O sistema vetorial de expressão baculovírus (BEVS) é uma plataforma robusta para triagem de expressão e produção de metiltransferases de arginina proteica (PRMTs) a serem utilizadas para estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais. Quantidades de miligrama de material podem ser produzidas para a maioria dos PRMTs e outras proteínas de interesse que requerem uma plataforma de expressão eucariótica.
Proteína arginina metiltransferases (PRMTs) mtilato resíduos de arginina em uma grande variedade de proteínas que desempenham papéis em inúmeros processos celulares. PrMTs podem agrupar-se de grupos de arginina guanidino mono ou dimetilato simetricamente ou assimetria. A enzima dessas proteínas é uma área complexa e intensamente investigada que requer quantidades miligramas de proteína recombinante de alta qualidade. O sistema vetorial de expressão baculovírus (BEVS) que emprega células de insetos Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) e Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) tem sido usado para triagem e produção de expressões de muitos PRMTs, incluindo PRMT 1, 2 e 4 a 9. Para testar simultaneamente a expressão de múltiplas construções dessas proteínas, incluindo domínios e fragmentos truncados, bem como as proteínas de comprimento completo, aplicamos métodos escaláveis utilizando pipetas multicanais ajustáveis e programáveis, combinados com placas e blocos de 24 e 96 poços. No geral, esses ajustes de método permitiram uma geração em larga escala de DNA bacmídeo, vírus recombinantes e rastreamento de expressão proteica. O uso de embarcações culturais com um alto volume de suspensão celular Sf9 ajudou a superar as limitações de espaço no gasoduto de produção para produção de proteínas em grande escala em lote único. Aqui, descrevemos protocolos detalhados para a expressão eficiente e econômica dos PRMTs funcionais para estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais.
Proteína arginina metiltransferases (PRMTs) resíduos de arginina metilato em uma moda dimetil monometo ou simétrica/assimétrica. As sequências repetitivas de RG/RGG/GRG são altamente preferidas pela maioria dos PRMTs e são encontradas em uma grande variedade de proteínas1,2. Proteínas metiladas de arginina, como histones ou fatores de transcrição e fatores de emenda, regulam transcrição, emenda e estrutura de cromatina3,4. O aumento do conhecimento da regulação diversificada da utilização do substrato e cofato, da rotatividade e da cinética dos PRMTs, bem como da geração de inibidores seletivos, lançaram luz mecanicista sobre essas enzimas e seus complexos5,6. No entanto, nem todos os membros da família PRMT são estudados na mesma medida; por exemplo, prMT9 foi recentemente descoberto como um membro da família PRMT1. Estudos de estrutura e função enzimática para essas proteínas requerem quantidades suficientes, muitas vezes miligramas, de proteína recombinante para estar disponível.
O sistema de expressão procariótica Escherichia coli (E. coli) é geralmente a primeira opção para a triagem de expressão utilizando múltiplos construtos para uma determinada proteína7,8,9. No entanto, a expressão baseada em E. colinem sempre resulta em quantidades suficientes de proteínas PRMT em suas formas ativas, como temos observado em particular para PRMT5 e PRMT7 (veja abaixo). Assim, os PRMTs que não se expressavam em E. coli ou precisavam ser produzidos pelas máquinas de expressão eucariótica foram subclolados em vetores apropriados para a triagem de expressão no sistema vetorial alternativo de expressão baculovírus (BEVS). Enquanto e. coli expressou amostras de PRMT1, PRMT3 e PRMT8 têm sido amplamente utilizados para ensaios in vitro e cristalografia, outros PRMTs como PRMT5, que requer mep50 parceiro vinculativo de seu domínio de metiltransferase dupla, e PRMTs como PRMT7 e 9, necessitam de expressão celular inseto para obter quantidades suficientes de proteína ativa. No geral, os ensaios padronizados de metiltransferase de média produção padronizados para PRMT4, 5, 6, 7 e 9 utilizaram o BEVS em célulasinsetos 6. O sistema vetorial de expressão de baculovírus (BEVS) é uma plataforma versátil para produzir proteínas recombinantes que requerem o maquinário de expressão eucariótica que permite modificações pós-translacionais essenciais para estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais10,11,12. Vários BEVSs tornaram-se comercialmente disponíveis desde o primeiro uso relatado de baculovírus em 1983 para expressão proteica13. A maioria desses protocolos emprega diferentes estratégias para a transferência da expressão plasmid em células de insetos. Estes incluem Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, etc. Nosso protocolo é baseado no sistema mais utilizado no BEVS, o sistema Bac-to-Bac14, que foi projetado para transferir o gene/cDNA codificando a proteína de interesse (POI, aqui os PRMTs) para o genoma baculovírus mantido em uma cepa especializada de E. coli via transposição específica do local15.
Resumidamente, o vetor de transferência plasmida contendo o gene de interesse foi transformado em células competentes DH10Bac E. coli para gerar DNA bacmídeo viral recombinante. As células Sf9 aderentes foram então transfeinadas com DNA bacmídeo. Quatro a cinco dias após a transfecção, baculovírus recombinantes iniciais escondidos no meio de cultura celular foram recuperados e rotulados como o vírus P1. Os estoques de baculovírus P1 foram então utilizados para amplificação de vírus (ou seja, geração de estoques de baculovírus P2) e triagem de expressão proteica. Com base nos resultados de triagem de expressão, foram identificados e utilizados vírus P2 para a melhor construção de expressão da proteína para gerar culturas de suspensão de células de insetos infectadas pelo baculovírus (SCBIIS) para a produção de proteínas em larga escala. Aqui, descrevemos nossos protocolos detalhados e descrevemos a lógica por trás de nossas escolhas de reagentes e vasos culturais para apoiar nossa estratégia de desenvolver uma metodologia mais eficiente, econômica e escalável para obter quantidades suficientes de proteínas recombinantes desejadas.
Uma das vantagens do BEVS em células de insetos centra-se na capacidade do maquinário de modificação pós-translacional para permitir modificações mais complexas, como fosforilação, miristoilação e glicosilação. Juntamente com a dobra altamente eficiente das proteínas mamíferas, essas modificações facilitam altas quantidades de proteína modificada e dobrada adequada para experimentos fisiologicamente relevantes a jusante16.
Aqui, descrevemos protocolos detalhados do BEVS enfatizando elementos críticos para a triagem de expressão bem-sucedida de múltiplas construções de proteínas PRMT e produção de proteína PRMT em larga escala na plataforma de expressão Baculovirus: 1) O uso de pipetas multicanais regulares, ajustáveis e programáveis para transferir os materiais biológicos entre 24 e 96 – placas e blocos de cultura de células bem nas fases de DNA bacmid e geração de vírus; uma coleção dos vírus recombinantes, amplificação dos volumes virais dos vírus recombinantes e preparação dos blocos de triagem de expressão proteica. 2) Reagentes de transfecção de alto desempenho e econômicos para a geração de vírus recombinantes. 3) Cultura de suspensão de células de insetos infectadas pelo baculovírus (SCBIIC) para produção de proteínas em larga escala. 4) Utilização de frascos de alto volume de enchimento 2,8 L Fernbach para manter a cultura de suspensão Sf9 e frascos de shake tunair de 2,5 L e garrafas de reagente de 5 L para a produção de proteínas em larga escala.
Considerações especiais e fundamentais para os passos de transformação e transfecção.
Embora um protocolo comercial recomende o uso de 100 μL de células competentes para uma transformação14, a eficiência de transformação das células comerciais DH10Bac E. coli é tão alta quanto 1 x 108 cfu/ μg DNA, por isso usamos apenas 4 μL. Isso é suficiente para cada transformador obter colônias isoladas de recombinantes brancas para o isolamento do DNA bacmídeo. As células Sf9 aderentes na placa de transfecção de 24 poços foram semeadas a uma densidade celular de 2 x 105 /mL em 0,5 mL de Mídia de Insetos Sem Soro. Este volume é suficiente para garantir até mesmo a cobertura da superfície de trabalho do poço. Ao mesmo tempo, não dilui muito a mistura de transfecção, o que aumenta a eficiência da transfecção. Reagentes de transfecção não são tóxicos para as células Sf9, e a troca de mídia não é necessária. Em vez de uma mudança de mídia, um adicional de 1,5 mL de mídia contendo 10% (v/v) FBS é adicionado na placa de transfecção a 4-5 horas após a transfecção para facilitar o crescimento celular. A eficiência de transfecção de ambos os reagentes de transfecção é alta. Ainda assim, com x-tremeGene 9, os sinais de infecção nas células transfeinadas (Figura 2) aparecem 10-12 h mais cedo do que com o reagente JetPrime, por isso escolhemos entre esses reagentes dependendo do cronograma de trabalho dos próximos passos nos protocolos, o que proporciona alguma flexibilidade no processo geral.
A triagem de expressão de teste proteico pode ser configurada com vírus P2 se a quantidade dos vírus recombinantes iniciais, coletadas da placa de transfecção e rotuladas como P1, for um fator limitante a ser usado para a triagem da expressão proteica.
Considerações ao passar de pequenos para grandes volumes culturais.
Historicamente, acreditava-se que o crescimento ideal das células requer um alto espaço aéreo na cultura de suspensão das produções de manutenção celular Sf9 e escala. No entanto, em 2014, foi relatado que o alto espaço aéreo em navios culturais é menos crítico do que se pensava17. Um vaso cultural criado usando velocidade de agitação adequadamente ajustada para o lançamento orbital da plataforma de agitação fornecerá transferência de oxigênio suficiente mesmo na cultura de suspensão de alto volume, criando e mantendo pequenas bolhas de ar por mais tempo. Com essa abordagem, as células de insetos disponíveis comercialmente podem ser cultivadas a uma velocidade de agitação mais alta dentro de uma faixa normal do tempo de duplicação das células sem sacrificar a alta viabilidade celular.
Assim, há 6 anos, começamos a aumentar o volume de cultura de suspensão em um frasco de agitação durante a manutenção celular e introduzimos um tipo diferente de vaso cultural para produção de proteínas, ajustando e monitorando as condições de agitação(Figura 6). Para estabelecer condições ideais nesses vasos culturais, monitoramos os parâmetros de cultura celular Sf9, como o tempo de duplicação celular, juntamente com viabilidade celular, tamanho e forma, estado de agregação e infectabilidade das células.
Por exemplo, para a manutenção celular Sf9, nos frascos de shake de 2,8 L Fernbach, nós cultura 2 L em vez de 0,8 L das células de suspensão Sf9 tremendo a 150 rpm a 27 °C e viabilidade celular na maior parte do tempo é perto de 99%, com células divisórias saudáveis em forma uniforme. Para a produção de escala, infectamos 4 L de células em garrafas de reagente 5 L tremendo em alta velocidade a 145 rpm a uma temperatura reduzida de 25 °C. As incubadoras mais usadas com uma plataforma de agitação embutida podem conter frascos de shake de 6 x 2,8 L ou garrafas de reagente 6 x 5 L, ou frascos de shake 10 x 2,5 L Tunair. Assim, a capacidade da plataforma de agitação, se enchermos frascos de shake Fernbach e garrafas de reagente a 1/3 versus o alto volume de enchimento dos vasos é de 4,8 L contra 12 L usando frascos de shake 2.8 L Fernbach e 10 L versus 24 L usando garrafas de reagente 5 L(Figura 6). A manutenção da cultura celular suspensa e a produção de escala nos navios de cultura com um volume de alto enchimento nos ajudaram a superar as limitações dos volumes de produção e adotar uma plataforma em larga escala. Assim, isso é altamente útil para laboratórios sem acesso a bioreatores e/ou espaço limitado nos gasodutos de produção.
Este protocolo poderia ser prontamente adaptado para a produção e purificação de construções proteicas com diferentes etiquetas de afinidade utilizando resinas apropriadas e modificando tampões de purificação, como foi descrito no artigo6 publicado pelo SGC para as proteínas de comprimento total marcadas por bandeiras do PRMT4, 7, 9, e do complexo PRMT5-MEP50 e PRMT6. Embora descrevamos um protocolo BEVS para a família prmt de proteínas, a mesma abordagem pode ser aplicada a qualquer outra família de proteínas.
The authors have nothing to disclose.
Os autores desejam agradecer a Dalia Barsyte-Lovejoy por ter tomado tempo para fornecer feedback valioso e comentários críticos sobre o manuscrito e todos os nossos colegas do SGC que trabalharam com a família de proteínas PRMT expressa do Sistema de Vetores de Expressão baculovírus.
O SGC é uma instituição de caridade registrada (número 1097737) que recebe fundos da AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada através do Ontario Genomics Institute [OGI-196], a UE e a EFPIA através da Iniciativa de Medicamentos Inovadores 2 Joint Undertaking [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (também conhecido como EMD no Canadá e nos EUA), Pfizer, Takeda e wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].
2.8L Nalgene Fernbach Culture Flask, Polycarbonate, | Nalgene | 29171-854 | For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells |
24-Well Blocks RB | Qiagen | 19583 | For incubation of 4ml of suspension Sf9 cells for protein expression screening |
4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul | Biorad | 5671095 | For SDS-PAGe analysis of the purified proteins |
50ml Reagent Reservoir | Celltreat Scientific Products | 229290 | Reservoir used for diluted transfection reagent and Sf9 cells suspension |
96-well cap mat, for use with square well, 2 mL | Greiner Bio-One | 381080 | Used to cover 96 well block |
96 well PCR plate | Eppendorf | 30129300 | |
Bacto agar | BD | 214010 | For LB-agar selection paltes |
Airpore Tape Sheets | Qiagen | 19571 | To cover 24 well blocks for protein expression screening |
Allega X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
Antibiotic Antimycotic (100x) | Gibco | 15240112 | |
Bacmid DNA | in-house | non-catalog item | Bacmid DNA for baculovirus production |
Bluo-Gal, 1g | Thermo Fisher | 15519028 | |
Beckman JLA 8.1000 | |||
Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile | Eppendorf | 30722116 | Tissue culture treated plate |
Cell Resuspension Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCRS500 | For Bacmid DNA extraction |
Cell Lysis Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCLS500 | For Bacmid DNA extraction |
CELLSTAR Tissue Culture Plates, 96 well | Greiner Bio-One | 655180 | For transfection mix |
ClipTip 1250, filter reload, sterile | ThermoFisher Scientific | 94420818 | Tips for programmable and adjustable multichannel pipette |
dNTP Mix (25 mM each) | Thermo Fisher Scientific | R1121 | |
E1-ClipTip Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672090BT | Programmable and adjustable multichannel pipette |
E4 XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL | Ranin | LTS EA6-300XLS | Ranin adjustable multichannel pipette |
Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane | Agilent | 201005-100 | For protein purification in expression screening |
Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L | IBI Scientific | SS-6003C | For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells |
Gentamicin 10x10ml | BioShop | 15750078 | |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Wisent Biocenter | 080-450 | |
I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L | Wisent Biocenter | 301-045-LL | Serum free insect cells growth medium |
InstantBlue, Ultrafast Protein Stain | Expedeon Protein Solutions | ISB1L-1L | For protein gel (SDS-PAGE) staining |
Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5% | BioShop | IPT001.100 | |
JetPRIME Transfection Reagent Provided with jetPRIME buffer | POLYPLUS TRANSFECTION Inc | 114-01 | For Sf9 cells transfection to generate baculovirus |
Kanamycin Monosulfate | BioShop | KAN201.100 | |
Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro& | Sigma | L3022-1KG | |
Masterblock 96 deep well 2.4mL | Greiner Bio-One | 780285-FD | Used in the transformation and expression screening procedures |
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml | Thermo Fisher | 10361012 | Competent cells for bacmid DNA generation |
mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 – 300 uL | Sartorius | Sartorius 725240 | 12 channel pipette |
Neutralization Solution, 0.5 L | Millipore Sigma | LSKNS0500 | For bacmid DNA extraction |
New Brunswick Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in) | Eppendorf | M1282-0004 | Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells |
Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30250 | For protein purification |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | LS15140122 | |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 500ml | Pyrex | 4444-500 | For suspension culture of Sf9 cells |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 125ml | Pyrex | 4444-125 | For suspension culture of Sf9 cells |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 250ml | Pyrex | 4444-250 | For suspension culture of Sf9 cells |
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | Froggabio | 21141 | |
RNase A, 0.9 mL | Millipore Sigma | LSKPMRN30 | For suspension buffer for bacmid DNA extraction |
Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads | MP Biomedicals | 115000550 | For spread of bacterial cells across the surface of an agar plate. |
RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips) | Ranin | 30389253 | Tips for ranin multichannel pipette |
S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian | cytivalifesciences | SH3039602 | Addition to the serum free medim for the transfected cells |
Sf9 cells | Thermo Fisher | 12659017 | Insect cells |
Sfx-Insect Cell Culture Media | Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences) | SH3027802 | Serum free insect cells growth medium |
Tape Pad | Qiagen | 19570 | Tape Pad |
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer – 2,000 units | New England Biolabs | M0267L | |
Tetracycline Hcl | BioShop | TET701.10 | |
Trypan Blue 0.4% Solution | Gibco | 15250061 | For assessment of cell viability |
VITLAB Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L | VITLAB | V100889 | For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells |
VWR Digital Mini Incubator | VWR | 10055-006 | Incubator for adherent Sf9 cells |
VWR Incubating Microplate Shaker | VWR | 97043-606 | Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks |
VWR Petri Dishes | VWR | CA73370-037 | |
X-tremeGene 9 DNA Transfection Reagent 1.0 M | Roche | 6365787001 | For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus |