Cuantificación de la función ventricular izquierda del corazón de ratón, la distensión miocárdica y las fuerzas hemodinámicas mediante imágenes de resonancia magnética cardiovascular

Los experimentos con animales descritos se llevan a cabo de acuerdo con las directrices de la Unión Europea para el bienestar de los animales de laboratorio (Directiva 2010/63/UE) y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Centro Médico Académico. 1. Configuración y preparación animal Antes de comenzar el experimento, asegúrese de que haya suficiente anestesia con isoflurano durante al menos 2 h, y que la batería disponible para ECG y monitoreo respiratorio esté suficientemente cargada. Asegúrese de que el área del escáner esté equipada con un tubo de extracción de humos de trabajo para eliminar el exceso de isoflurano. Prepare la base del ratón(Figura 1A)y encienda el sistema de calefacción del animal con la temperatura establecida en 40 °C. Prepare el módulo de interfaz RESPIRATORIA/ECG y la configuración de la batería(Figura 1B),e inicie el software para el monitoreo en tiempo real del ECG y las señales respiratorias(Figura 1C). Retire el ratón de su jaula de alojamiento y mida el peso corporal. Coloque el ratón en una cámara de inducción de anestesia debajo de un brazo de extracción de campana de humos y proporcione 3-4% de isoflurano en una mezcla de 0.2 L / min O2 y 0.2 L / min de aire medicinal. Después de que el animal esté completamente anestesiado, aplique una pequeña gota de ungüento para los ojos en cada ojo y cierre los párpados del ratón. Coloque el ratón en posición supina sobre la base del ratón. Enganche los incisivos del ratón en la barra de mordida de la base del ratón y ajuste el cono de la nariz para que encaje correctamente (Figura 1A). Verifique visualmente si la respiración es estable por debajo de 100 respiraciones / min, y reduzca el isoflurano a ~ 2% durante la preparación animal. Mueva la base del ratón de tal manera que el corazón se encuentre en la parte del soporte de la cuna que terminará en el centro de la bobina de RF y el isocentro del imán. Use vaselina para insertar la sonda de temperatura rectal y pegue con cinta adhesiva el cable de fibra óptica de la sonda de temperatura a la base del mouse. Coloque el balón respiratorio en la parte inferior del abdomen del ratón y asegúrelo con cinta adhesiva. Inserte dos agujas de electrodo de ECG por vía subcutánea en el tórax a la altura de las patas delanteras y péguelas suavemente para evitar el movimiento (Figura 1A). Compruebe si las señales de respiración y ECG son de calidad suficiente, y si el software detecta los puntos gatillo correctos(Figura 1C). Asegúrese de que la frecuencia respiratoria sea de 50-80 respiraciones / min, la frecuencia cardíaca ~ 400-600 latidos / min y la temperatura corporal alrededor de 37 ° C. Ajustar la administración de isoflurano cuando la frecuencia respiratoria esté fuera de este rango, y reducir la temperatura del sistema de calentamiento animal si la temperatura corporal tiende a exceder los 37 °C. Coloque la bobina de RF sobre el ratón.NOTA: Dependiendo del sistema, esto podría requerir la desconexión temporal de los electrodos de ECG y los tapones de balón respiratorio del módulo de interfaz respiratoria/ECG. Conecte los cables de la bobina y coloque la base en el orificio del imán. Compruebe si la señal de ECG sigue siendo estable. Si la señal de ECG es subóptima, reposicione los electrodos de ECG para una mejor señal, ya que esto no se puede hacer en una etapa posterior sin cambiar significativamente la orientación del animal. Figura 1:Preparación animal y configuración del equipo para imágenes CMR del corazón del ratón. (A) Ratón completamente anestesiado en posición supina, colocado en la cuna de ratón calentada con una almohada neumática respiratoria colocada en el abdomen, sensor de temperatura de fibra óptica rectal y derivaciones de ECG subcutáneas en el pecho cerca de las patas delanteras. (B) Bobina del cuerpo del ratón colocada sobre la base del ratón, con cables de ECG y almohada respiratoria reconectada al ECG y la interfaz respiratoria antes de colocar el soporte en el imán de resonancia magnética. (C)Representación del ECG y las señales respiratorias en un software dedicado a la monitorización de pequeños animales. El pico R de la señal de ECG se detecta y se utiliza como punto de partida para la adquisición de la señal de resonancia magnética. Un período de borrado entre los picos R se puede ajustar manualmente en función del período de un latido cardíaco. La activación solo puede ocurrir durante la meseta respiratoria (línea verde en el panel central) para la cual el retraso inicial y el ancho máximo se pueden ajustar manualmente. Abreviaturas: CMR = resonancia magnética cardiovascular; ECG = electrocardiograma; RM = resonancia magnética. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 2. Calibración y activación de la resonancia magnética Ajuste los parámetros de ECG y de cierre respiratorio dentro del software de monitoreo de señales de modo que los puntos gatillo se generen en los picos R y solo durante la parte plana de la señal respiratoria. Para minimizar los errores de ecgáster, establezca un período de borrado que sea 10-15 ms más corto que el intervalo R-R.NOTA: Este período de borrado debe ajustarse durante todo el experimento si se producen cambios en la frecuencia cardíaca. Realice una calibración de frecuencia central y un escaneo SCOUT estándar (singate) con desplazamiento cero para determinar la posición del mouse en el escáner en direcciones coronal, axial y sagital. Si el corazón no está posicionado dentro de 0.5-1 cm del centro del campo de visión (FOV), ajuste la posición de la cuna en consecuencia y vuelva a hacer la exploración SCOUT. Realice una calibración manual de shim y RF utilizando los métodos disponibles del proveedor. 3. Planificación y adquisición de escaneos NOTA: Consulte la Tabla 1 para conocer los parámetros de análisis detallados de los siguientes análisis. Basado en el SCOUT inicial, realice un escaneo scout de eco de gradiente de un solo marco (GRE) cerrado(Tabla 1,escaneo 1) con 5 cortes en 3 direcciones ortogonales, y coloque cada pila de cortes en la ubicación aproximada del corazón para ubicar la posición exacta del corazón(Figura 2A). Realice un escaneo de exploración SA de múltiples cortes de un solo fotograma cerrado(Tabla 1,escaneo 2). Con este fin, utilice el explorador GRE anterior para colocar 4-5 cortes en una posición ventricular media izquierda, perpendicular al eje largo del corazón para encontrar una estimación inicial de la vista SA del ventrículo medio, que se necesita para planificar el explorador de 2 cámaras de eje largo(Figura 2B). Para las siguientes exploraciones prospectivas (pasos 3.4-3.6), ajuste el número de cuadros cardíacos (Nframes) de modo que los Nframes × TR sea ~ 60-70% del intervalo R-R.NOTA: La adquisición del 60-70% del intervalo R-R es suficiente para capturar la fase diastólica final del ciclo cardíaco, al tiempo que permite una relajación adicional de T1 durante la diástole final para mejorar el SNR y prevenir la alteración del siguiente pico R por conmutación de gradiente. Realice un escaneo GRE de corte único cerrado para generar el explorador de 2 cámaras (2CH) de eje largo, que combinado con el escaneo SA, es necesario para planificar el escaneo de 4 cámaras (4CH)(Tabla 1,escaneo 3). Con este fin, coloque un corte perpendicular a las vistas SA anteriores que corren paralelas a los puntos de conexión entre el ventrículo izquierdo y derecho. Mueva esta rebanada a la mitad del ventrículo izquierdo y verifique la imagen coronal del explorador GRE si la rebanada está alineada con el eje largo del VI de tal manera que se coloque a través del ápice(Figura 2C). Realice otro escaneo GRE de corte único cerrado para generar el escaneo de exploración de 4 cámaras (4 CANALES), que es necesario para planificar el SA de múltiples cortes y el escaneo de 3 cámaras(Tabla 1,escaneo 4). Con este fin, coloque una rebanada perpendicular a la exploración de exploración 2CH y alinee al centro del eje largo de modo que la rebanada pase a través de la válvula mitral y el ápice. En las vistas SA, ajuste la rebanada de tal manera que se coloque paralela a la pared ventricular posterior y anterior y entre los dos músculos papilares(Figura 2D). Compruebe si la rebanada permanece en el centro del ventrículo durante todo el ciclo cardíaco. Realice un escaneo SA GRE secuencial cerrado de múltiples cortes(Tabla 1,escaneo 5) para mediciones de la función sistólica. Con este fin, coloque una rebanada del ventrículo medio perpendicular al eje largo del VI en las vistas 2CH y 4CH en el centro del corazón, y aumente el número de cortes (típicamente un número impar, por ejemplo, 7 o 9 cortes, sin espacio entre los cortes) para cubrir el corazón desde la base hasta el ápice(Figura 2E). Para las siguientes exploraciones cerradas retrospectivamente (pasos 3.8-3.9), desactive toda la funcionalidad prospectiva de las náuseas cardíacas y respiratorias. Tome nota de la frecuencia cardíaca y respiratoria antes y después de cada exploración cerrada retrospectivamente, y use estos valores para fines de reconstrucción más adelante (paso 5.2.2). Realizar tres exploraciones GRE secuenciales de un solo corte cerradas retrospectivamente en la vista SA del ventrículo medio (para la cuantificación de la relación E’/A’), vista 2CH y 4CH, estas dos últimas que son necesarias para la cuantificación de la tensión miocárdica y los valores de HDF(Tabla 1,exploración 6-8). Si es necesario, optimice las orientaciones finales de los segmentos de 2 CANALES y 4 CANALES en función de las vistas SA de varios cortes, así como de los escaneos exploradores de 2 CANALES y 4 CANALES disponibles. Realice una exploración GRE adicional de una sola rebanada cerrada retrospectivamente en una vista de 3 cámaras (3CH), que combinada con la vista de 2CH y 4CH del paso 3.8 es necesaria para la cuantificación de la tensión miocárdica y los valores de HDF(Tabla 1,exploración 9). Con este fin, coloque una rebanada perpendicular a la vista SA del ventrículo medio similar a la posición de la vista 4CH final del eje largo, y gire la rebanada 45° para pasar de la pared anterior al músculo papilar más cercano a la pared posterior. Inspeccione la rebanada BASAL SA para ver si la rebanada pasa a través de la válvula mitral y aórtica. Inspeccione en la vista final de eje largo 4CH si la división está pasando por el ápice (Figura 2F). Figura 2: Planificación de segmentos para imágenes CMR en un ratón. (A) Planificación de GRE SCOUT a través del corazón en 3 vistas ortogonales utilizando escaneo scout inicial. (B) Planificación de scout de eje corto en las rodajas coronales y sagitales de GRE SCOUT. (C) Planificación de la vista scout 2CH utilizando el scout de eje corto y el slice coronal GRE SCOUT. (D) Planificación de la vista scout 4CH utilizando el scout de eje corto y el scout 2CH. (E) Planificación de la vista de eje corto multicorte utilizando exploradores de 2CH y 4CH. (F) (izquierda) Planificación de las vistas finales de 2CH, 3CH y 4CH utilizando las vistas de eje corto del ventrículo medio y las vistas de exploración de 2CH/4CH. Abreviaturas: CMR = resonancia magnética cardiovascular; GRE = Eco de gradiente; CH = cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Número(s) de escaneo 1 2 3 4 5 6-9 Nombre(s) de análisis Explorador GRE explorador SA multi-slice Explorador 2CH Explorador 4CH SA multi-slice SA, 2CH, 4CH, 3CH total de sectores 15 (3 x 5)* 4-5 1 1 7-9 1 Espesor (mm) 1 1 1 1 1 1 FOV (mm) 60 35 30 30 35 30 Relación FOV 1 1 1 1 1 1 Ángulo de giro 40 20 20 20 20 15 TE (ms)** 3.8 3.4 2.5 2.5 2.5 3.6 TR (ms) 200 1 R-R 7 7 7 8 Nframes 1 1 12-14 12-14 12-14 32 *** Tamaño de la matriz 192 x 192 192 x 192 192 x 192 192 x 192 192 x 192 192 x 192 Desencadenamiento del ECG No Sí Sí Sí Sí retrospectivo Desencadenante respiratorio Sí Sí Sí Sí Sí retrospectivo Promedios 1 3 5 5 5 retrospectiva **** Tiempo total de imágenes (estimado *****) 2 min 2 minutos 3-4 min 3-4 min 20-25 minutos 13 min / escaneo Tabla 1: Parámetros de adquisición para cada secuencia utilizada durante el protocolo CMR. * Las exploraciones se realizan en tres orientaciones ortogonales diferentes (axial, coronal, sagital). **Se utiliza el TE más corto posible, dados todos los demás parámetros, que depende de la configuración específica del escáner. Este es el número de fotogramas cardíacos después del binning retrospectivo. El promedio efectivo depende del llenado aleatorio del espacio k durante el tiempo total de adquisición. En total, se realizaron 400 repeticiones de todas las k-líneas. Incluyendo ECG/retrasos en el desencadenamiento respiratorio. Abreviaturas: CMR = resonancia magnética cardiovascular; ECG = electrocardiograma; GRE = eco de gradiente; FOV = campo de visión; TE = tiempo de eco; TR = tiempo de repetición; Nframes = número de cuadros cardíacos; SA = eje corto; CH = cámara. Haga clic aquí para descargar esta tabla. 4. Finalización del experimento y almacenamiento de datos Retire el ratón de la base después de separar todos los demás equipos de medición y apague la anestesia. En el caso de experimentos longitudinales, coloque al ratón en una jaula de alojamiento precalentada a 37 ° C para su recuperación hasta que el animal esté despierto y activo. Limpie todo el equipo que se haya utilizado con toallitas de limpieza o alcohol al 70%. Genere archivos de imágenes digitales y comunicación en medicina (DICOM) para los datos de resonancia magnética con puertas prospectivas, y cópielos junto con los archivos de datos sin procesar de resonancia magnética de las exploraciones cerradas retrospectivamente a un servidor seguro para el análisis de datos posterior. 5. Reconstrucción fuera de línea de los escaneos adquiridos retrospectivamente NOTA: Para la reconstrucción de los escaneos cerrados retrospectivamente, se utilizó un software de código abierto personalizado (Figura 3). Realice los pasos siguientes para cada uno de los datos activados retrospectivamente por separado. Abra el software de reconstrucción Retrospectivey cargue el archivo de datos sin procesar correspondiente a una resonancia magnética cerrada retrospectivamente. Inspeccione la señal del navegador Raw y observe que los picos de señal más altos representan la frecuencia respiratoria y los picos de señal más bajos representan la frecuencia cardíaca. Si los picos están registrados al revés, gire la señal con el interruptor hacia arriba / hacia abajo. Además, compruebe si la frecuencia cardíaca detectada automáticamente corresponde al 10% de los valores observados durante cada exploración. De lo contrario, ajuste manualmente estos valores porque la detección automatizada falló. Elija un porcentaje de ventana apropiado para la exclusión de datos durante el movimiento respiratorio, generalmente del 30%. Pulse Filtro para realizar el análisis del navegador y separe el navegador cardíaco del navegador respiratorio. Establezca el número de fotogramas CINE en 32 (valor utilizado en este estudio) y pulse sort k-space. Elija la configuración adecuada para la regularización de detección comprimida (CS) y pulse reconstruir. Utilice los siguientes parámetros de regularización típicos: parámetro de regularización de wavelet en las dimensiones espaciales (x, y z) (WVxyz) 0.001 o 0; restricción de variación total en la dimensión CINE (TVcine) 0,1; restricción de variación total en dimensión espacial (TVxyz) 0; y restricción de variación total en la dimensión dinámica (TVdyn) 0,05. Una vez finalizada la reconstrucción, obtenga una vista previa de la película CINE para evaluar la reconstrucción. Exporte imágenes DICOM para su posterior análisis con Export DCM. Figura 3:Interfaz gráfica de usuario activativa «retrospectiva». ‘Retrospectiva’ es una aplicación de reconstrucción personalizada para exploraciones de resonancia magnética cardíaca activadas retrospectivamente. En la interfaz de usuario, es posible evaluar la señal del navegador, ajustar el número de fotogramas CINE a reconstruir, ajustar los parámetros de detección comprimidos para mejorar la reconstrucción, obtener una vista previa de las imágenes CINE como una película dinámica y exportar los datos reconstruidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 6. Software de análisis de imágenes NOTA: El software de análisis de imágenes(Figura 4)requiere el uso de imágenes DICOM y tiene múltiples complementos para diferentes aplicaciones de análisis cardiovascular, como el complemento para mediciones volumétricas y el complemento para análisis de tensión y HDF. Para la evaluación volumétrica del VI, seleccione el escaneo SA multicorte y cárguelo en el complemento para mediciones volumétricas. Asigne etiquetas de sistólica final (ES) y diastólica final (DE) al cuadro cardíaco correspondiente. Utilice las herramientas de contorno para segmentar los bordes endomiocárdicos en los marcos ES y ED.NOTA: El software de análisis, utilizado para este protocolo, muestra automáticamente los parámetros LV EF, EDV, ESV cuando se han realizado todas las anotaciones necesarias. Para mediciones diastólicas, seleccione las imágenes SA CINE del ventrículo medio y cárguelas en el complemento para mediciones volumétricas. Asigne las etiquetas ED y ES a los cuadros cardíacos correspondientes. Utilice las herramientas de contorno para segmentar el borde endocárdico de todos los fotogramas. Compare la segmentación de los marcos vecinos para garantizar transiciones suaves de la segmentación a lo largo del ciclo cardíaco. Exportar la evolución temporal de todas las tramas cardíacas y los correspondientes volúmenes endomiocárdicos del VI (ENDO del VI). Aplique un script personalizado (consulte Material complementario)para calcular la relación E’/A’.NOTA: El script aplica un filtro Savitzky-Golay para el cálculo robusto de las curvas dV/dt y utiliza la detección semiautomática de picos para encontrar los picos E’ y A’. Para los cálculos de deformación y HDF, seleccione las imágenes CINE de eje largo de 2CH, 3CH y 4CH, y cárguelas en el complemento para mediciones volumétricas. Asigne las etiquetas ED y ES al marco cardíaco correspondiente en cada orientación de corte. Utilice las herramientas de contorno para segmentar el borde endocárdico de todos los fotogramas en las 3 orientaciones. Compare la segmentación de los marcos vecinos para garantizar transiciones suaves de la segmentación a lo largo del ciclo cardíaco. Una vez que los contornos se dibujan en el complemento para mediciones volumétricas, ejecute el complemento para el análisis de tensión y HDF. Asigne cada uno de los conjuntos de datos adquiridos a las etiquetas correspondientes para las vistas 2CH, 3CH y 4CH, y ejecute el análisis de deformación. Para el análisis HDF, dibuje el diámetro de la válvula mitral en el marco diastólico final en las 3 orientaciones y dibuje el diámetro de la aorta en la imagen de eje largo de 3 cámaras. Figura 4: Interfaz gráfica de usuario del software de análisis de imágenes. El plugin para la medición volumétrica en el software de análisis de imágenes, que se utiliza para el contorno del borde endomiocárdico. Para cada conjunto de datos, se seleccionan las fases cardíacas diastólica final y sistólica final, y el borde endomiocárdico se segmenta para todos los fotogramas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.