Özet

Chirurgie und Probenverarbeitung zur korrelativen Bildgebung der murinen Pulmonalklappe

Published: August 05, 2021
doi:

Özet

Hier beschreiben wir einen korrelativen Workflow für die Exzision, Druckbeaufschlagung, Fixierung und Bildgebung der murinen Pulmonalklappe, um die grobe Konformation und lokale extrazelluläre Matrixstrukturen zu bestimmen.

Abstract

Die zugrunde liegenden Ursachen der Herzklappenerkrankung (HVD) sind schwer fassbar. Murine Tiermodelle bieten ein hervorragendes Werkzeug für die Untersuchung von HVD, aber das chirurgische und instrumentelle Fachwissen, das erforderlich ist, um die Struktur und Organisation über mehrere Längenskalen hinweg genau zu quantifizieren, hat seinen Fortschritt behindert. Diese Arbeit bietet eine detaillierte Beschreibung der murinen Dissektion, der En-bloc-Färbung, der Probenverarbeitung und der korrelativen Bildgebungsverfahren zur Darstellung der Herzklappe auf verschiedenen Längenskalen. Hydrostatischer Transvalvulardruck wurde verwendet, um die zeitliche Heterogenität durch chemische Fixierung der Herzklappenkonformation zu kontrollieren. Die Mikro-Computertomographie (μCT) wurde verwendet, um die Geometrie der Herzklappe zu bestätigen und eine Referenz für die nachgelagerte Probenverarbeitung zu liefern, die für die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-REM) erforderlich ist. Hochauflösende serielle REM-Bilder der extrazellulären Matrix (ECM) wurden aufgenommen und rekonstruiert, um eine lokale 3D-Darstellung ihrer Organisation zu erhalten. μCT- und SBF-SEM-Bildgebungsverfahren wurden dann korreliert, um die räumliche Variation über die Pulmonalklappe zu überwinden. Obwohl sich die vorgestellte Arbeit ausschließlich auf die Pulmonalklappe betrifft, könnte diese Methodik zur Beschreibung der hierarchischen Organisation in biologischen Systemen übernommen werden und ist entscheidend für die strukturelle Charakterisierung über mehrere Längenskalen hinweg.

Introduction

Die Pulmonalklappe (PV) dient dazu, eine unidirektionale Durchblutung zwischen dem rechten Ventrikel und der Lungenarterie sicherzustellen. Lungenklappenfehlbildungen sind mit verschiedenen Formen angeborener Herzerkrankungen verbunden. Die aktuelle Behandlung für angeborene Herzklappenerkrankungen (HVD) ist die Klappenreparatur oder der Klappenersatz, was mehrere invasive Operationen während des gesamten Lebens eines Patienten erfordern kann1. Es ist allgemein anerkannt, dass die Funktion der Herzklappe von ihrer Struktur abgeleitet wird, die oft als Struktur-Funktions-Korrelat bezeichnet wird. Genauer gesagt bestimmen die geometrischen und biomechanischen Eigenschaften des Herzens seine Funktion. Die mechanischen Eigenschaften wiederum werden durch die Zusammensetzung und Organisation des ECM bestimmt. Durch die Entwicklung einer Methode zur Bestimmung der biomechanischen Eigenschaften von murinen Herzklappen können transgene Tiermodelle verwendet werden, um die Rolle des ECM auf die Herzklappenfunktion und Dysfunktionabzufragen 2,3,4,5.

Das mausige Tiermodell gilt seit langem als Standard für molekulare Studien, da transgene Modelle bei Mäusen im Vergleich zu anderen Arten leichter verfügbar sind. Murine transgene Modelle bieten eine vielseitige Plattform für die Erforschung herzklappenbedingter Erkrankungen6. Das chirurgische Know-how und die Instrumentierungsanforderungen, um sowohl die Geometrie als auch die ECM-Organisation zu charakterisieren, waren jedoch eine große Hürde für den Fortschritt der HVD-Forschung. Hstologische Daten in der Literatur liefern ein Bild in den gehalt an extrazellulären Matrixen der mausinen Herzklappe, jedoch nur in Form von 2D-Bildern, und können ihre 3D-Architektur nicht beschreiben7,8. Darüber hinaus ist die Herzklappe sowohl räumlich als auch zeitlich heterogen, was es schwierig macht, über Experimente hinweg Rückschlüsse auf die ECM-Organisation zu ziehen, wenn die Probenahme und Konformation nicht festgelegt sind. Herkömmliche 3D-Charakterisierungsmethoden wie MRT oder 3D-Echokardiographie bieten nicht die Auflösung, die erforderlich ist, um ECM-Komponenten9,10aufzulösen.

Diese Arbeit beschreibt einen vollständig korrelativen Arbeitsablauf, bei dem die zeitliche Heterogenität aufgrund des Herzzyklus durch Fixierung der Konformation der murinen PV mit hydrostatischem Transvalvulardruck angesprochen wurde. Die räumliche Heterogenität wurde präzise kontrolliert, indem Bereiche von Interesse abgesonden und Datensätze aus verschiedenen Bildgebungsmodalitäten, insbesondere μCT und serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie, über verschiedene Längenskalen registriert wurden. Diese Methode des Scoutings mit μCT zur Führung der nachgelagerten Probenahme wurde bereits vorgeschlagen, aber da die Pulmonalklappe zeitliche Variationen aufweist, war eine zusätzliche Kontrollebene auf der chirurgischen Ebene11erforderlich.

In-vivo-Studien, die die Biomechanik der murinen Herzklappe beschreiben, sind spärlich und stützen sich stattdessen bei der Beschreibung des Deformationsverhaltens auf Computermodelle. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass lokale extrazelluläre Daten auf der Nanometerlängenskala mit der Geometrie und Lage der Herzklappe in Verbindung stehen. Dies wiederum liefert quantifizierbare, räumlich abgebildete Verteilungen von mechanisch beitragenden ECM-Proteinen, mit denen bestehende biomechanische Herzklappenmodelle verstärkt werden können12,13,14.

Protocol

Die Verwendung von Tieren in dieser Studie erfolgte in Übereinstimmung mit dem institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss des Nationwide Children’s Hospital unter dem Protokoll AR13-00030. 1. Lungenklappenexzision Autoklavieren Sie die notwendigen Werkzeuge, die für die Mausdissektion benötigt werden. Dazu gehören feine Scheren, Mikrozangen, Mikrogefäßklemmen, Klemmzangen, Mikronieren, Mikronährenhalter, Federscheren und Retraktoren. Akklimatisieren Sie al…

Representative Results

Anastomose der Lungenarterie zum Druckschlauch ist in Abbildung 1Adargestellt. Nach der Anwendung von hydrostatischem Druck dehnung sich der Lungenstamm radial (Abbildung 1B), was darauf hinweist, dass sich die Lungenklappenblättchen in einer geschlossenen Konfiguration befinden. Die Pulmonalklappenkonformation wurde durch μCT bestätigt. In diesem Fall waren die Blättchen koapt (geschlossen) und der Ring war kreisförmig (Abbildung 2A</s…

Discussion

Die Entfernung der Ventrikel dient zwei Zwecken. Erstens, die Ventrikelseite dem atmosphärischen Druck auszusetzen, wodurch nur ein transvalvulärer Druck von der arteriellen Seite der Pulmonalklappe ausgeübt werden muss, um sich zu schließen, und zweitens, eine stabile Basis bereitzustellen, um eine Verdrehung des Lungenstamms zu verhindern. Während der Druckbeaufschlägeung dehnung sich der Lungenstamm radial und minderwertig, wodurch er anfällig für Verdrehungen wird, was zum Zusammenbruch des Lungenstamms führ…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird teilweise durch R01HL139796- und R01HL128847-Zuschüsse an CKB und RO1DE028297 und CBET1608058 für DWM unterstützt.

Materials

25% glutaraldehyde (aq) EMS 16210 Primary fixative component
0.9% sodium chloride injection Hospira Inc. NDC 0409-4888-10
1 mL syringe BD 309659
10 mL syringe BD 309604
200 proof ethanol EMS 15055
22G needle BD 305156
3 mL syringe BD 309657
3-way stopcock Smiths Medical ASD, Inc. MX5311L
4% osmium tetroxide EMS 19150 Staining component
4% paraformaldehyde (aq) EMS 157-4-100 Primary fixative component
Absorbable hemostat Ethicon 1961
Acetone EMS 10012
Black polyamide monofilament suture, 10-0 AROSurgical instruments Corporation TI38402
Black polyamide monofilament suture, 6-0 AROSurgical instruments Corporation SN-1956
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664 Approximately 1 yo
Calcium chloride Sigma-Aldrich 10043-52-4
Clamp applying forcep FST 00072-14
Cotton tip applicators Fisher Scientific 23-400-118
DPBS Gibco 14190-144
Dumont #5 forcep FST 11251-20
Dumont #5/45 forceps FST 11251-35
Dumont #7 fine forcep FST 11274-20
Durcupan ACM resin EMS 14040 For embedding
Fine scissor FST 14028-10
Heliscan microCT Thermo Fisher Scientific Micro-CT
Ketamine hydrochloride injection Hospira Inc. NDC 0409-2053
L-aspartic acid Sigma-Aldrich 56-84-8 Staining component
Lead nitrate EMS 17900 Staining component
low-vacuum backscatter detector Thermo Fisher Scientific VSDBS SEM backscatter detector
Micro-adson forcep FST 11018-12
Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile EMD Millipore SLGP033NS
Non-woven songes McKesson Corp. 94442000
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate Sigma-Aldrich 14459-95-1 Staining component
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 1310-58-3
Pressure monitor line Smiths Medical ASD, Inc. MX562
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) Hospira Inc. NDC 0409-0138-22
Size 3 BEEM capsule EMS 69910-01 Embedding container
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich 6131-99-3 Buffer
Solibri retractors FST 17000-04
Sputter, carbon and e-beam coater Leica EM ACE600 Gold coater
Surgical microscope Leica M80
Thiocarbohydrazide (TCH) EMS 21900 Staining component
Tish needle holder/forcep Micrins MI1540
Trimmer Wahl 9854-500
Uranyl acetate EMS 22400 Staining component
Volumescope scanning electron microscope Thermo Fisher Scientific VOLUMESCOPESEM Serial Block Face Scanning Electron Microscope
Xylazine sterile solution Akorn Inc. NADA# 139-236

Referanslar

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