Özet

הדמיה וכימות של TGFβ/BMP/SMAD איתות בתנאי לחץ שונים של גיסת נוזלים באמצעות קרבה-קשירה-אסאי

Published: September 14, 2021
doi:

Özet

כאן, אנו מקימים פרוטוקול כדי לדמיין ולנתח בו זמנית מתחמי SMAD מרובים באמצעות בדיקת קשירת קרבה (PLA) בתאי אנדותל החשופים לתנאי לחץ גזיר נוזלים פתולוגיים ופיזיולוגיים.

Abstract

שינוי גורם גדילה β (TGFβ)/חלבון מורפוגנטי עצם (BMP) איתות מוסדר ומאוזן היטב במהלך הפיתוח וההומאוסטזיס של מערכת כלי הדם ולכן, הסרת הפיקוח במסלול איתות זה גורמת לפתולוגיות כלי דם חמורות, כגון יתר לחץ דם בעורק הריאות, טלנגיקטזיה דימומית תורשתית וטרשת עורקים. תאי אנדותל (ECs), כמו השכבה הפנימית ביותר של כלי הדם, חשופים כל הזמן ללחץ גיסת נוזלים (SS). דפוסים חריגים של SS נוזל הוכחו כדי לשפר את זהות TGFβ/BMP, אשר, יחד עם גירויים אחרים, לגרום טרוגנזה. ביחס לכך, atheroprone, למינאר נמוך SS נמצא כדי לשפר את זהות TGFβ / BMP בעוד SS atheroprotective, למינר גבוה, מפחית איתות זה. כדי לנתח ביעילות את ההפעלה של מסלולים אלה, עיצבנו זרימת עבודה כדי לחקור את היווצרות מתחמי גורם התמלול תחת SS למינאר נמוך ותנאי SS למינאר גבוהים באמצעות מערכת משאבה פנאומטית זמינה מסחרית ובוח קשירת קרבה (PLA).

איתות TGFβ/BMP פעיל דורש היווצרות מתחמי SMAD טרימרים המורכבים משני SMAD רגולטוריים (R-SMAD); SMAD2/3 ו- SMAD1/5/8 עבור איתות TGFβ ו- BMP, בהתאמה) עם מתווך נפוץ SMAD (SMAD משותף; SMAD4). באמצעות PLA מיקוד subunits שונים של קומפלקס SMAD טרימר, כלומר, או R-SMAD / co-SMAD או R-SMAD / R-SMAD / R-SMAD, היווצרות של מתחמי גורם שעתוק SMAD פעיל ניתן למדוד כמותית מרחבית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

השימוש בשקופיות זרימה עם 6 ערוצים מקבילים קטנים, שניתן לחבר בסדרה, מאפשר לחקור את גורם התמלול היווצרות מורכבת והכלה של פקדים נחוצים.

זרימת העבודה המוסברת כאן יכולה להיות מותאמת בקלות למחקרים המתמקדים בקרבה של SMADs לגורמי שעתוק אחרים או למתחמי גורם תמלול שאינם SMADs, בתנאי SS זורמים שונים. זרימת העבודה המוצגת כאן מציגה דרך מהירה ויעילה ללמוד את האיתות TGFβ/BMP המושרה ב- SS הנוזלי ב- ECs, הן כמותית והן מרחבית.

Introduction

חלבונים של גורמי גדילה משתנים בטא (TGFβ) superfamily הם ציטוקינים pleiotropic עם מגוון רחב של חברים, כולל TGFβs, חלבונים מורפוגנטיים עצם (BMPs), ו Activins1,2. כריכת ליגנד גורמת להיווצרות של אוליגומרים קולטנים המובילים לזרחן, ובכך, הפעלה של SMAD רגולטורי ציטוטולי (R-SMAD). בהתאם למשפחת המשנה של ליגנדים, R-SMADs שונים מופעלים1,2. בעוד TGFβs ו Activins בעיקר לגרום זרחן של SMAD2/3, BMPs לגרום SMAD1/5/8 זרחן. עם זאת, ישנן עדויות מצטברות כי BMPs ו- TGFβs/Activins מפעילים גם R-SMADs של תת-המשפחה האחרת בהתאמה, בתהליך המכונה ‘איתות לרוחב’3,4,5,6,7,8 וכי ישנם מתחמי SMAD מעורבים המורכבים משניהם, SMAD1/5 ו- SMAD2/3, חברים3,9 . שני R-SMADs מופעלים לאחר מכן יוצרים מתחמים טרימרים עם המתווך המשותף SMAD4. מתחמי גורמי שעתוק אלה מסוגלים לאחר מכן להעביר את ההקצאה לגרעין ולווסת את שעתוק הגנים היעד. SMADs יכול לקיים אינטראקציה עם מגוון של מפעילי שיתוף תעתיק שונים ומדכאים משותפים, מה שמוביל לגיוון האפשרויות לווסת את הגנים היעד10. הסרת הפיקוח על איתות SMAD יש השלכות חמורות במגוון מחלות. בהתאם לכך, איתות TGFβ/BMP לא מאוזן עלול להוביל לפתולוגיות כלי דם חמורות, כגון יתר לחץ דם בעורק הריאות, טלנגיקטזיה דימומית תורשתית, או טרשת עורקים3,11,12,13,14.

תאי אנדותל (ECs) יוצרים את השכבה הפנימית ביותר של כלי הדם ולכן הם חשופים ללחץ גזוז (SS), כוח חיכוך המופעל על ידי הזרימה הצמיגית של הדם. מעניין, ECs המתגוררים בחלקים של vasculature, אשר חשופים לרמות גבוהות של מדים, למינאר SS, נשמרים במצב הומיאוסטטי ורגיע. לעומת זאת, ECs שחווים SS נמוך, לא אחיד, למשל, ב bifurcations או עקמומיות פחותה של קשת אב העורקים, הם שגשוג ולהפעיל מסלולים דלקתיים15. בתורו, אתרים של ECs מתפקד נוטים לפתח טרשת עורקים. באופן מעניין, מחשבים אלקטרוניים באזורים אלה של אתראופרון מציגים רמות גבוהות באופן חריג של SMAD2/3 ו- SMAD1/516,17,18. בהקשר זה, איתות TGFβ/BMP משופר נמצא כאירוע מוקדם בהתפתחות נגעים טרשת עורקים19 והפרעה לאיתות BMP נמצאה כמפחיתה באופן משמעותי דלקת כלי דם, היווצרות אתראומה והסתיידות נלווית20.

קרבה קשירת Assay (PLA) היא טכניקה ביוכימית לחקר אינטראקציות חלבון חלבון במקום 21,22. הוא מסתמך על הספציפיות של נוגדנים של מינים שונים שיכולים לקשור חלבונים ממוקדים של עניין, ומאפשר זיהוי ספציפי מאוד של אינטראקציות חלבון אנדוגני ברמה של תא אחד. כאן, נוגדנים ראשוניים צריכים להיקשר לאפיטופ היעד שלהם במרחק של פחות מ -40 ננומטר כדי לאפשר את הגילוי23. לכן, PLA מועיל מאוד על גישות אימונו-immunoprecipitation מסורתיות, שבו כמה מיליוני תאים נדרשים כדי לזהות אינטראקציות חלבון אנדוגני. ב- PLA, נוגדנים משניים ספציפיים למינים, המקושרים באופן קוולנטי לרסיסי DNA (המכונים בדיקות פלוס ומינוס), קושרים את הנוגדנים העיקריים ואם חלבוני העניין מתקשרים, בדיקות פלוס ומינוס מגיעות בסמיכות. הדנ”א נקשר בשלב הבא והגברת המעגל המתגלגל של הדנ”א המעגלי מתאפשרת. במהלך ההגברה, oligonucleotides משלימים שכותרתו פלואורסצנטרית נקשרים לדנ”א המסונתז, ומאפשרים לאינטראקציות חלבון אלה להיות חזותיות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית.

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר למדענים להשוות כמותית את מספר מתחמי שעתוק SMAD הפעילים בתנאי Atheroprotective ו atheroprone SS במבחנה באמצעות PLA. SS נוצר באמצעות מערכת משאבה פנאומטית ניתנת לתכנות המסוגלת ליצור זרימה חד-כיוונית למינארית של רמות מוגדרות ומאפשרת עלייה צעדים של קצבי הזרימה. שיטה זו מאפשרת זיהוי של אינטראקציות בין SMAD1/5 או SMAD2/3 עם SMAD4, כמו גם מתחמי R-SMAD מעורבים. ניתן להרחיב אותו בקלות כדי לנתח אינטראקציות של SMADs עם רגולטורים משותפים תמלול או כדי לתמלול גורמים מתחמים אחרים מלבד SMADs. איור 1 מציג את השלבים העיקריים של הפרוטוקול המוצג להלן.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול המתואר. (A) תאים הנזרעים בשקופיות של 6 ערוצים חשופים ללחץ גניסיה עם מערכת משאבה פנאומטית. (B) תאים קבועים משמשים לניסוי PLA או לתנאי בקרה. (C) תמונות של ניסויי PLA נרכשות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומנותחות באמצעות תוכנת ניתוח ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

1. תרבית התא וחשיפה ללחץ גזל הערה: ECs וריד טבור אנושי (HUVECs) שימשו כדוגמה לחקר אינטראקציה המושרה SS של SMADs. ניתן להחיל את הפרוטוקול המתואר להלן על כל סוג תא רספונסיבי של SS. מעיל שקופית 6 ערוצים עם 0.1% ג’לטין עור חזירי PBS במשך 30 דקות ב 37 °C (7 °F). זרע HUVECs בשקופיות 6 ערוצים מצופו?…

Representative Results

השתמשנו בעבר PLA כדי לזהות אינטראקציות של חלבוני SMAD שונים3 וניתחנו שינויים המושרה מתח גיזה בזרחן SMAD28. כאן, שתי השיטות שולבו עם הפרוטוקול שתואר לעיל. HUVECs היו נתונים ללחץ גיסת של 1 גוון / cm2 ו 30 גוון / cm2 ונותחו עבור אינטראקציות של גורמי שעתוק SM…

Discussion

הפרוטוקול מבוסס PLA המתואר כאן מציע דרך יעילה לקבוע קרבה של שני חלבונים (למשל, האינטראקציה הישירה שלהם) ב- ECs החשופים ללחץ גיסת עם רזולוציה כמותית ומרחבית. באמצעות שקופיות זרימה עם ערוצים מקבילים מרובים, ניתן לבחון מספר אינטראקציות חלבון שונות בו זמנית בתאים בתנאים מכניים זהים. לעומת זאת, מע?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לד”ר מריה רייכנבך ולט”ר כריסטיאן הייפן על תמיכתם במערכת הזרימה ואלינור פוקס ויוניון שיאו על שקראו את כתב היד בביקורתיות. P-L.M. מומן על ידי בית הספר הבינלאומי מקס פלאנק מחקר IMPRS-ביולוגיה וחישוב (IMPRS-BAC). PK קיבלה מימון על ידי DFG-SFB1444. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.

Materials

µ-Slide VI 0.4 ibidi 80606 6-channel slide
Ammonium Chloride Carl Roth K298.1 Quenching
Bovine Serum Albumin Carl Roth 8076.4 Blocking
DAPI Sigma Aldrich/ Merck D9542 Stain DNA/Nuclei
DPBS PAN Biotech P04-53500 PBS
Duolink In Situ Detection Reagents Green Sigma Aldrich/ Merck DUO92014 PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS Sigma Aldrich/ Merck DUO92004 MINUS probe
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma Aldrich/ Merck DUO92002 PLUS probe
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence Sigma Aldrich/ Merck DUO82049 PLA wash buffers A and B
Endothelial Cell Growth Supplement Corning supplement for medium (ECGS)
Fetal calf Serum supplement for medium
FIJI Image Analysis software
Formaldehyde solution 4% buffered KLINIPATH/VWR VWRK4186.BO1 PFA
Full medium M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +  25 µg/mL Hep +   50 µg/mL ECGS
Gelatin from porcine skin, Type A Sigma Aldrich G2500 Use 0.1% in PBS for coating of flow channels
GraphPad Prism v.7 GarphPad Statistical Program used for the Plots and statistical calculations
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma Aldrich H4784-250MG supplement for medium (Hep)
HUVECs
ibidi Mounting Medium ibidi 50001 Liquid mounting medium
ibidi Pump System ibidi 10902 pneumatic pump
Leica TCS SP8 Leica confocal microscope
L-Glutamin 200mM PAN Biotech P04-80100 supplement for medium (L-Glu)
Medium 199 Sigma Aldrich M2154 Base medium
mouse anti- SMAD1 Antibody Abcam ab53745 Suited for PLA
mouse anti- SMAD2/3 Antibody BD Bioscience 610843 Not suited for PLA in combination with CST 9515
mousee anti- SMAD4 Antibody Sanata Cruz Biotechnology sc-7966 Suited for PLA
Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml PAN Biotech P06-07100 supplement for medium (P/S)
Perfusion Set WHITE ibidi 10963 Tubings used for 1 dyn/cm2
Perfusion Set YELLOW and GREEN ibidi 10964 Tubings used for 30 dyn/cm2
rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody Cell Signaling Technologies 9516 Suited for PLA
rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody Cell Signaling Technologies 8685 Suited for PLA
rabbit anti- SMAD4 Antibody Cell Signaling Technologies 9515 Not suited for PLA in combination with BD 610843
Serial Connector for µ-Slides ibidi 10830 serial connection tubes
Triton X-100 Carl Roth 6683.1 Permeabilization

Referanslar

  1. Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition. Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).
  2. Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).
  3. Hiepen, C., et al. BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGFβ responses and altered cell mechanics. PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).
  4. Hildebrandt, S., et al. ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
  5. Goumans, M. J., et al. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors. The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).
  6. Goumans, M. J., et al. Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling. Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).
  7. Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth. Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).
  8. Ramachandran, A., et al. TGF-β uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition. eLife. 7, 31756 (2018).
  9. Flanders, K. C., et al. Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).
  10. Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T., Dijke, P. T., Heldin, C. -. H. . Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. , 277-293 (2006).
  11. Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).
  12. Cai, J., Pardali, E., Sánchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).
  13. Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. Deregulated TGF-β/BMP signaling in vascular malformations. Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).
  14. MacCarrick, G., et al. Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management. Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).
  15. Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
  16. Min, E., et al. Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling. bioRxiv. , 691980 (2019).
  17. Zhou, J., et al. BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).
  18. Zhou, J., et al. Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).
  19. van Dijk, R. A., et al. Visualizing TGF-β and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation. Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).
  20. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).
  21. Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
  22. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  23. Alam, M. S. Proximity Ligation Assay (PLA). Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58 (2018).
  24. Application Note 03: Growing Cells in µ-Channels. ibidi Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf (2012)
  25. Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf (2019)
  26. ibidi. Application Note 31: Instructions µ-Slide VI 0.4. ibidi. , (2013).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Reichenbach, M., et al. Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-β induced osteogenic target genes. İleri Biyoloji. 5 (2), 2000051 (2021).
  29. Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. It takes two to tango: Endothelial TGFβ/BMP signaling crosstalk with mechanobiology. Cells. 9 (9), 1965 (2020).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Mendez, P., Obendorf, L., Knaus, P. Visualization and Quantification of TGFβ/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay. J. Vis. Exp. (175), e62608, doi:10.3791/62608 (2021).

View Video