Özet

Valutazione delle risposte immunitarie respiratorie all'Haemophilus influenzae

Published: June 29, 2021
doi:

Özet

Haemophilus influenzae induce infiammazione delle vie respiratorie. Questo articolo si concentrerà sull’uso della citometria a flusso e della microscopia confocale per definire le risposte immunitarie dei fagociti e dei linfociti in risposta a questo batterio.

Abstract

Haemophilus influenzae (Hi) è un batterio prevalente trovato in una serie di condizioni respiratorie. Una varietà di diversi saggi / tecniche possono essere utilizzati per valutare la risposta immunitaria / infiammatoria respiratoria a questo batterio. La citometria a flusso e la microscopia confocale sono tecnologie basate sulla fluorescenza che consentono la caratterizzazione dettagliata delle risposte biologiche. Possono essere utilizzate diverse forme di antigene Hi, inclusi componenti della parete cellulare, preparati uccisi / inattivati e batteri vivi. Hi è un batterio fastidioso che richiede mezzi arricchiti, ma è generalmente facile da coltivare in ambienti di laboratorio standard. I campioni di tessuto per la stimolazione con Hi possono essere ottenuti da sangue periferico, broncoscopia o polmone resecato, ad esempio, in pazienti sottoposti a intervento chirurgico per il trattamento del cancro del polmone). La funzione dei macrofagi e dei neutrofili può essere valutata in modo completo utilizzando la citometria a flusso con una varietà di parametri misurati, tra cui la fagocitosi, le specie reattive dell’ossigeno e la produzione di citochine intracellulari. La funzione dei linfociti (ad esempio, la funzione delle cellule T e delle cellule NK) può essere valutata specificamente utilizzando la citometria a flusso, principalmente per la produzione di citochine intracellulari. L’infezione da Hi è un potente induttore della produzione di trappole extracellulari, sia da parte dei neutrofili (NET) che dei macrofagi (MET). La microscopia confocale è probabilmente il modo più ottimale per valutare l’espressione di NET e MET, che può anche essere utilizzata per valutare l’attività della proteasi. L’immunità polmonare all’Haemophilus influenzae può essere valutata mediante citometria a flusso e microscopia confocale.

Introduction

Haemophilus influenzae (Hi) è un normale batterio commensale presente nella faringe della maggior parte degli adulti sani. Hi può avere una capsula polisaccaridica (tipi A-F, ad esempio, tipo B o HiB) o mancare di una capsula ed essere non tipizzabile (NTHi)1. La colonizzazione della mucosa con questo batterio inizia nella prima infanzia e c’è un turnover di diversi ceppi colonizzatori2. Questo batterio è anche in grado di invadere sia il tratto respiratorio superiore che inferiore; In questo contesto, può indurre l’attivazione della risposta immunitaria e l’infiammazione 3,4. Questa risposta infiammatoria può causare malattie cliniche e contribuire a una varietà di importanti condizioni respiratorie, tra cui sinusite, otite media, bronchite, fibrosi cistica, polmonite e broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). La maggior parte di queste condizioni sono dovute ai ceppi NTHi2. Questo articolo descriverà i metodi per valutare le risposte immunitarie respiratorie all’Hi utilizzando la citometria a flusso e la microscopia confocale.

I metodi descritti di seguito sono stati adattati da tecniche consolidate che sono state modificate per valutare la risposta infiammatoria all’Hi. La selezione di una forma antigenica appropriata di Hi è una parte fondamentale di questa valutazione. I preparati antigenici vanno dai componenti della parete cellulare ai batteri vivi. Per stabilire e standardizzare i saggi, l’uso di campioni di sangue periferico può essere molto utile inizialmente.

La citometria a flusso consente la misurazione di una varietà di parametri e saggi funzionali da un campione a livello cellulare. Questa tecnica ha il vantaggio che specifiche risposte cellulari (ad esempio, produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) o produzione di citochine intracellulari) possono essere valutate rispetto ad altri metodi più generali come il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) o ELISspot.

Le trappole extracellulari sono espresse dai neutrofili (NET)5,6,7 e da altre cellule come i macrofagi (MET)8. Sono sempre più riconosciuti come una risposta infiammatoria chiave, in particolare nell’infezione polmonare9. Possono essere valutati mediante microscopia a fluorescenza confocale. Questa tecnica consente l’identificazione definitiva dei NET/MET e distingue la loro espressione da altre forme di morte cellulare6.

Sia la citometria a flusso che la microscopia confocale sono saggi basati sulla fluorescenza. Il loro successo dipende da protocolli di filtraggio ottimali di campioni biologici. Questi metodi richiedono del tempo per essere appresi e richiedono un’adeguata esperienza di supervisione. Gli strumenti coinvolti sono anche costosi sia da acquistare che da gestire. L’impostazione ottimale per il loro utilizzo include le principali università e gli ospedali di riferimento terziari.

I metodi utilizzati in questo protocollo sono trasferibili per lo studio di altri organismi simili coinvolti nelle malattie respiratorie (ad esempio, Moxarella catarrhalis e Streptococcus pneumoniae). NTHi interagisce anche con altri comuni batteri respiratori10.

Protocol

Questo lavoro è stato approvato dal comitato etico di ricerca umana di Monash Health. Il protocollo segue le linee guida del comitato etico per la ricerca umana. 1. Preparazione antigenica NOTA: Tre diversi preparati antigenici possono essere utilizzati per valutare la risposta immunitaria a Hi. Questi sono 1) un componente subcellulare (tipicamente dalla parete cellulare batterica); 2) batteri uccisi e inattivati; e 3) batteri vivi. Determinare l’uso di ciascuna pre…

Representative Results

I risultati rappresentativi mostrano come le risposte immunitarie infiammatorie a NTHi possano essere valutate/quantificate mediante citometria a flusso e microscopia confocale. Una parte fondamentale dell’interpretazione dei risultati è il confronto in fluorescenza tra campioni di controllo e stimolati. Di solito sono necessari numerosi esperimenti preliminari per ottimizzare la colorazione dei campioni. Quanti colori diversi possono essere esaminati contemporaneamente dipenderà dal numero di canali disponibili sul ci…

Discussion

I metodi elencati qui utilizzano tecniche di citometria a flusso basate sulla fluorescenza e microscopia confocale che possono essere utilizzate in combinazione per ottenere informazioni dettagliate sulla risposta polmonare infiammatoria all’Hi.

Stabilire la formulazione antigenica appropriata di Hi da utilizzare è fondamentale ed è consigliabile avere un input specifico da un microbiologo a questo proposito. Live Hi induce una risposta più forte, mentre i preparati Hi uccisi e i componenti…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare lo staff di Immunologia Clinica presso Monash Health per la loro assistenza in questo lavoro.

Materials

Ammonium chloride Sigma Aldrich 213330
Brefeldin Sigma Aldrich B6542
CD28 Thermofisher 16-0289-81
CD49d Thermofisher 534048
DAPI prolong gold Thermofisher P36931
DHR123 Sigma Aldrich 109244-58-8
Filcon sterile nylon mesh Becton Dickinson 340606
Gelatin substrate, Enzchek Molecular probes E12055
MACS mix tube rotater Miltenyi Biotec 130-090-753
Medimachine Becton Dickinson Catalogue number not available
Medicons 50 µm Becton Dickinson 340592
Pansorbin Sigma Aldrich 507858
Propidium iodide Sigma Aldrich P4170
Saponin Sigma Aldrich 8047152
Superfrost slides Thermofisher 11562203

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
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