表达并调整浓度后，将蛋白质溶液等分到50μL等分试样中。将OnePot PURE蛋白质溶液储存在-80°C直至进一步使用。注意：如果怀疑蛋白质成分不存在，或者OnePot PURE中的浓度低于预期，请执行以下步骤。 通过对所有培养物进行光密度测量（OD600），检查相应菌株的过夜培养物是否以与其他培养物相当的速度生长。 对特定菌株进行额外的表达测试，以验证可疑蛋白的表达。 3. 核糖体溶液 注意：介绍了两种不同的核糖体纯化策略，一种用于己西替丁标记，另一种用于未标记的核糖体。在标准亲和力Ni-NTA重力流柱上使用His纯化方法的主要优点是纯化简单，快速，并且不需要额外的实验室设备，例如FPLC系统和超速离心机。然而，与无标记核糖体相比，OnePot PURE反应中的蛋白质生产能力约为三分之一。因此，根据高产量是否对给定的应用重要来选择核糖体生产方法。 他标记的核糖体纯化注意：该协议利用 大肠杆菌 RB1菌株，这是王教授（美国哥伦比亚大学）赠送的礼物18。该菌株在50S核糖体蛋白（L7 / L12）的C末端具有己西替丁标签的基因组插入，允许使用Ni-NTA重力流柱进行纯化。通常的产率约为0.5 mL的3.45μM核糖体，足以进行超过500个10μL纯化反应。 第1天： 制备细菌培养基和添加剂培养基，如 补充表1所述。 准备并消毒所需材料，包括移液器吸头、一个 5 L 锥形瓶和一个 100 mL 锥形瓶。 制备缓冲液和补充剂，如 补充表2中所述。使用瓶顶过滤器（0.45μm）对所有缓冲液进行过滤，并将其储存在4°C。 第2天： 将5 mL树脂移液到色谱柱中，并按照第1.4节中的规定制备色谱柱。注意：由于树脂的体积较大，修复和纯化所需的时间要长得多。使用不同的色谱柱进行核糖体纯化，以避免交叉污染，并在纯化前彻底清洁。 通过将35mL LB培养基接种在100mL锥形瓶中来制备 大肠杆菌 RB1菌株的过夜培养物。在37°C下孵育，同时以260rpm振荡。 第3天：注：除非另有说明，否则在室温下执行所有步骤。 将2LLB培养基加入5L无菌烧瓶中，用12mL过夜培养物接种，然后在37°C下孵育3-4小时，同时以260rpm振荡。注意：或者，在1 L挡板烧瓶中在4 x 500 mL培养物中进行细菌培养。 通过在3220×g和4°C下离心10分钟沉淀细胞。 储存在-80°C直至进一步使用。 第4天： 平衡步骤3.1.4中制备的色谱柱。用30 mL裂解缓冲液。 使用血清学移液管将沉淀重悬于20mL裂解缓冲液中。 用130瓦探针超声仪（见 材料表，探针尖端直径：6 mm）在冰上裂解细胞，参数如下：11 x 20 s脉冲打开;20 s 脉冲关闭，70% 振幅（有关程序详细信息，请参见步骤 2.16）。 超声处理后立即通过在4°C下以21130×g离心20分钟除去细胞碎片。 将裂解物放在冰上。 将上清液加载到色谱柱上，让它通过。 用以下裂解和洗脱缓冲液的混合物洗涤色谱柱。 洗涤0：使用30 mL裂解缓冲液。 洗涤1：使用30mL的5mM咪唑（29mL裂解缓冲液，1mL洗脱缓冲液）。 洗涤2：使用60mL25mM咪唑（50mL裂解缓冲液，10mL洗脱缓冲液）。 洗涤3：使用30mL 40mM咪唑（22mL裂解缓冲液，8mL洗脱缓冲液）。 洗涤4：使用30mL的60mM咪唑（18mL裂解缓冲液，12mL洗脱缓冲液）。 用7.5mL洗脱缓冲液洗脱核糖体。始终将洗脱的蛋白质放在冰上。 将22μL纯β巯基乙醇加入45mL核糖体缓冲液中。注意：β巯基乙醇是有毒的。采取安全预防措施，在通风橱中工作。 将洗脱液加入15 mL离心过滤器中，浓缩至1 mL。 向浓缩样品中加入15mL核糖体缓冲液，并再次浓缩至1mL。注意：重复上一步两次。 储存在-80°C直至进一步使用。注意：一轮交换/浓缩需要大约60分钟，在4°C下以3220×g离心。 在缓冲区交换期间，按照第 1.4 节中的规定恢复列。 第5天： 通过测量在核糖体缓冲液中以1：100稀释的样品在260 nM处的吸光度来确定核糖体浓度。稀释溶液的吸光度值为10对应于23μM的未稀释溶液，如前所述16。 实现 3.45 μM 的最终高液浓度。为了调节浓度，用核糖体缓冲液稀释核糖体，或者通过在4°C的3 kDa 0.5mL离心过滤器中以14000×g进一步浓缩它们。 注意：为了获得最佳的系统表达，请进行核糖体浓度滴定（第5.2节，补充表7）。 使用SDS-PAGE（图3A）验证核糖体组成，如第1.3.3节所述。用7.5μL水稀释2.5μL样品，与10μL2x Laemmli缓冲液混合，然后将5μL和2.5μL样品上样到凝胶上。 无标签核糖体纯化注意：无标记核糖体纯化是使用FPLC系统（材料表）进行的，并且基于使用2 x 5 mL丁基柱的疏水相互作用色谱（材料表）。虽然核糖体可以从任何菌株中纯化，但使用 大肠杆菌A19（ 耶鲁大学CGSC的大肠杆菌 遗传资源）菌株是有利的，因为它的RNase I缺失22。在冷室或冷却柜中在4°C下进行纯化。通常的产量约为0.5 mL的10μM核糖体，相当于500多个10μL PURE反应。 第1天： 制备细菌培养基和添加剂培养基，如 补充表1所述。 准备并消毒所需材料，包括移液器吸头、5 L 锥形瓶和 100 mL 锥形瓶。 制备缓冲液和补充剂，如 补充表2中所述。使用瓶顶过滤器（0.45μm）对所有缓冲液进行过滤，并将其储存在4°C。 第2天： 为了准备 大肠杆菌 A19菌株的过夜培养物，在100 mL锥形瓶中接种35mLLB培养基。在37°C下孵育，同时以260rpm振荡。 第3天： 将2LLB培养基转移到5L无菌挡板烧瓶中，用30mL过夜培养物接种，然后在37°C下孵育3-4小时，同时以200rpm振荡。 通过在4°C下以4000×g离心15分钟来沉淀细胞。 将沉淀重悬于25mL悬浮缓冲液中，并储存在-80°C直至进一步使用。 第4天： 与步骤 3.2.13-3.2.19 并行执行步骤 3.2.8-3.2.12。 使用130瓦探针超声仪（参见 材料表 和探针尖端直径：6 mm）在冰上解冻和裂解细胞，参数如下：12 x 20 s脉冲打开;20 s 脉冲关闭，70% 振幅（参见步骤 2.16 程序详细信息）。 立即通过在4°C下以20000×g离心20分钟除去细胞碎片。 吸出上清液并测量体积。加入等体积的悬浮缓冲液（高盐）以将硫酸铵的最终浓度调节至1.5M并充分混合。 通过在4°C下以20000×g离心20分钟除去沉淀物。 在FPLC纯化之前，使用0.45μm聚醚砜膜注射器过滤上清液，并将滤液收集在100mL玻璃瓶中。始终将上清液保持在4°C。 设置FPLC系统，使用双丁基柱（2 x 5 mL）进行疏水相互作用色谱纯化，如下所示。对于此设置，一个色谱柱体积 （CV） 是指 10 mL 的体积。 需要三个入口：两个作为缓冲线，一个作为样品线。由于净化器的默认设置，分别选择缓冲区C和缓冲区D的行A1和B1以及行A2作为样品线是很方便的。应用 4 mL/min 的默认流速，但泵清洗 （10 mL/min） 除外，除非另有说明。注意：由于TCEP是一种昂贵的试剂，因此只有在平衡步骤之后才将相应量的量加入缓冲液C和D中。 在20%（v / v））乙醇中执行系统泵清洗，以清洁系统并去除先前纯化中的潜在污染物。手动设置 0.2 mL/min 的流速并安装色谱柱。停止流动。 用水执行系统泵清洗。用3 CV的水清洗色谱柱。 平衡：将入口 A1 和 A2 置于缓冲液 C 中，入口 B1 置于不含 TCEP 的缓冲液 D 中。执行泵清洗并用4 CV缓冲液C平衡色谱柱。 将 TCEP 添加到缓冲区 C 和 D 中。 准备15 mL管或透明的圆形馏分收集管到馏分收集器以收集4-5 mL洗脱级分。 装载：将入口A2放入含有过滤样品的瓶子中。将大约90%的样品体积加载到色谱柱上。用20 mL含TCEP的缓冲液C稀释样品，并将10mL样品倒入柱上。重复稀释步骤至少两次，并将尽可能多的样品倒入色谱柱上。确保没有空气被吸入机器至关重要。 洗涤步骤1：用3 CV缓冲液C洗涤以除去未结合的组分。 洗涤步骤2：用5 CV的80%缓冲液C和20%缓冲液D洗涤。 洗脱：通过施用50%的缓冲液C和50%的缓冲液D洗脱产物，总洗脱体积为5 CV。 洗涤步骤3：使用100%缓冲液D洗脱所有强烈相互作用的污染物，总体积为5 CV。 分析样品分数在260或280 nM处的吸收光谱（图4）。第一个峰显示加载和第一个洗涤步骤期间洗脱的未吸收蛋白质;第二个峰值显示在第二个洗涤步骤中洗脱的污染物。第三个峰值监测最终产品，最后一个峰值显示强烈相互作用的污染物。汇集与第三峰相对应的所有样品馏分以进行进一步处理。始终将洗脱的蛋白质放在冰上。 将回收的馏分轻轻覆盖在四个聚碳酸酯超速离心管中的15 mL缓冲液上。将最多15 mL样品加入15 mL缓冲液中。确保很好地平衡管子的重量。通过在4°C下以100000×g超速离心16小时沉淀核糖体。注：确保超速离心管中没有裂缝。 清理并重置列，如下所示。5 mL/min 的流速效果很好。将所有进水口放入水中，然后执行泵清洗。用2 CV的水清洗色谱柱。 将入口放入0.5 M NaOH溶液中，进行泵洗，然后用3 CV的NaOH洗涤色谱柱。 将进水口放入水中，进行泵洗，然后在2 CV水中洗涤色谱柱。 将入口置于0.1M乙酸溶液中，进行泵洗，然后用3 CV的乙酸溶液洗涤色谱柱。 泵洗并用2 CV的水清洗柱子。 将所有入口放入20%（v / v））乙醇中，执行泵洗涤步骤，并通过用3 CV的20%（v / v）乙醇溶液洗涤色谱柱，将色谱柱储存在20%（v / v））乙醇中。注：确保系统永不干涸或吸入空气。切勿将缓冲液直接涂在乙醇上，或将乙醇涂在缓冲液上。始终在中间加入一个水洗步骤，否则存在沉淀物堵塞色谱柱的风险。确保添加足够的样品收集管。 第5天： 弃去上清液并小心地，在不干扰半透明沉淀的情况下，用0.5mL冰冷的核糖体缓冲液洗涤每个沉淀。重复此步骤两次。 使用磁力搅拌棒（直径3mM，10mM长度）将每个透明沉淀重悬于100μL核糖体缓冲液中，使用尽可能低的速度在磁力搅拌器上。收集重悬的核糖体，并用额外的50μL核糖体缓冲液洗涤管。注意：半透明的颗粒很难看到。因此，小心地从管的侧面清洗颗粒。 通过测量在核糖体缓冲液中以1：100的比例稀释的样品在260 nM处的吸光度来确定核糖体浓度。10的稀释溶液的吸光度对应于23μM的未稀释溶液，如前所述16。 实现 10 μM 的最终储液浓度。为了调节浓度，用核糖体缓冲液稀释核糖体，或者通过在4°C的3 kDa离心过滤器中以14000×g离心进一步浓缩它们。 注：为了获得最佳的系统表达，请进行核糖体滴定（第5.2节，补充表7）。 用SDS-PAGE（图3A）验证核糖体组成，如第1.3.3节所述。用7.5μL水稀释2.5μL样品，与10μL2x Laemmli缓冲液混合，然后将5μL和2.5μL样品上样到凝胶中。 4. 能源解决方案 注：这里介绍的2.5x能量溶液的组成是一个适用于标准TX-TL反应的溶液的示例。为了优化时间安排，请在第2天准备能量解决方案。详细解释了氨基酸溶液的制备，然后是最终的制备程序。 氨基酸溶液注意：批量制备氨基酸溶液。制备至少2000μL的最终体积所需的氨基酸储备溶液的量将减少原本非常少量的称量误差。氨基酸溶液的总浓度受氨基酸的溶解度和相应的储备溶液浓度的限制。对于标准PURE系统，制备终浓度为3.25 mM的溶液。使用氨基酸溶液计算表（补充表3）作为模板。使用盐形式的半胱氨酸，以确保足够的溶解度。避免使用基于KOH的氨基酸制备方法。可以直接称量氨基酸的确切量到最终氨基酸溶液中，而无需为所有氨基酸制备储备溶液。但是，这更具挑战性且不那么精确。 按照 补充表3所述，为每种氨基酸准备储备溶液，酪氨酸除外。注意：由于氨基酸在水中的溶解度不同，储备溶液的相应建议浓度不同。 最小质量[mg]提供了获得目标总体积的足够量的储备溶液所需的近似最小质量，作为参考。注：最小质量的盈余为10%。 为了更容易地制备溶液，不要称量确切的氨基酸量，而是对于手头的质量，调整水的量以达到所需的浓度。使用 补充表3中的电子表格，根据填充的实际质量（浅黄色细胞）和所需浓度计算所需的去离子水（添加水[μL]）的量。 通过涡旋溶解氨基酸储备溶液，直到所有沉淀物溶解。单个氨基酸储备溶液可以在-20°C下储存数周。注意：有些氨基酸很难溶解在水中;该过程可能需要一些时间。 称取获得终浓度3.25mM所需的酪氨酸的确切量，直接进入用于氨基酸溶液的管中。注意：酪氨酸很难溶解在水中。直接添加它，而不是准备储备溶液。 加入相应量的氨基酸储备溶液和最终体积中指示的水，以加入[μL]柱（浅蓝色细胞）并涡旋溶液。将完成的氨基酸溶液储存在-80°C直至进一步使用。 能源解决方案的制备注意：总共2.5x能量溶液分别含有0.75mM的每个氨基酸，29.5mM的乙酸镁，250mM的谷氨酸钾，5mM的ATP和GTP，2.5mM的CTP，UTP和TCEP，分别来自 大肠杆菌 MRE 600的8.75mg / mL的tRNA，50mM的磷酸肌酸，0.05mM的亚叶酸， 5 mM的亚精胺和125mM的HEPES。首次使用的用户以200μL的小批量制备能量溶液，将根据 补充表4 制备的单个溶液储存在-20°C或-80°C下供以后使用。 在冰上解冻 补充表5 中提到的所有水溶液。 同时，为 补充表4中列出的其余组分准备库存溶液。准备后将所有溶液放在冰上。注意：将500μLRNase和不含DNA酶的水直接加入小瓶中以溶解冻干的tRNA。通过轻柔的涡旋充分混合;限制移液以避免引入 RNaase。 将储备溶液和水的计算体积（补充表5）相加，并使用涡旋充分混合。始终将溶液放在冰上。 通过将1μL移液到pH试纸上来测量溶液的pH值，以确保溶液的pH值为中性。 将能量溶液以每管50-100μL等分在冰上，并储存在-80°C直至进一步使用。在等分时，经常涡旋主储液以防止组分沉淀。注意：可选地，对新制造的能源溶液进行活性测定，以对抗商业能源溶液，例如PURExpress中的溶液A。如果观察到系统与能量溶液的性能显着降低，则通过滴定（5-20mM）优化离子浓度，特别是镁离子可能是有利的。 5. 一锅纯反应 基因模板注意：编码在T7启动子下游的蛋白质可以用来自线性或环状DNA的PURE表达。通过使用延伸PCR生成线性DNA模板，可以省略繁琐的克隆步骤。本研究的线性模板由PCR生成，如下所述，使用高保真DNA聚合酶（材料表）。本研究中使用的引物序列，熔化温度和热循环仪设置在 补充表6中指定。DNA模板的制备不包括在每日时间表中。 按照聚合酶供应商的建议设置 PCR 反应。注：高保真DNA聚合酶的优化参数（材料表）见补充表6。 使用基因特异性引物（500 nM）从质粒或基因组中扩增靶基因（例如eGFP）作为线性模板（有关参数，请参见补充表6）。 扩增产生较短的延伸，为以下扩展PCR步骤提供退火序列。 检查琼脂糖凝胶上的扩增子是否正确大小和纯度。 使用扩增的DNA作为后续扩展步骤的模板。设置至少50μL的反应。 使用扩展引物（2.5 nM）运行10个PCR扩增循环。完成扩增循环后，立即将最终引物（500 nM）加入相同的反应中，并运行30个循环以扩增扩展的PCR产物。在 补充表6中找到熔化温度和引物序列。 使用DNA纯化试剂盒纯化DNA片段，并在不含核酸酶的水中洗脱DNA，而不是含有洗脱缓冲液的EDTA。 检查琼脂糖凝胶上的线性模板，以确定正确的大小和纯度。 使用紫外可见分光光度计测量ng / μL中的DNA浓度。 设置 PURE 反应注意：最终的反应成分是1x能量溶液，无标签核糖体或His-tag核糖体，OnePot PURE蛋白和DNA模板。反应体积比包括40%的能量溶液，30%的蛋白质和核糖体溶液，以及30%的DNA和水。典型的反应体积在5μL和25μL之间变化，在读板器上连续定量荧光蛋白的表达。使用绿色利斯 in vitro 翻译标记系统将荧光标记的赖氨酸残基结合到新合成的蛋白质中，以验证SDS-PAGE凝胶上非荧光蛋白的表达。给出了一个示例反应模板 附表7 帮助建立纯细胞无表达反应。黄色的细胞表示用户输入的值，橙色的细胞表示要选择性地添加到反应中的其他试剂。保持组分的体积比精确，以确保正确的离子平衡。例如，为了达到更高的蛋白质浓度，增加OnePot蛋白质溶液的浓度;然而，不要增加加入到反应中的蛋白质溶液的体积。在电子表格中填写相应黄色细胞中DNA的浓度[ng / μL]和长度[碱基对]。使用2-10nM的DNA进行反应。 以μL为单位填充所需的总反应体积。 从冰箱中取出所需的试剂，并在冰上解冻。注意：可以在不降低功能的情况下重新冻结组件。但是，请尽可能减少冻融循环次数，并将样品储存在冰上的时间。 将计算出的水、DNA和能量溶液的量移液到PCR管的一侧或384孔板上孔的一角。在同一侧添加所需量的任何其他试剂。尽量减少每个实验的样品数量，以避免样品蒸发和实验开始时间偏差。注意：至关重要的是保持能量成分与蛋白质成分的物理分离，以避免能源的过早消耗和较低的产量。 将计算出的蛋白质和核糖体溶液量移液到PCR管的另一侧或384孔板的另一角。注意：尽可能使用预混液，以减少移液错误的影响。经过初步测试后，核糖体和蛋白质溶液可以混合并储存为一种溶液。 旋转短时间（30秒）以合并反应组分。为了防止读板器实验过程中的蒸发，加入35μL液体蜡并用透明密封剂密封板（见 材料表）。 在37°C下孵育至少3小时。 对于读板器上的读数，每2分钟测量一次所需波长的荧光强度（代表性结果如图 3B所示）。 对绿色裂隙标记的样品执行以下步骤。 无细胞表达后，用0.16μg/ μL RNase A在37°C下孵育样品30分钟，以除去Green Lys标记试剂盒的荧光背景。注意：使用 RNase A，因为其他类型的 RNases 不能很好地去除背景。 通过运行SDS-PAGE可视化蛋白质表达，如1.3.3节中所述。将未染色的凝胶在去离子水中轻轻洗涤，并使用488nm的激发波长在荧光成像仪上成像。 随后，使用传统的考马斯染色方法对凝胶进行染色。有关合适的参数，请参见 1.3.3 节。注意：使用推荐的核糖体浓度对蛋白质溶液进行滴定，如果需要，之后以最佳OnePot蛋白浓度滴定核糖体。使用商用PURExpress ΔRibosome试剂盒作为阳性对照。溶液A，因子混合物和核糖体溶液分别对应于制备的能量，OnePot蛋白溶液和纯化的核糖体。