Quantificação da função ventricular esquerda do coração do rato, tensão do miocárdio e forças hemodinâmicas por ressonância magnética cardiovascular

Os experimentos animais descritos são conduzidos de acordo com as diretrizes da União Europeia para o bem-estar dos animais de laboratório (Diretiva 2010/63/UE) e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Centro Médico Acadêmico. 1. Configuração e preparação animal Antes de iniciar o experimento, certifique-se de que há anestesia isoflurane suficiente por pelo menos 2 h, e que a bateria disponível para ECG e monitoramento respiratório esteja suficientemente carregada. Certifique-se de que a área do scanner está equipada com um tubo de extração de fumaça funcionando para remover o excesso de isoflurane. Prepare o berço do mouse(Figura 1A),e ligue o sistema de aquecimento animal com a temperatura definida para 40 °C. Prepare o módulo de interface respiratória ECG e a configuração da bateria(Figura 1B),e inicie o software para monitoramento em tempo real de ECG e sinais respiratórios(Figura 1C). Remova o mouse da gaiola de carcaça e meça o peso corporal. Coloque o rato em uma câmara de indução de anestesia sob um braço de extração de capô de fumaça, e forneça 3-4% de isoflurane em uma mistura de 0,2 L/min O2 e 0,2 L/min de ar médico. Depois que o animal estiver totalmente anestesiado, aplique uma pequena gota de pomada nos olhos em cada olho, e feche as pálpebras do rato. Coloque o mouse na posição supina no berço do mouse. Gancho os incisivos do mouse na barra de mordida no berço do mouse, e ajuste o cone do nariz para caber corretamente(Figura 1A). Verifique visualmente se a respiração está estável abaixo de 100 respirações/min, e reduza o isoflurane para ~2% durante a preparação animal. Mova o berço do mouse de tal forma que o coração esteja localizado na parte do suporte do berço que vai acabar no centro da bobina RF e iso-central do ímã. Use geleia de petróleo para inserir a sonda de temperatura retal e tape o cabo de fibra óptica da sonda de temperatura no berço do mouse. Coloque o balão respiratório no abdômen inferior do mouse e fixe-o com fita adesiva. Insira duas agulhas de eletrodo ECG subcutâneamente no tórax na altura das prevedas e grave-as suavemente para evitar o movimento(Figura 1A). Verifique se os sinais de respiração e ECG são de qualidade suficiente e se os pontos de gatilho corretos são detectados pelo software (Figura 1C). Certifique-se de que a taxa respiratória é de 50-80 respirações/min, frequência cardíaca ~400-600 batidas/min, e temperatura corporal em torno de 37 °C. Ajuste a administração isoflurane quando a taxa respiratória estiver fora dessa faixa, e reduza a temperatura do sistema de aquecimento animal se a temperatura corporal tende a exceder 37 °C. Coloque a bobina RF sobre o mouse.NOTA: Dependendo do sistema, isso pode exigir uma desconexão temporária dos eletrodos ECG e dos plugues de balão respiratório do módulo ECG/interface respiratória. Conecte os cabos da bobina e coloque o berço no furo do ímã. Verifique se o sinal de ECG ainda está estável. Se o sinal ECG for subótimo, reposicione os eletrodos ECG para um sinal melhor, pois isso não pode ser feito em um estágio posterior sem alterar significativamente a orientação do animal. Figura 1: Preparação animal e configuração do equipamento para imagem cmr do coração do rato. (A) Camundongo totalmente anestesiado na posição supina, colocado no berço do rato aquecido com um travesseiro pneumático respiratório colocado no abdômen, sensor de temperatura de fibra óptica retal e eCG subcutâneo no peito perto das preevoadas. (B) Bobina do corpo do rato colocada sobre o berço do mouse, com cabos de ECG e travesseiro respiratório reconectado ao ECG e interface respiratória antes de colocar o suporte no ímã de ressonância magnética. (C) Representação do ECG e sinais respiratórios em software dedicado de monitoramento animal de pequeno porte. O pico R do sinal ECG é detectado e usado como ponto de partida para aquisição de sinal de ressonância magnética. Um período de em branco entre os picos R pode ser ajustado manualmente com base no período de um batimento cardíaco. O acionamento só pode ocorrer durante o platô respiratório (linha verde no painel do meio) para o qual o atraso inicial e a largura máxima podem ser ajustados manualmente. Abreviaturas: CMR = ressonância magnética cardiovascular; ECG = eletrocardiograma; Ressonância Magnética = ressonância magnética. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 2. Calibração e acionamento da ressonância magnética Ajuste os parâmetros de ECG e gating respiratório dentro do software de monitoramento de sinais, de modo que os pontos de gatilho sejam gerados nos picos R e somente durante a porção plana do sinal respiratório. Para minimizar os erros de gating do ECG, defina um período de em branco 10-15 ms mais curto que o intervalo R-R.NOTA: Este período de em branco deve ser ajustado durante todo o experimento se ocorrerem alterações na frequência cardíaca. Realize uma calibração de frequência central e uma varredura SCOUT padrão (untada) com zero deslocamento para determinar a posição do mouse no scanner nas direções coronal, axial e sagital. Se o coração não estiver posicionado dentro de 0,5-1 cm do centro de campo de visão (FOV), ajuste a posição do berço em conformidade e refaça a varredura SCOUT. Execute uma calibração manual de shim e RF usando os métodos de fornecedor disponíveis. 3. Escaneie planejamento e aquisição NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter parâmetros de varredura detalhados das seguintes varreduras. Com base no SCOUT inicial, realize uma varredura de reconhecimento de gradiente de um quadro único (GRE)(Tabela 1, scan 1) com 5 fatias em 3 direções ortogonais, e posicione cada pilha de fatias na localização aproximada do coração para localizar a posição exata do coração(Figura 2A). Realize uma varredura de varredura SA de um único quadro(Tabela 1, scan 2). Para isso, use o batedor GRE anterior para posicionar 4-5 fatias em uma posição ventricular de meio-esquerdo, perpendicular ao eixo longo do coração para encontrar uma estimativa inicial da visão SA midventricular, que é necessária para planejar o escotismo de 2 câmaras de longo eixo(Figura 2B). Para as seguintes varreduras prospectivas (etapas 3.4-3.6), ajuste o número de quadros cardíacos (Nframes) de modo que Nframes × TR seja ~60-70% do intervalo R-R.NOTA: A aquisição para 60-70% do intervalo R-R é suficiente para capturar a fase diatólica final do ciclo cardíaco, permitindo o relaxamento adicional do T1 durante a diastola final para melhorar o SNR e prevenir a perturbação do seguinte pico R por comutação gradiente. Realize uma varredura GRE de fatia única fechada para gerar o batedor de 2 câmaras (2CH) de eixo longo, combinado com a varredura SA, é necessário para planejar a 4 câmara (4CH) (Tabela 1,scan 3). Para este fim, posicione uma fatia perpendicular às visões SA anteriores que correm paralelamente aos pontos de conexão entre o ventrículo esquerdo e direito. Mova esta fatia para o meio do ventrículo esquerdo, e verifique a imagem coronal do batedor GRE se a fatia estiver alinhada com o eixo longo lv de tal forma que ela seja colocada através do ápice(Figura 2C). Realize outra varredura GRE de fatia única fechada para gerar a varredura de 4 câmaras (4CH), necessária para planejar a SA de várias fatias e a varredura de 3 câmaras(Tabela 1, scan 4). Para este fim, posicione uma fatia perpendicular à varredura de scout 2CH e alinhe-se ao centro do eixo longo de tal forma que a fatia passe pela válvula mitral e pelo ápice. Nas vistas SA, ajuste a fatia de modo que ela seja colocada paralelamente à parede ventricular posterior e anterior e entre os dois músculos papilares(Figura 2D). Verifique se a fatia permanece no centro do ventrículo durante todo o ciclo cardíaco. Realize uma varredura SA GRE sequencial de várias fatias(Tabela 1, digitalização 5) para medições de função sistólica. Para isso, posicione uma fatia midventricular perpendicular ao eixo longo lv nas vistas 2CH e 4CH no centro do coração, e aumente o número de fatias (tipicamente um número ímpar, por exemplo, 7 ou 9 fatias, sem lacuna entre as fatias) para cobrir o coração da base ao ápice(Figura 2E). Para os seguintes escaneamentos retrospectivamente fechados (etapas 3.8-3.9), desligue toda a funcionalidade prospectiva de gating cardíaco e respiratório. Anote a taxa cardíaca e respiratória antes e depois de cada varredura retrospectivamente fechada, e use esses valores para fins de reconstrução posteriormente (etapa 5.2.2). Realize três varreduras GRE fechadas retrospectivamente sequenciais na visão SA midventricular (para quantificação da razão E’/A’), 2CH e 4CH, as duas últimas necessárias para a quantificação da cepa miocárdica e dos valores HDF(Tabela 1, digitalização 6-8). Se necessário, otimize as orientações finais de fatias 2CH e 4CH com base nas visualizações SA multi-fatias, bem como nas varreduras de scout 2CH e 4CH disponíveis. Realizar uma varredura GRE de fatia única adjacente em uma visão de 3 câmaras (3CH), que combinada com a visão 2CH e 4CH da etapa 3.8 é necessária para a quantificação da cepa miocárdica e dos valores HDF(Tabela 1, scan 9). Para este fim, posicione uma fatia perpendicular à visão SA midventricular semelhante à posição da visão final de eixo longo 4CH, e gire a fatia em 45° para passar da parede anterior para o músculo papilar mais próximo da parede posterior. Inspecione a fatia SA basal para ver se a fatia passa pela válvula mitral e aórtica. Inspecione na visão final de 4CH do eixo longo se a fatia estiver passando pelo ápice(Figura 2F). Figura 2: Planejamento de fatias para imagens CMR em um mouse. (A) GRE SCOUT planejando através do coração em 3 vistas ortogonais usando o scout scan inicial. (B) O scout de eixo curto planeja as fatias coronal e sagital GRE SCOUT. (C) Planejamento da visão de batedor 2CH utilizando o batedor de eixo curto e a fatia coronal GRE SCOUT. (D) Planejamento da visão de batedor 4CH usando o batedor de eixo curto e o batedor 2CH. (E) Planejamento da visão de eixo curto de várias fatias usando batedores 2CH e 4CH. (F) (esquerda) Planejamento das vistas finais de 2CH, 3CH e 4CH utilizando as vistas de curto eixo midventricular e 2CH/4CH. Abreviaturas: CMR = ressonância magnética cardiovascular; GRE = Gradiente Eco; CH = câmara. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Número de varredura(s) 1 2 3 4 5 6-9 Escaneie os nomes(s) Batedor gre multi-fatia SA scout Batedor de 2CH Batedor 4CH SA multi-fatias SA, 2CH, 4CH, 3CH fatias totais 15 (3 x 5)* 4-5 1 1 7-9 1 Espessura (mm) 1 1 1 1 1 1 FOV (mm) 60 35 30 30 35 30 Relação FOV 1 1 1 1 1 1 Ângulo de lançamento 40 20 20 20 20 15 TE (ms)** 3.8 3.4 2.5 2.5 2.5 3.6 TR (ms) 200 1 R-R 7 7 7 8 Nframes 1 1 12-14 12-14 12-14 32 *** Tamanho da matriz 192 x 192 192 x 192 192 x 192 192 x 192 192 x 192 192 x 192 Ativação do ECG Não Sim Sim Sim Sim retrospectiva Desencadeamento respiratório Sim Sim Sim Sim Sim retrospectiva Médias 1 3 5 5 5 retrospectiva **** Tempo total de imagem (estimado *****) 2 min. 2min 3-4 min 3-4 min 20-25 min 13 min / scan Tabela 1: Parâmetros de aquisição para cada sequência utilizada durante o protocolo CMR. * Os exames são realizados em três orientações ortogonais diferentes (axial, coronal, sagital). **O te mais curto possível, dado todos os outros parâmetros são utilizados, o que depende da configuração específica do scanner. Este é o número de quadros cardíacos após binning retrospectivo. A média efetiva depende do preenchimento aleatório do espaço K durante o tempo total de aquisição. No total, foram realizadas 400 repetições de todas as linhas K. Incluindo atrasos no ECG/gatilho respiratório. Abreviaturas: CMR = ressonância magnética cardiovascular; ECG = eletrocardiograma; GRE = eco gradiente; FOV = campo de visão; TE = tempo de eco; TR = tempo de repetição; Nframes = número de quadros cardíacos; SA = eixo curto; CH = câmara. Clique aqui para baixar esta Tabela. 4. Finalização do experimento e armazenamento de dados Remova o mouse do berço depois de desprender todos os outros equipamentos de medição e desligue a anestesia. No caso de experimentos longitudinais, coloque o rato em uma gaiola de habitação pré-aquecida a 37 °C para recuperação até que o animal esteja acordado e ativo. Limpe todos os equipamentos que foram usados com lenços de limpeza ou 70% de álcool. Gerar arquivos DICOM (Digital Imaging and Communication in Medicine) para os dados de ressonância magnética prospectivamente fechados e copiá-los juntamente com os arquivos de dados brutos da ressonância magnética das varreduras retrospectivamente fechadas para um servidor seguro para análise subsequente de dados. 5. Reconstrução offline dos exames adquiridos retrospectivamente NOTA: Para a reconstrução das varreduras retrospectivamente fechadas, foi utilizado um software de código aberto personalizado(Figura 3). Execute as seguintes etapas para cada um dos dados acionados retrospectivamente separadamente. Abra o software de reconstrução Retrospectivae carregue o arquivo de dados bruto correspondente a uma ressonância magnética fechada retrospectivamente. Inspecione o sinal do navegador Raw e note que os picos de sinal mais altos representam a frequência respiratória e os picos de sinal mais baixos representam a frequência cardíaca. Se os picos forem registrados de cabeça para baixo, gire o sinal com o interruptor para cima/para baixo. Além disso, verifique se a frequência cardíaca detectada automaticamente corresponde a 10% dos valores observados durante cada varredura. Caso não, ajuste manualmente esses valores porque a detecção automatizada falhou. Escolha uma porcentagem de janela adequada para exclusão de dados durante o movimento respiratório, geralmente 30%. Pressione o filtro para realizar a análise do navegador e separe o navegador cardíaco do navegador respiratório. Defina o número de quadros CINE para 32 (valor utilizado neste estudo) e pressione tipo k-space. Escolha as configurações apropriadas para regularização de sensoriamento comprimido (CS) e reconstrua a prensa. Utilize os seguintes parâmetros típicos de regularização: parâmetro de regularização de ondas nas dimensões espacial (x, y e z) (WVxyz) 0,001 ou 0; restrição de variação total na dimensão CINE (TVcine) 0.1; restrição de variação total na dimensão espacial (TVxyz) 0; e restrição de variação total na dimensão dinâmica (TVdyn) 0,05. Uma vez concluída a reconstrução, pré-visualizar o filme CINE para avaliar a reconstrução. Exportar imagens DICOM para análise posterior com o EXPORT DCM. Figura 3: ‘Retrospectiva’ desencadeando interface gráfica do usuário. ‘Retrospectiva’ é uma aplicação de reconstrução personalizada para exames de ressonância magnética cardíaca acionados retrospectivamente. Na interface do usuário, é possível avaliar o sinal do navegador, ajustar o número de quadros CINE a serem reconstruídos, ajustar os parâmetros de sensoriamento comprimido para melhorar a reconstrução, visualizar as imagens CINE como um filme dinâmico e exportar os dados reconstruídos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 6. Software de análise de imagens NOTA: O software de análise de imagem (Figura 4) requer o uso de imagens DICOM e possui múltiplos plugins para diferentes aplicações de análise cardiovascular, como o plugin para medições volumétricas e o plugin para análise de cepa e HDF. Para avaliação volumétrica da LV, selecione a varredura SA de várias fatias e carregue-a no plugin para medições volumétricas. Atribua etiquetas sistólicas finais (ES) e diastólicas finais (ED) ao quadro cardíaco correspondente. Use as ferramentas de contorno para segmentar as bordas do endomyocárdico nos quadros ES e ED.NOTA: O software de análise, utilizado para este protocolo, exibe automaticamente os parâmetros LV EF, EDV, ESV quando todas as anotações necessárias foram feitas. Para medições diastólicas, selecione as imagens SA CINE midventricular e carregue-as no plugin para medições volumétricas. Atribua as etiquetas ED e ES aos quadros cardíacos correspondentes. Use as ferramentas de contorno para segmentar a borda do endocárdio para todos os quadros. Compare a segmentação dos quadros vizinhos para garantir transições suaves da segmentação ao longo do ciclo cardíaco. Exporte a evolução do tempo de todos os quadros cardíacos e os volumes correspondentes do endomicardial LV (LV ENDO). Aplique um script personalizado (ver Material Suplementar) para calcular a razão E’/A’.NOTA: O script aplica um filtro Savitzky-Golay para cálculo robusto das curvas dV/dt e usa detecção de pico semiautomática para encontrar os picos E’ e A’. Para cálculos de cepa e HDF, selecione as imagens CINE de eixo longo de 2CH, 3CH e 4CH e carregue-as no plugin para medições volumétricas. Atribua as etiquetas ED e ES ao quadro cardíaco correspondente em cada orientação de fatia. Use as ferramentas de contorno para segmentar a borda do endocárdio para todos os quadros em todas as 3 orientações. Compare a segmentação dos quadros vizinhos para garantir transições suaves da segmentação ao longo do ciclo cardíaco. Uma vez que os contornos são desenhados no plugin para medições volumétricas, execute o plugin para a tensão e análise HDF. Atribua cada um dos conjuntos de dados adquiridos aos rótulos correspondentes para visualizações de 2CH, 3CH e 4CH e execute a análise de tensão. Para análise hdf, desenhe o diâmetro da válvula mitral no quadro estatólico final em todas as 3 orientações e desenhe o diâmetro da aorta na imagem de eixo longo de 3 câmaras. Figura 4: Interface gráfica do usuário do software de análise de imagem. O plugin para medição volumétrica no software de análise de imagem, que é usado para contorno da borda do endomyocárdio. Para cada conjunto de dados, são selecionadas as fases cardíacas diatólicas e finais são selecionadas, e a borda do endomyocárdio é segmentada para todos os quadros. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.