Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Ashley Hutchinson; Almagul Seitova

doi:10.3791/62510

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biyokimya

ייצור חלבוני PRMT רקומביננטיים באמצעות מערכת וקטור הביטוי של Baculovirus

Published: July 17, 2021

doi:

10.3791/62510

Ashley Hutchinson¹, Almagul Seitova¹

¹Structural Genomics Consortium,University of Toronto

Özet

מערכת וקטור הביטוי של baculovirus (BEVS) היא פלטפורמה איתנה להקרנת ביטוי וייצור של חלבון ארגינין מתילטרנספראזים (PRMTs) שישמשו למחקרים ביוכימיים, ביופיזיים ומבניים. כמויות מיליגרם של חומר יכול להיות מיוצר עבור רוב PRMTs וחלבונים אחרים של עניין הדורש פלטפורמת ביטוי eukaryotic.

Abstract

חלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMTs) שאריות מתילאט ארגינין על מגוון רחב של חלבונים הממלאים תפקידים בתהליכים תאיים רבים. PRMTs יכולים או מונו או דימתילאט קבוצות ארגינין guanidino סימטרית או א-סימטרית. האנזימולוגיה של חלבונים אלה היא אזור מורכב ונחקר מאוד הדורש כמויות מיליגרם של חלבון רקומביננטי באיכות גבוהה. מערכת וקטור הביטוי baculovirus (BEVS) העסקת אוטוגרפיה californica נוקליאופוליהדרווירוס מרובים (AcMNPV) ו Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) תאים חרקים שימש עבור ביטוי הקרנה וייצור של PRMTs רבים, כולל PRMT 1, 2, ו 4 עד 9. כדי להקרין בו זמנית את הביטוי של מבנים מרובים של חלבונים אלה, כולל תחומים ושברים חתוכים, כמו גם חלבונים באורך מלא, יישמנו שיטות מדרגיות תוך שימוש פיפטות רב ערוצי מתכוונן לתכנות, בשילוב עם 24- ו 96-באר צלחות בלוקים. בסך הכל, התאמות שיטה אלה אפשרו יצירה בקנה מידה גדול של DNA bacmid, וירוסים רקומביננטיים, הקרנת ביטוי חלבון. שימוש בכלי תרבות עם נפח מילוי גבוה של השעיית תאי Sf9 עזר להתגבר על מגבלות שטח בצנרת הייצור לייצור חלבון בקנה מידה גדול אצווה אחת. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לביטוי יעיל וחסכוני של PRMTs פונקציונליים למחקרים ביוכימיים, ביופיזיים ומבניים.

Introduction

חלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMTs) שאריות מתילאט ארגינין בצורה מונומטיל או סימטרי / אסימטרי דימתיל. רצפי RG/RGG/GRG החוזרים ונשנים מועדפים מאוד על ידי רוב ה- PRMTs ונמצאים במגוון רחב של חלבונים¹^,². ארגינין חלבונים מתילציה כגון היסטון או גורמי שעתוק וגורמי שחבור לווסת שעתוק, שחבור, מבנה כרומטין³^,⁴. ידע גובר של רגולציה מגוונת של מצע וניצול קופקטור, מחזור, קינטיקה של PRMTs, כמו גם הדור של מעכבים סלקטיביים, שפכו אור מכני על אנזימים אלה ואת המורכבים שלהם⁵^,⁶. עם זאת, לא כל בני משפחת PRMT נחקרים באותה מידה; לדוגמה, PRMT9 התגלה רק לאחרונה כחבר במשפחת PRMT¹. מחקרי מבנה ותפקוד אנזים עבור חלבונים אלה דורשים מספיק, לעתים קרובות מיליגרם, כמויות של חלבון רקומביננטי כדי להיות זמין.

מערכת הביטוי פרוקריוטית Escherichia coli (E. coli) היא בדרך כלל הבחירה הראשונה להקרנת ביטוי תוך שימוש במספר מבנים עבור חלבון נתון⁷^,⁸^,⁹. עם זאת, ביטוי מבוסס E. coliלא תמיד לגרום בכמויות מספיקות של חלבוני PRMT בצורות הפעילות שלהם, כפי שציינו במיוחד עבור PRMT5 ו PRMT7 (ראה להלן). לפיכך, PRMTs שלא הצליחו לבטא ב- E. coli או היה צורך להיות מיוצר על ידי מכונות ביטוי eukaryotic היו subcloned לתוך וקטורים המתאימים הקרנת הביטוי במערכת וקטור ביטוי baculovirus חלופי (BEVS). בעוד E. coli הביע דגימות של PRMT1, PRMT3 ו PRMT8 נוצלו בהרחבה עבור במבחנה assays ו קריסטלוגרפיה, PRMTs אחרים כגון PRMT5, אשר דורש MEP50 שותף מחייב של תחום מתיל טרנספראז כפול שלה, ו PRMTs כגון PRMT7 ו 9, מחייב ביטוי תא חרקים כדי להשיג כמות מספקת של חלבון פעיל. בסך הכל, מבחני המתיל-טרנספראז הסטנדרטיים בעלי התפוקה הבינונית עבור PRMT4, 5, 6, 7 ו-9 ניצלו את ה- BEVS בתאי חרקים⁶. מערכת וקטור הביטוי baculovirus (BEVS) היא פלטפורמה רב-תכליתית לייצור חלבונים רקומביננטיים הדורשים את מכונות הביטוי האירו-קריוטי המאפשרות שינויים פוסט-תרגומיים החיוניים למחקרים ביוכימיים, ביופיזיים ומבניים¹⁰^,¹¹^,¹². מספר BEVSs הפכו זמינים מסחרית מאז השימוש המדווח הראשון של baculoviruses בשנת 1983 עבור ביטוי חלבון¹³. רוב הפרוטוקולים הללו משתמשים באסטרטגיות שונות להעברת הביטוי פלסמיד לתאי חרקים. אלה כוללים Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD בהיר, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, וכו ‘. הפרוטוקול שלנו מבוסס על המערכת הנפוצה ביותר ב- BEVS, מערכת Bac-to-Bac¹⁴, אשר נועד להעביר את הגן / cDNA קידוד החלבון של עניין (POI, כאן PRMTs) לתוך הגנום baculovirus נשמר בזן מיוחד של E. coli באמצעות טרנספוזיציה ספציפית לאתר¹⁵.

בקצרה, וקטור העברת פלסמיד המכיל את הגן של עניין הפך DH10Bac E. coli תאים מוסמכים כדי ליצור DNA bacmid ויראלי רקומביננטי. תאי Sf9 חסידים היו אז מודבקים עם DNA bacmid. ארבעה עד חמישה ימים לאחר transfection, baculoviruses רקומביננטי הראשונית מופרש לתוך המדיום תרבות התא נמצאו ו מתויגים כנגיף P1. מניות P1 baculovirus שימשו אז להגברת וירוסים (כלומר, דור של מניות P2 baculovirus) והקרנת ביטוי חלבון. בהתבסס על תוצאות סינון הביטוי, וירוסי P2 עבור מבנה הביטוי הטוב ביותר של החלבון זוהו ושימשו ליצירת תרביות השעיה של תאי חרקים נגועים בבולווירוס (SCBIIS) לייצור חלבונים בקנה מידה גדול. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים המפורטים שלנו ומתארים את הרציונל מאחורי הבחירות שלנו לריג’נט וכלי תרבות כדי לתמוך באסטרטגיה שלנו לפתח מתודולוגיה יעילה יותר, חסכונית ומדרגית יותר כדי להשיג כמויות מספיקות של חלבונים רקומביננטיים רצויים.

Protocol

הערה: הסקירה הכללית של שלבי פרוטוקול BEVS מתוארת באיור 1. 1. דור של DNA bacmid רקומביננטי הכנת צלחות סלקטיביות אגר LB עבור טרנספורמציה DH10Bac הכן לוחות אגר LB המכילים: 50 מיקרוגרם / מ”ל kanamycin, 7 מיקרוגרם / מ”ל גנטמיצין, 10 מיקרוגרם / מ”ל טטרציקלין, 200 מיקרוגרם / מ”ל Bluo-gal, ו 40 מיקרוגרם / מ”ל IPTG לבחור עבור DH10Bac transformants. שוקלים 25 גרם של מרק LB premixed ו 13 גרם של Bacto אגר ולשים לתוך בקבוק 2 L. להביא את הנפח ל 1 L עם מים מזוקקים אוטוקלאב במשך 15-30 דקות ב 121 מעלות צלזיוס. הגדר אמבט מים ב 50 מעלות צלזיוס ומצנן את פתרון אגר autoclaved באמבט המים במשך 40- 60 דקות עד שהוא מקורר עד 50 -55 מעלות צלזיוס. לתמיסה מקוררת, להוסיף gentamicin לריכוז הסופי של 7 מיקרוגרם / מ”ל, kanamycin לריכוז הסופי של 50 מיקרוגרם / מ”ל, טטרציקלין לריכוז הסופי של 10 מיקרוגרם / מ”ל, Bluo-gal לריכוז הסופי של 200 מיקרוגרם / מ”ל, ו IPTG לריכוז הסופי של 40 מיקרוגרם / מ”ל. מערבבים את הפתרון אגר aliquot 7-10 מ”ל של המדיום לכל צלחת 60 מ”מ באמצעות פיפטה 50 מ”ל. תן את הצלחות לשבת בטמפרטורת החדר (2 שעות) כדי להקשיח. הפוך, לעטוף ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. צלחות המכילות אנטיביוטיקה יציבות עד 4 שבועות. הפיכת הפלסמיד לתאים מוסמכים DH10Bac E. coli חשב את הנפח הנדרש של תאים מוסמכים. להפשיר תאים מוכשרים על קרח, בעדינות להסתובב ו resuspend בחזרה על ידי הקשה עדינה. השתמש פיפטה 12 ערוצים לוותר 4 μL של התאים לתוך כל באר של צלחת PCR 96-גם. הוסף ~ 0.3-0.5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד רקומביננטי לתאים המוסמכים ומערבבים בעדינות על ידי הקשה. דגירה את התערובת על קרח במשך 10-15 דקות. מחממים את התערובת במכונת PCR ב 42 °C (60 °F) עבור 45 s. מצננים על הקרח במשך 2 דקות. לוותר על 0.5 מ”ל של SOC בינוני לכל באר של בלוקים 96-באר (96-עמוק גם 2.4 מ”ל). השתמש פיפטה 12 ערוצים כדי להעביר את ההשעיה חיידקי הפך לתוך הבאר המתאימה של הבלוק לכסות אותו עם גיליון airpore. מניחים את הבלוק באינקובטור רועד ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה בינונית (205 סל”ד) עבור 4-5 שעות. באופן שווה להפיץ 30-50 μL של התרבות על פני השטח של צלחת אגר LB באמצעות חרוזי זכוכית סטריליים. אחסן את שאר התרבות ב 4 מעלות צלזיוס. דגירה הצלחות ב 37 °C (60 °F) עד צבע המושבות כחול / לבן ניתן להבחין (40-48 שעות). השלך את התרבות כאשר מספיק מושבות לבנות וגדולות מתקבלות על הצלחת. כדי להבטיח שמושבות לבנות יכילו רק דנ”א בכחמיד רקומביננטי, פס מחדש מושבה לבנה מבודדת אחת על לוחות אגר LB טריים המכילים אנטיביוטיקה, bluo-gal, ו IPTG כדי לאמת את הפנוטיפ. דגירה עבור 48 שעות ב 37 °C (69 °F). בחר מושבה לבנה מאומתת אחת מלוחית מפוספסת מחדש להפקת דנ”א בכחמיד רקומביננטי. בידוד דנ”א בכחמיד רקומביננטי לחסן מושבה לבנה אחת, מבודדת לתוך 3 מ”ל של מדיום LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ”ל kanamycin, 7 מיקרוגרם / מ”ל gentamicin, ו 10 מיקרוגרם / מ”ל טטרציקלין בלוקים 24-באר (24-באר בלוקים עגולים למטה) ולכסות עם גיליון airpore. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס לילה עם רועד ב 250 סל”ד. צנטריפוגה בלוקים 24-באר ב 2,100 x גרם במשך 10 דקות. מדקדקים את העל-טבעי, להפוך את הבלוק, ולהקיש בעדינות על נייר טישו סופג. הוסף 250 μL של פתרון 1 (פתרון לשימוש חוזר בתא) לכל באר. לאטום את הבלוקים עם רפידות קלטת או כל סרטי איטום אחרים ומניחים אותם על פלטפורמה רועדת ב 75 סל”ד במשך 5-10 דקות. בדוק היטב כל אחד כדי להבטיח תמוגה נכונה לתאים, ולהשתמש מחדש במידת הצורך, באמצעות קצה 1 מ”ל. הוסף 250 μL של פתרון 2 (פתרון תמוגה תא) לכל באר, לאטום את הבלוקים, ומניחים על פלטפורמה רועדת ב 75 סל”ד עבור 30 s (כדי למנוע זיהום צולב של הדגימות, לא להפוך בלוקים 24-באר) דגירה בטמפרטורת החדר במשך 4 דקות. הוסף 250 μL של פתרון 3 (פתרון נטרול), לאטום את הבלוקים, ומניחים על פלטפורמת רועד ב 75 סל”ד עבור 30 s. ייווצר משקע לבן עבה של חלבון ודנ”א גנומי E. coli. מניחים את הדגימה על הקרח במשך 10 – 15 דקות. צנטריפוגה במשך 60 דקות ב 2,100 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס כדי גלולה הדוקה חומר משקעים לבן. במהלך צנטריפוגה, תווית צינור microcentrifuge חדש ולהוסיף 0.8 מ”ל של isopropanol מוחלט. מעבירים בעדינות את ה-supernatant לצינור המכיל איסופרופנול, תוך הימנעות מחומר משקעים לבן. מערבבים בעדינות להפוך את הצינור כמה פעמים ולאחר מכן מניחים על קרח במשך 5 עד 10 דקות. בשלב זה, המדגם יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס לילה. צנטריפוגה המדגם במשך 15 דקות ב 14,000 x g ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant ולהוסיף 0.5 מ”ל של 70% אתנול לכל צינור. הפוך את הצינור מספר פעמים כדי לשטוף את גלולה. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 14,000 x גרם בטמפרטורת החדר. (אופציונלי: כביסה חוזרת) הביאו דגימות למכסה המנוע של הזרימה למינארית כדי להבטיח את הסטריליות של הכנת הפלסמיד ולהסיר כמה שיותר מהעל-טבעי ככל האפשר.הערה: גלולה עלול להיות מנותק מתחתית הצינור, כל כך בזהירות לצפות גלולה בעת השלכת supernatant. אוויר לייבש את הכדור בתוך מכסה המנוע זרימה למינאר במשך 15 – 20 דקות ולהמיס את ה- DNA ב 50 μL של מאגר elution מסונן, 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 (ודא כי כדורי אינם מיובשים יתר על הרה). מאז DNA bacmid רקומביננטי הוא גדול מ 135 kb בגודל, כדי למנוע גזירה של DNA, להמיס את גלולה על ידי הקשה עדינה. כדי לאמת את נוכחותו של הגן של עניין ב- DNA bacmid, להגדיר את תערובת תגובת PCR בצלחת PCR 96-גם. הכן את תערובת PCR כדלקמן: 1 μL של חוצץ, 0.2 μL (10 מ”מ כל אחד) של dNTPs, 0.1 μL של פולימראז DNA Taq, 0.1 μL (25 מיקרומטר) של פריימרים קדימה והפוך (BACV2FWD: tattccattattcataccg; BACV2REV: ctctacaaatgtggtggggc), 1 μL של DNA bacmid ו 8 μL של מים. בצע הגברה של הגנים היעד עם denaturation הראשונית במשך 2 דקות ב 95 °C (69 °F), ואחריו 25 מחזורים של 94 °C (60 °F) עבור 30 s, ו 72 °C (72 °F) עבור 1 דקות / kb. לסיים את התגובה לאחר הארכה סופית במשך 7 דקות ב 72 מעלות צלזיוס. נתח 10 μL של מוצר ההגברה על 1% (w / v) ג’ל agarose המכיל פתרון כתמי חומצת גרעין על ידי אלקטרופורזה. אחסן את DNAs bacmid מאומת ב 4 מעלות צלזיוס. 2. דור של מניות קולווירוס רקומביננטי הערה: השתמש בתאי Sf9 הגדלים באופן אקספוננציאלי עם יכולת הקיום של 95% או יותר עבור כל שלב של פרוטוקול הביטוי baculovirus, כולל transfection התא עבור הדור baculovirus, הגברה נפח baculovirus, הקרנת ביטוי חלבון, וייצור חלבון. החלקה של תאי Sf9 עם DNA Bacmid ו reagents transfection (T.R.) כגון JetPrime או X-tremeGENE 9.הערה: כתמים כחולים Trypan ו hemocytometer ניתן להשתמש כדי לקבוע ספירת תאים קיימא ו % הכדאיות של התא. תאים שאינם בני קיימא תופסים את הכתם ומופיעים כחולים מתחת למיקרוסקופ בעוד תאים בני קיימא נשארים לא מוכתמים. כדי לחשב את % הכדאיות של התאים, מתקבלת ספירת תאים כוללת (לא מוכתמת ומוכתמת) וספירת התאים בת קיימא מחולקת בספירת התאים הכוללת ומוכפלת ב- 100. לדלל את תאי Sf9 הגדלים באופן אקספוננציאלי לצפיפות תאים סופית של 4 x 105 תאים / מ”ל במדיית חרקים ללא סרום ולשפוך לתוך מאגר ריאגנט סטרילי. השתמש פיפטה רב ערוצי לתכנות כדי לזרוע 0.5 מ”ל של תאי Sf9 מדולל לתוך כל באר של צלחת 24-well. תווית באר אחת של הלוח כפקד (לא נגוע) ולהשתמש בו כפקד כדי להשוות את התאים transfected ולא נגועים כדי להעריך סימנים פוטנציאליים של זיהומים. לאחר זריעת התאים לתוך הצלחות, בעדינות לנענע את הצלחות קדימה ואחורה מספר פעמים כדי להבטיח חד שכבתית אפילו של תאים. אל תערבב את הצלחות כי התאים יתקבצו למרכז הבאר. דגירה הצלחות ב 27 °C (69 °F) לפחות 1 שעות כדי לאפשר חיבור התא ללוחות התרבות. מערבבים היטב את בקבוקון reagent transfection. עבור כל transfection, להוסיף 2 μL של מגיב transfection ל 100 μL של מאגר transfection. ניתן להשתמש גם בכל מדיום חרקים לא מפואר אחר. מפקידים את ריאגנט transfection מדולל במאגר מגיב סטרילי בעדינות לערבב במשך 10 s. באמצעות פיפטה 12 ערוצים, להעביר 102 μL של reagent transfection מדולל לתוך צלחת סטרילית 96-microwell. העבר 10 μL של פתרון 0.2 מיקרוגרם / μL של DNA bacmid רקומביננטי לתוך הבאר המתאימה של צלחת microwell 96-היטב ומערבבים על ידי טלטול בעדינות (הקשה) הצלחת מהצדדים. דגירה תערובת transfection במשך 15-20 דקות כדי לאפשר היווצרות מורכבת. באמצעות פיפטה מתכווננת בת 6 ערוצים המיועדת להעברה בין צלחות של 96 ו-24 בארות, מוסיפים את תערובת הטרנס-פפיקציה על התאים לבארות מקבילות של לוחות טרנס-פפיקציה ודגרה למשך 4-5 שעות ב-27 מעלות צלזיוס. בעדינות לטלטל את הצלחות קדימה ואחורה מספר פעמים במהלך זמן הדגירה כדי להבטיח הפצה שווה של תערובת transfection על monolayer התא. 4-5 שעות לאחר transfection, להוסיף 1.5 מ”ל של חרקים סרום ללא בינוני בתוספת 10% (v / v) הסופי של סרום שור עוברי מומת חום אנטי-מיקוטי אנטיביוטי ל 1% (v / v) נפח סופי (100 יחידות / מ”ל של פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ”ל של סטרפטומיצין, ו 0.25 מיקרוגרם / מ”ל של אמפיטריצין B). דגירה התאים באינקובטור 27 °C (77 °F) עבור 72-96 שעות. בעדינות לנענע את צלחות transfection פעם ביום כאשר הדבר אפשרי. חפשו סימני הידבקות (SOI), המתבטאים בתאים שהודבקו במהירות של 72-96 שעות לאחר ההדבקה (איור 2). זכור כי התאים החודרים יתחילו לייצר את הנגיף ולהדביק עוד יותר את התרבות; לכן, לחפש את הסימנים של זיהום.הערה: סימני זיהום הם שינויים מבניים בתאי החרקים, כגון עלייה של 25-50% בקוטר התא, גרעיני תאים מוגדלים, צורה מעוגלה באופן אחיד, אובדן התפשטות והקפדה על משטח צלחת התרבות, כמו גם ירידה בכדאיות התא (איור 2. Baculovirus נגועים ותאי Sf9 נגועים). 3. קטן – הקרנת ביטוי חלבון בקנה מידה והגברת וירוסים זיהום של תאי Sf9 עם מניות P1 baculovirus.הערה: 4-5 ימים לאחר transfection, סימנים של זיהום צריך להיות ניכר בתאים transfected בהשוואה לתאי הבקרה (לא נגוע) תחת מיקרוסקופ הפוך. baculoviruses רקומביננטי הראשוני מופרש לתוך המדיום תרבות התא צריך להיות מוכן לאסוף. זרע 2 x 105 תאי Sf9 הגדלים באופן אקספוננציאלי במדיית חרקים ללא סרום לתוך כל באר של 24 בארות צלחות בנפח כולל של 2 מ”ל עבור זיהום עם וירוסי P1 כדי להגביר את נפח הנגיף (וכתוצאה מכך הדור של וירוסי P2). לאחר צינור התאים לתוך הצלחות, בעדינות לטלטל את הצלחות, באמצעות תנועה הלוך ושוב כדי להבטיח מונולייר אפילו. אל תערבב את הצלחות כי התאים יתקבצו למרכז הבאר. דגירה הצלחות ב 27 °C (69 °F) לפחות 1 שעות כדי לאפשר הדבקה הסלולר לצלחת. לוותר על 4 מ”ל של תאי Sf9 בצפיפות של 3.5-4 x 106 במדיום ללא סרום חרקים לתוך כל באר של בלוקים 24-באר להדביק עם וירוסים P1 עבור הקרנת ביטוי החלבון.הערה: תווית באר אחת של לוחות 24-באר בלוקים 24-well כמו שליטה ולהשתמש כפקד נגוע להשוואה של תאים נגועים שאינם נגועים כאשר מחפשים SOI. השתמש multichannel אלקטרוני לתכנות כדי לאפשר איסוף בו זמנית של וירוסים P1 (שלב 2.1.13), זיהום של תאים Sf9 זרע טרי (שלב 3.1.1) וזיהום של תאים מתלים בלוקים 24-באר (שלב 3.1.4) עם 150 μL של וירוסים P1. סובבו את שאר המניות הנגיפיות שנאספו ב-P1 במשך 15 דקות ב-17,970 x גרם, העבירו אותן לצינורות מיקרוצנטריפוגה ואחסנו בחושך ב-4 מעלות צלזיוס. בעדינות לנענע את צלחות 24-well (שלב 3.1.1) על שייקר הדדית כדי להבטיח הפצה שווה של וירוסי P1 הוסיף על monolayer התא; לחזור על זה כמה פעמים במהלך זמן הדגירה. לכסות את בלוקים 24-באר עם תרבות ההשעיה של תאי Sf9 נגועים (שלב 3.1.4) עם גיליון airpore. דגירה בלוקים 24-באר ב 27 מעלות צלזיוס, רועד ב 245 סל”ד עבור 72-96 שעות. חפש SOI בתוך 72-96 שעות לאחר זמן ההדבקה בלוחות 24 באר עם וירוסי P2 (שלב 3.1.1) ובגושים 24-well (שלב 3.1.4) עם תאים נגועים עבור הקרנת הביטוי.הערה: 4-5 ימים לאחר ההדבקה של תאי Sf9 עם וירוסי P1, SOI צריך להיות ניכר בתאים הנגועים בהשוואה לתאי הבקרה שאינם נגועים תחת מיקרוסקופ הפוך. לאסוף וירוסים P2 מ 24-באר צלחות, צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 17,970 x גרם, להעביר אותם לצינורות microcentrifuge ולאחסן בחושך ב 4 °C (69 °F). ב 72-96 שעות לאחר ההדבקה, לרסס על בלוקים 24-באר עם 70% אתנול, להביא לתוך מכסה המנוע זרימה למינאר, ולבדוק את צפיפות התא ואת הכדאיות בכמה בארות על ידי טריפאן כחול כתמים. המשך טיהור חלבון אם תאים יש סימנים של זיהום וכדאיות קרוב 70-75% כפי שהוערך על ידי טריפאן כחול כתמים. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה בלוקים 24-באר ב 525 x g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. להשליך את supernatant ביסודיות להשעות את כדורי 1 מ”ל של מאגר תמוגה הכולל 25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.6 % NP-40, 2 mM imidazole, 5% גליצרול (v / v) ו 1x קוקטייל מעכב פרוטאז (100x מעכבי פרוטאז קוקטייל כולל אפרוטינין 0.25 מ”ג / מ”ל, leupeptin 0.25 מ”ג / מ”ל, פפטטין A 0.25 מ”ג / מ”ל; E-64 0.25 מ”ג/ מ”ל). אחסן את המתלה התא ב -80 מעלות צלזיוס לטיהור הבדיקה הבאים (ראה 3.2.2). טיהור חלבונים מהשעיית תאים קפואים בבלוקים של 24 באר של ביטויי בדיקה. הרכבה של בלוק הכריכה (איור 3). הנח 3 שכבות חופפות של parafilm בחלק העליון של בלוק באר 96 עמוק (96 עמוק גם 2.4 מ”ל). מניחים צלחת מסנן 96-well (מיקרופלטה מסנן, 96-טוב, פוליפרופילן עם 25 מיקרומטר גבוה במיוחד משקל מולקולרי פוליאתילן קרום) על החלק העליון של בלוק באר 96-עמוק. לדחוף כלפי מטה את צלחת המסנן כדי לאבטח את הטיפים לתוך parafilm כדי לאטום את צלחת המסנן מן הבלוק עמוק 96-גם. העבר 50 μL של תרחיף שרף 50% Ni-NTA שקול מראש לתוך כל באר של צלחת המסנן. פרוצדורת ביטוי בדיקה מניחים את המתלה תא קפוא (שלב 3.1.15) נוכח בלוקים 24-באר באמבט מים ב RT במשך 5-10 דקות, ולאחר מכן לנער ב 450 סל”ד במשך 20 דקות. צנטריפוגה בלוקים 24-באר ב 3,275 x גרם במשך 15 דקות. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר את lysates פינה לתוך צלחת מסנן המכיל 50 μL של מראש שווה 50% Ni-NTA שרף תרחיף (שלב 3.2.1.4) ולאטום את צלחת המסנן עם מחצלת כובע 96-well (מחצלת כובע 96-well, לשימוש עם באר מרובעת, 2 מ”ל).הערה: השתמש בכמה גומיות כדי לשמור על בלוק הכריכה יחד במהלך שלבי הדגירה והצנטריפוגה. מניחים את בלוק הכריכה המאובטח במשך 45 – 60 דקות לתוך מסובב בחדר קר כדי להדגיר lysates פינה עם שף Ni-NTA. לאחר הדגירה, הרם בזהירות את צלחת המסנן והסר את שכבת הפרפילם מפני השטח של בלוק הבאר בעומק 96 (שלב 3.2.1.1). מניחים בחזרה את צלחת המסנן על גבי בלוק באר 96-עמוק לסובב למטה את בלוק כריכה מאובטח במשך 2 דקות ב 235 x g. לשטוף את הקשר Ni-NTA שרפן 2x עם 2 מ”ל של חוצץ כביסה הכולל 25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% גליצרול, ו 15 mM imidazole. סובבו את הבלוק עם חיץ כביסה בכל פעם במשך 5 דקות ב 235 x גרם כדי להבטיח הסרה מלאה של שאריות נוזל. להעביר את צלחת המסנן בחלק העליון של צלחת PCR 96-היטב המכיל 10 μL של צבע טעינה 4x. הוסף 40 μL של מאגר elution (25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% גליצרול, 500 mM imidazole) לכל באר של צלחת המסנן דגירה במשך 5 דקות. סובבו את הבלוק כדי להפוך חלבונים לצלחת PCR של 96 באר ב-235 x גרם למשך 10 דקות. לאטום את צלחת PCR 96-גם עם כרית ברז עמיד בטמפרטורה גבוהה חום ב 98 °C (69 °F) במשך 3 דקות. טען 15 μL של דגימות חלבון eluted במאגר Laemmli סטנדרטי על 4-20% SDS-PAGE ג’ל ליד סולם החלבון ולהפעיל את הג’ל עם חיץ ריצה סטנדרטי המכיל SDS. הכתימו את הג’ל בכחול קומאסי ודה-כתם במים. נתח את התוצאות של ביטוי הבדיקה כדי לזהות את מבני ההבעה הטובים ביותר לייצור בקנה מידה גדול. 4. הכנות של תאי חרקים נגועים baculovirus (SCBIIC) לייצור חלבון 4 ימים לפני זמן הייצור המתוזמן, פצל תאי Sf9 הגדלים באופן אקספוננציאלי לצפיפות תאים סופית של 2 x 106 תאים / מ”ל לתוך 125 מ”ל / 250 מ”ל / 500 מ”ל Erlenmeyer זכוכית לנער בקבוקים עם מבלבל ב 50 מ”ל / 100 מ”ל / 200 מ”ל של חרקים סרום חינם בינוני המכיל 1% (v / v) סופי אנטיביוטי. הוסף 0.150 מ”ל / 0.300 מ”ל / 0.6 מ”ל של וירוסי P2 מתאימים, דגירה תאים נגועים ב 165 סל”ד על שייקר מסלולית עם שבץ של אינץ ‘אחד בטמפרטורה נמוכה יותר של 25 °C (70 °F) כדי להאט את חלוקת התא. ב 4 ימים לאחר ההדבקה, לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ עבור SOI ולהמשיך לייצור אם הכדאיות התא כפי שאומת עם כתם כחול Trypan קרוב 70-75%. 5. הכנות תאי Sf9 לייצור חלבונים בקנה מידה גדול 4 ימים לפני זמן הייצור המתוזמן, לחשב את הנפח הנדרש של תאי Sf9 לייצור חלבון בקנה מידה גדול. זרע 2 L של תאי Sf9 הגדלים באופן אקספוננציאלי במדיום ללא סרום חרקים לצפיפות תאים של 1 x 106 תאים / מ”ל בבקבוקי טלטול 2.8 L פרנבך. דגירה צלויים ב 27 מעלות צלזיוס עם טלטול להגדיר ב 150 סל”ד.הערה: כדי למנוע זיהום חיידקי בתרבית התא Sf9, להשתמש gentamicin לריכוז הסופי של 10 מיקרוגרם / מ”ל או פניצילין / סטרפטומיצין ל 50 U / mL ו 50 מיקרוגרם / מ”ל, בהתאמה. 6. זיהום של תאי Sf9 עם SCBIIS לייצור חלבון בקנה מידה גדול פצל 2 L או 4 L של תאי Sf9 הגדלים באופן אקספוננציאלי במדיום ללא סרום חרקים לצפיפות תאים סופית של 4 x 106 תאים / מ”ל בבקבוקי טלטול 2.5 L Tunair או בקבוקי ריאגנט 5 L. הוסף 10-12 מ”ל / L של תא חרק נגוע baculovirus (SCBIIC) תרבות ההשעיה. דגירה את התרבות הנגועה של תאי Sf9 על שייקר עם 145 סל”ד בטמפרטורה נמוכה יותר של 25 °C (כדי להאט את חלוקת התא) עבור 72-96 שעות. ב 72 שעות לאחר ההדבקה, לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ עבור SOI ולהעריך את הכדאיות של התא. בדרך כלל, לאחר כ 72 שעות לאחר ההדבקה, הכדאיות של תאי Sf9 יורדת ל 70%-75% (נמדד באמצעות כתם כחול Trypan). קציר נגוע Sf9 תאים בבקבוק פוליפרופילן 1 L על ידי צנטריפוגה ב 900 x g במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. Resuspend גלולת התא שנאסף מ 1 L של תרבות תא הייצור עם 20-25 מ”ל של 1x PBS על ידי מערבולת בעדינות ולהעביר לתוך צינורות חרוט 50 מ”ל. סובב את השעיית התא ב- 900 x g למשך 15 דקות והשליך את פתרון PBS. Resuspend גלולת התא שטף עם 20-25 מ”ל של מאגר ההשעיה (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 5% גליצרול, 1x פרוטאז מעכב קוקטייל) והקפאה פלאש חנקן נוזלי; לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד טיהור.הערה: הליכי טיהור עבור PRMTs תוארו בפירוט במאמר שפורסם SGC6.

Representative Results

מבט כולל על פרוטוקול BEVS מתואר באיור 1. מבנים ביטוי מרובים של PRMTs, כולל אורך מלא, תחומים, שברים קטועים, נוצרו בקונסורציום גנומיקה מבנית (SGC, טורונטו) על פי אסטרטגיות בתוך הבית בניסיון להגדיל את שיעור ההצלחה לזיהוי חלבונים מסיסים ויציבים עם רמת ביטוי גבוהה יחסית7,9. הקוראים המעוניינים מוזמנים לסקור את ההגדרות והמתודולוגיה של SGC של עיצוב “קטע” כמקטע של רצף הגנים המשולב בשיבוט ביטוי, “תחום” כתחום מבני מבואר PFAM, ו “לבנות” כמו שבר משובט וקטור ביטוי, כולם תוארו בפירוט בפרסום מוקדםיותר 7. מבני ביטוי של PRMTs המוצגים בפרוטוקול זה הם לייצור של חלבונים מתויגים פוליהיסטידין משובטים לתוך וקטור pFBOH-MHL, שהוא נגזרת של וקטור pFastBac1. באיור 4, אנו מציגים ניתוח SDS-PAGE של המבנים המסיסים שלו מתויגים של PRMT1, 2, 4-9 מטוהרים מכדורים שנאספו לאחר 4 מ”ל של ייצור בתאי Sf9 (שלב 3.1.4). אורך מלא (FL) PRMT1 ו PRMT9 אינם מוצגים בג’ל זה, מאז FL PRMT1 הופק E. coli, ו FL PRMT9 המיוצר BEVS כבר מטוהר על ידי דגל תג6. המבנים הקצוצים של PRMT1, FL PRMT4, וכל מבני PRMT8 מראים תפוקה גבוהה יחסית, אך אלוטים של חלבונים מכילים שברים של מזהמים מטוהרים במשותף. מבנים אלה דורשים אופטימיזציה נוספת של פרוטוקולי הטיהור. לכן נדרשות גישות נוספות כדי לשפר את טוהר החלבונים הללו מייצורים בקנה מידה גדול, כגון הפחתה בכמות חרוזי הניקל בשלב הדגירה עם ליזאט מובהק; עלייה של ריכוזי imidazole במאגרי לשטוף; מחשוף של התג שלו עם פרוטאז TEV, ואחריו יישום על שרף ני-זיקה; וכן, שלבי טיהור נוספים כגון אי-הכללת גודל וכרומטוגרפיה של חילופי יון. המבנים של PRMT2 מראים תפוקה נמוכה משמעותית בהשוואה לחלבונים אחרים וחלבון PRMT2 באורך מלא המלווה ברצועת מזהמים חזקה. ייצור בקנה מידה ושני שלבים של טיהורים כגון IMAC והדרת גודל אישרו רמת ביטוי נמוכה עבור מבנה זה יחד עם נוכחות מתמשכת של מזהם טיהור משותף עבור חלבון FL. חלבונים טהורים הושגו עבור קומפלקס PRMT5 המיוצר ומטוהר עם השותף המחייב שלו, MEP50. המבנה הקצוב של PRMT9 כולל רמת ביטוי נמוכה כמעט פי שניים או שלושה, קרוב ל-1.5 מ”ג/ליטר, בהשוואה ל- PRMTs אחרים. עם זאת, המלאי הוויראלי הרקומביננטי של מבנה זה שימש לייצור בקנה מידה גדול, גבישים מפענחים הושגו, והמבנה נפתר עבור חלבון זה יחד עם PRMT4, 6 ו – 7 (איור 5). עבור הפקות קנה המידה, וירוסי P2 המקביל שימשו כדי להדביק את תרבות ההשעיה של תאי חרק Sf9. שלב זה יוצר 50/100/200 מ”ל של תאים נגועים baculovirus המכיל תאים נגועים וירוסים P3 ב supernatant. לייצור חלבונים בקנה מידה גדול, 2 L של תאי Sf9 היו תרבית בכל אחד 2.8 L Fernbach לנער בקבוקונים ב 150 סל”ד, 27 °C(איור 6). ביום הייצור, 2 L של תאי Sf9 (הכדאיות של התא > 97%) בבקבוקי טלטול 2.5 L Tunair או 4 L בבקבוקי ריאגנט 5 L היו מדוללים לצפיפות תאים של 4 x 106/ mL. תאים אלה היו נגועים ישירות עם 10-12 mL / L של תרבות ההשעיה של תאי חרקים נגועים baculovirus ודגר בטמפרטורה נמוכה של 25 °C (69 °F), ב 145 סל”ד. זיהום של אצוות הייצור ישירות עם תרבות ההשעיה של תאי חרקים נגועים baculovirus הפחית באופן משמעותי צעדים מייגעים וגוזלים זמן בהגברת נפח הנגיף, למעט טיפול נוסף של התאים הנגועים, ונמנע הפחתה titer ו וירוס השפלה. תחזוקת תרבות התאים SF9 וייצור בקנה מידה נעשה בכלי התרבות עם נפח מילוי גבוה לאמץ ייצור חלבון בקנה מידה גדול באצווה אחת (איור 6). PRMT באורך מלא 4, 5 (במתחם עם MEP50), 6, 7, ו 9 חלבונים המיוצרים פלטפורמת הייצור בתיווך Baculovirus שימשו לאפיון קינטי הקרנה תרכובת מעכבת ב SGC6. מבני קריסטל נפתרו והופקדו בבנק נתוני החלבון (PDB) עבור הצורות באורך מלא או קטועות של החלבונים PRMT 4, 6, 7 ו- 9 עם בדיקות ומעכבים כימיים שונים. פלסמידים של ביטוי עבור PRMTs אלה הופקדו במאגר פלסמיד Addgene (Addgene הוא שותף הפצה של SGC, https://www.addgene.org/) והם זמינים לקהילת המחקר (איור 5). איור 1: סקירה סכמטית של השלבים של תהליך הביטוי baculovirus אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: תאי Sf9 נגועים ולא נגועים. סימני זיהום הם שינויים מבניים בתאי החרקים, כגון עלייה של 25-50% בקוטר התא, גרעיני תאים מוגדלים, צורה מעוגלה אחידה, אובדן התפשטות והקפדה על משטח צלחת התרבות, כמו גם ירידה בכדאיות התא. סרגל בקנה מידה לבן 200 מיקרומטר. סימני הזיהום המוצגים כאן זהים עבור התאים החודרים באמצעות ריאגנטים של טרנס-פקטיטור, JetPrime ו- X-tremeGene 9. הדוגמה המסוימת המוצגת היא עבור מגיב transfection JetPrime. (A) תאי Sf9 לא מודבקים כפקד. (B)תאי Sf9 נגועים בבקולווירוס. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: הרכבת לוח כריכה לטיהור מהיר של חלבוני ביטוי הבדיקה. אנא עיין בטקסט לקבלת פרטים, שלבים 3.2.1-2 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: תוצאות הקרנת ביטוי חלבון. תוצאות הקרנת ביטוי חלבון של ייצור החלבון בתיווך baculovirus ב 4 מ”ל של תרבות ההשעיה Sf9 נגוע וירוסים רקומביננטיים P1 המקביל עבור PRMTs שונים קומפלקס PRMT5-MEP50. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: סיכום מבני ביטוי עבור PRMT4, 6, 7 ו- 9 המשמשים למחקרי מבנה גביש בקונסורציום הגנומיקה המבנית, טורונטו (SGC). מבני הגביש נפתרו והופקדו בבנק נתוני החלבון (PDB) עבור צורות אורך מלא או קטוע של חלבונים PRMT 4, 6, 7, ו 9 עם בדיקות כימיות שונות ומעכבים. פלסמידים ביטוי עבור PRMTs אלה הופקדו למאגר פלסמיד Addgene והם זמינים לקהילת המחקר (Addgene הוא שותף הפצה של SGC, https://www.addgene.org/). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 6: תחזוקת תאי חרקים Sf9 וייצור חלבונים בכלי התרבות השונים: (A) בקבוק 2.8 L פרנבך לתחזוקת תאים וייצור חלבונים. השימוש בנפח מילוי של 72% מגדיל את קצב התפוקה פי 2.5 בפלטפורמה רועדת אחת. (B)בקבוקי טלטול Tunair (רק 9 בקבוקונים מתוך 10 מוצגים בתמונה זו) ובקבוקי ריאגנט עם נפח מילוי של 80% מגדילים באופן דרסטי את כושר הייצור של הפלטפורמה הרועדת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

אחד היתרונות של BEVS בתאי חרקים מתמקד ביכולת של מכונות שינוי שלאחר תרגום כדי לאפשר שינויים מורכבים יותר כגון זרחון, myristoylation, ו glycosylation. יחד עם קיפול יעיל מאוד של חלבוני יונקים, שינויים אלה להקל על כמויות גבוהות של חלבון שונה ומקופל מתאים ניסויים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית במורד הזרם¹⁶.

כאן, תיארנו פרוטוקולים מפורטים של ה- BEVS המדגישים אלמנטים קריטיים לסינון ביטוי מוצלח של מבנים מרובים של חלבוני PRMT וייצור חלבון PRMT בקנה מידה גדול בפלטפורמת הביטוי של Baculovirus: 1) השימוש בפיפטות רב-ערוציות רגילות, מתכווננות וניתנות לתכנות להעברת החומרים הביולוגיים בין 24 ל -96 – צלחות ותרבות תאים היטב ובלוקים בשלבים של DNA bacmid ווירוס; אוסף של וירוסים רקומביננטיים, הגברה של כמויות ויראליות של וירוסים רקומביננטיים והכנת בלוקים הקרנת ביטוי חלבון. 2) ביצועים גבוהים ריאגנטים transfection חסכוני עבור הדור של וירוסים רקומביננטיים. 3) תרבות השעיה של תאי חרקים נגועים בבקולווירוס (SCBIIC) לייצור חלבונים בקנה מידה גדול. 4) ניצול של נפח מילוי גבוה 2.8 L Fernbach לנער בקבוקים כדי לשמור על תרבות המתלים Sf9 ו 2.5 L Tunair לנער בקבוקים ו 5 בקבוקי ריאגנט L לייצור חלבון בקנה מידה גדול.

שיקולים ונימוקים מיוחדים לצעדי הטרנספורמציה וההתמרה.
למרות פרוטוקול מסחרי ממליץ להשתמש 100 μL של תאים מוסמכים עבור טרנספורמציה אחת¹⁴, יעילות הטרנספורמציה של DH10Bac מסחרי E. coli תאים מוסמכים הוא גבוה ככל 1 x 10⁸ cfu / מיקרוגרם DNA, ולכן אנו משתמשים רק 4 μL. זה מספיק עבור כל טרנספורמנט כדי להשיג מושבות רקומביננטיות לבנות מבודדות לבידוד DNA bacmid. תאי Sf9 חסידים בלוח 24-טוב transfection היו זרעים בצפיפות התא של 2 x 10⁵ / מ”ל ב 0.5 מ”ל של מדיה חרקים ללא סרום. נפח זה מספיק כדי להבטיח כיסוי שווה של משטח העבודה של הבאר. במקביל, זה לא לדלל את תערובת transfection יותר מדי, אשר משפר את יעילות transfection. ריאגנטים של טרנז-פגז אינם רעילים לתאי Sf9, ואין צורך בחילופי מדיה. במקום שינוי מדיה, 1.5 מ”ל נוספים של מדיה המכילה 10% (v / v) FBS מתווסף ללוח transfection ב 4-5 שעות לאחר transfection זמן כדי להקל על צמיחת התא. יעילות ההשתנות של שני ריאגנטים transfection הוא גבוה. ובכל זאת, עם X-tremeGene 9, סימני ההדבקה בתאים החודרים (איור 2) מופיעים 10-12 שעות מוקדם יותר מאשר עם מגיב JetPrime, ולכן אנו בוחרים בין ריאגנטים אלה בהתאם ללוח הזמנים של העבודה של השלבים הבאים בפרוטוקולים, המספק גמישות מסוימת בתהליך הכולל.

ניתן להגדיר בדיקת חלבון עם וירוסי P2 אם כמות הנגיפים הרקומביננטיים הראשוניים, שנאספו מלוח ההעתקה ומסומנים כ- P1, היא גורם מגביל לשימוש להקרנת ביטוי החלבון.

שיקולים בעת מעבר מנפחי תרבות קטנים לגדולים.
מבחינה היסטורית, האמינו כי צמיחת תאים אופטימלית דורשת מרחב אוויר גבוה בתרבות המתלים של תחזוקת תא Sf9 והפקות בקנה מידה. עם זאת, בשנת 2014 דווח כי מרחב אווירי גבוה בכלי תרבות הוא פחות קריטי ממה שחשבו קודם לכן¹⁷. ספינת תרבות שהוקמה תוך שימוש במהירות טלטול מותאמת כראוי לזריקה מסלולית של הפלטפורמה הרועדת תספק העברת חמצן מספקת גם בתרבות המתלים של נפח מילוי גבוה על ידי יצירה ותחזוקה של בועות אוויר קטנות למשך זמן רב יותר. עם גישה זו, תאי חרקים זמינים מסחרית יכולים להיות תרבית במהירות רועדת גבוהה יותר בטווח נורמלי של זמן הכפלת התאים מבלי להקריב את הכדאיות הגבוהה של התא.

כך, לפני 6 שנים, התחלנו להגדיל את נפח תרבות המתלים בבקבוק רועד במהלך תחזוקת התאים והכנסנו סוג אחר של כלי תרבות לייצור חלבונים תוך התאמה וניטור של תנאי טלטול (איור 6). כדי לקבוע תנאים אופטימליים בכלי תרבות אלה, ניטרנו את הפרמטרים של תרבות התאים Sf9 כגון זמן הכפלת תאים יחד עם הכדאיות של התא, הגודל והצורה, מצב הצבירה ויכולת ההדבקה של תאים.

לדוגמה, עבור תחזוקת תא Sf9, בבקבוקי טלטול 2.8 L Fernbach, אנו תרבות 2 L במקום 0.8 L של תאים תלויים Sf9 רועד ב 150 סל”ד ב 27 °C (69 °F) ואת הכדאיות התא רוב הזמן קרוב 99%, עם תאים מפרידים בריאים בצורה שווה. לייצור קנה מידה, אנו מדביקים 4 L של תאים בבקבוקי ריאגנט 5 L רועדים במהירות גבוהה כמו 145 סל”ד בטמפרטורה נמוכה של 25 °C (69 °F). האינקובטורים הנפוצים ביותר עם פלטפורמה מובנית לרעוד יכולים להכיל 6 בקבוקי טלטול 2.8 L או בקבוקי ריאגנט 6 x 5 L, או בקבוקי טלטול Tunair 10 x 2.5 L. כך, הקיבולת של הפלטפורמה המטלטלת האחת, אם נמלא בקבוקי טלטול של פרנבך ובקבוקי ריאגנט ל-1/3 לעומת נפח המילוי הגבוה של כלי השיט היא 4.8 ליטר לעומת 12 ל’ באמצעות בקבוקי טלטול 2.8 ל’ פרנבך ו-10 ל’ לעומת 24 ל’ בבקבוקי ריאגנט 5 ל’(איור 6). תחזוקת תרבות תאי ההשעיה וייצור בקנה מידה גדול בכלי התרבות עם נפח מילוי גבוה עזרו לנו להתגבר על מגבלות של נפחי הייצור ולאמץ פלטפורמה בקנה מידה גדול. לכן, זה מאוד שימושי עבור מעבדות ללא גישה bioreactors ו / או שטח מוגבל בצינורות הייצור.

פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות לייצור וטיהור של מבני חלבון עם תגי זיקה שונים על ידי שימוש שרפים מתאימים ושינוי מאגרי טיהור כפי שתואר במאמר שפורסם SGC⁶ עבור הדגל מתויג חלבונים באורך מלא של PRMT4, 7, 9, ואת שלו מתויג PRMT5-MEP50 מורכב PRMT6. למרות שאנו מתארים פרוטוקול BEVS עבור משפחת החלבונים PRMT, אותה גישה יכולה להיות מיושמת על כל משפחת חלבונים אחרת.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לדליה Baryte-Lovejoy על שהנצלה את הזמן כדי לספק משוב יקר ערך והערות ביקורתיות על כתב היד ועל כל עמיתינו SGC שעבדו עם משפחת החלבונים PRMT לידי ביטוי ממערכת וקטור הביטוי Baculovirus.

SGC הוא ארגון צדקה רשום (מספר 1097737) שמקבל כספים מ- AbbVie, באייר AG, בוהרינג’ר אינגלהיים, ג’נטק, גנום קנדה באמצעות מכון גנומיקה באונטריו [OGI-196], האיחוד האירופי ו- EFPIA באמצעות היוזמה לתרופות חדשניות 2 התחייבות משותפת [מענק EUbOPEN 875510], ינסן, מרק KGaA (aka EMD בקנדה ובארה”ב), פייזר, טקדה וקרן Wellcome [106169/ZZ14/Z].

Materials

2.8L Nalgene Fernbach Culture Flask, Polycarbonate,	Nalgene	29171-854	For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells
24-Well Blocks RB	Qiagen	19583	For incubation of 4ml of suspension Sf9 cells for protein expression screening
4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul	Biorad	5671095	For SDS-PAGe analysis of the purified proteins
50ml Reagent Reservoir	Celltreat Scientific Products	229290	Reservoir used for diluted transfection reagent and Sf9 cells suspension
96-well cap mat, for use with square well, 2 mL	Greiner Bio-One	381080	Used to cover 96 well block
96 well PCR plate	Eppendorf	30129300
Bacto agar	BD	214010	For LB-agar selection paltes
Airpore Tape Sheets	Qiagen	19571	To cover 24 well blocks for protein expression screening
Allega X-15R Centrifuge	Beckman Coulter	392932
Antibiotic Antimycotic (100x)	Gibco	15240112
Bacmid DNA	in-house	non-catalog item	Bacmid DNA for baculovirus production
Bluo-Gal, 1g	Thermo Fisher	15519028
Beckman JLA 8.1000
Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile	Eppendorf	30722116	Tissue culture treated plate
Cell Resuspension Solution 0.5 L	Millipore Sigma	LSKCRS500	For Bacmid DNA extraction
Cell Lysis Solution 0.5 L	Millipore Sigma	LSKCLS500	For Bacmid DNA extraction
CELLSTAR Tissue Culture Plates, 96 well	Greiner Bio-One	655180	For transfection mix
ClipTip 1250, filter reload, sterile	ThermoFisher Scientific	94420818	Tips for programmable and adjustable multichannel pipette
dNTP Mix (25 mM each)	Thermo Fisher Scientific	R1121
E1-ClipTip Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL	ThermoFisher Scientific	4672090BT	Programmable and adjustable multichannel pipette
E4 XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL	Ranin	LTS EA6-300XLS	Ranin adjustable multichannel pipette
Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane	Agilent	201005-100	For protein purification in expression screening
Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L	IBI Scientific	SS-6003C	For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells
Gentamicin 10x10ml	BioShop	15750078
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Wisent Biocenter	080-450
I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L	Wisent Biocenter	301-045-LL	Serum free insect cells growth medium
InstantBlue, Ultrafast Protein Stain	Expedeon Protein Solutions	ISB1L-1L	For protein gel (SDS-PAGE) staining
Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5%	BioShop	IPT001.100
JetPRIME Transfection Reagent Provided with jetPRIME buffer	POLYPLUS TRANSFECTION Inc	114-01	For Sf9 cells transfection to generate baculovirus
Kanamycin Monosulfate	BioShop	KAN201.100
Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro&	Sigma	L3022-1KG
Masterblock 96 deep well 2.4mL	Greiner Bio-One	780285-FD	Used in the transformation and expression screening procedures
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml	Thermo Fisher	10361012	Competent cells for bacmid DNA generation
mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 – 300 uL	Sartorius	Sartorius 725240	12 channel pipette
Neutralization Solution, 0.5 L	Millipore Sigma	LSKNS0500	For bacmid DNA extraction
New Brunswick Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in)	Eppendorf	M1282-0004	Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30250	For protein purification
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	LS15140122
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 500ml	Pyrex	4444-500	For suspension culture of Sf9 cells
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 125ml	Pyrex	4444-125	For suspension culture of Sf9 cells
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 250ml	Pyrex	4444-250	For suspension culture of Sf9 cells
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution	Froggabio	21141
RNase A, 0.9 mL	Millipore Sigma	LSKPMRN30	For suspension buffer for bacmid DNA extraction
Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads	MP Biomedicals	115000550	For spread of bacterial cells across the surface of an agar plate.
RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips)	Ranin	30389253	Tips for ranin multichannel pipette
S.O.C. Medium	Thermo Fisher Scientific	15544034
Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian	cytivalifesciences	SH3039602	Addition to the serum free medim for the transfected cells
Sf9 cells	Thermo Fisher	12659017	Insect cells
Sfx-Insect Cell Culture Media	Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences)	SH3027802	Serum free insect cells growth medium
Tape Pad	Qiagen	19570	Tape Pad
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer – 2,000 units	New England Biolabs	M0267L
Tetracycline Hcl	BioShop	TET701.10
Trypan Blue 0.4% Solution	Gibco	15250061	For assessment of cell viability
VITLAB Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L	VITLAB	V100889	For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells
VWR Digital Mini Incubator	VWR	10055-006	Incubator for adherent Sf9 cells
VWR Incubating Microplate Shaker	VWR	97043-606	Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks
VWR Petri Dishes	VWR	CA73370-037
X-tremeGene 9 DNA Transfection Reagent 1.0 M	Roche	6365787001	For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus

Referanslar

Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and relevance of arginine methylation. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
Thandapani, P., O’Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
Lorton, B. M., Shechter, D. Cellular consequences of arginine methylation. Cell and Molecular Life Sciences. 76 (15), 2933-2956 (2019).
Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: Who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2008).
Frankel, A., Brown, J. I. Evaluation of kinetic data: What the numbers tell us about PRMTs. Biochimica Biophysica Acta Proteins Proteomics. 1867 (3), 306-316 (2018).
Li, A. S. M., Li, F., Eram, M. S., Bolotokova, A., Dela Seña, C. C., Vedadi, M. Chemical probes for protein arginine methyltransferases. Methods. 175, 30-43 (2020).
Savitsky, P., et al. High-throughput production of human proteins for crystallization: The SGC experience. Journal of Structural Biology. 172, 3-13 (2010).
Gileadi, O., et al. Expressing the human proteome for affinity proteomics: Optimizing expression of soluble protein domains and in vivo biotinylation. New Biotechnology. 29 (5), 515-525 (2012).
Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5, 135 (2008).
Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).
Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
Shrestha, B., et al. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods in Molecular Biology. 439, 269-289 (2008).
Smith, G. E., Summers, M. D., Fraser, M. J. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Molecular Cell Biology. 3, 2156-2165 (1983).
Invitrogen Life Technologies. . Invitrogen, Bac-to-Bac Baculovirus expression system. , (2010).
Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67, 4566-4579 (1993).
Irons, S. L., Chambers, A. C., Lissina, O., King, L. A., Possee, R. D. Protein Production Using the Baculovirus Expression System. Current Protocol in Protein Sciences. 91, 1-22 (2018).
Rieffel, S., et al. Insect cell culture in reagent bottles. MethodsX. 1, 155-161 (2014).

Etiketler

Recombinant PRMT Proteins Baculovirus Expression Vector System Protein Expression SF9 Cells Transfection Serum-free Insect Media Protein Purification Biochemical Studies Biophysical Studies Structural Studies

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Hutchinson, A., Seitova, A. Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System. J. Vis. Exp. (173), e62510, doi:10.3791/62510 (2021).