バキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の生産

注: BEVS プロトコルの手順の概要は、 図 1に示します。 1. 組換えバクミドDNAの生成 DH10Bac変換用LB寒天選択プレートの調製 50 μg/mL カナマイシン、7 μg/mL ゲンタマイシン、10 μg/mL テトラサイクリン、200 μg/mL ブルオガル、40 μg/mL IPTG を含む LB寒天プレートを用意し、DH10 変換用に選択します。 プレミックスLBスープ25gとバクト寒天13gを秤量し、2Lフラスコに入れる。121°Cで15〜30分間、蒸留水とオートクレーブで1 Lにボリュームを持参してください。 水浴を50°Cに設定し、オートクレーブした寒天溶液を水浴中で40〜60分間冷却し、50〜55°Cまで冷却します。 冷却溶液には、ゲンタマイシンを7μg/mLの最終濃度に、カナマイシンを最終濃度50μg/mLに、テトラサイクリンを最終濃度10μg/mL、ブルーギャルを最終濃度200μg/mL、最終濃度40μg/mLに加えます。 50 mL ピペットを用いて、培地の 7~10 mL の混合物とアリコートを各 60 mm プレートに混合します。プレートを室温(2時間)に座らせて硬化させます。4°Cで反転、ラップ、保管します。 抗生物質を含むプレートは、最大4週間安定です。 プラスミドのDH10Bac大腸菌のコンピテントセルへの変換 有能な細胞の必要な量を計算します。 氷の上の有能な細胞を解凍し、穏やかにスピンダウンし、穏やかなタップで再中断します。 12チャンネルのピペットを使用して、4μLの細胞を96ウェルPCRプレートの各ウェルに分配します。 ~ 0.3~0.5 μgの組換えプラスミドDNAを有能力細胞に加え、タップして軽く混ぜます。氷の上で10〜15分間インキュベートします。 PCRマシンで45°Cの熱衝撃を与えます。氷の上で2分間冷やします。 96ウェルブロック(96-深井戸2.4mL)の各ウェルにSOC培地の0.5 mLを分配します。 12チャンネルのピペットを使用して、変換された細菌懸濁液をブロックの対応するウェルに移し、エアポアシートで覆います。 ブロックを37°Cの揺れインキュベーターに入れ、4〜5時間中撹拌(205rpm)します。 無菌ガラスビーズを用いてLB寒天板の表面に培養液の30〜50μLを均等に広げる。残りの文化は4°Cで保存してください。 青/白のコロニーの色が識別可能になるまで37°Cでプレートをインキュベートします(40-48時間)。十分な白、大きなコロニーがプレート上に得られる場合は培養を捨てる。 白いコロニーが組み換えバクミドDNAのみを含むようにするために、抗生物質、bluo-gal、およびIPTGを含む新鮮なLB寒天プレートに1つの孤立した白いコロニーを再ストリークし、表現型を検証する。 37°Cで48時間インキュベートする。 組換えバクミドDNAの抽出のための再縞プレートから1つの検証された白いコロニーを選んでください。 組換えバクミドDNAの分離 単一の孤立した白いコロニーを50 μg/mLカナマイシン、7 μg/mLゲンタマイシン、10 μg/mLテトラサイクリンを24ウェルブロック(24ウェルブロックラウンドボトム)で補充したLB培地3mLに接種し、エアポアシートで覆います。 250 rpmで振ると一晩で37°Cで成長します。 24ウェルブロックを2,100 x g で10分間遠心します。上清をデカントし、ブロックを反転し、吸収性のティッシュペーパーを軽くタップします。250 μLの溶液1(細胞リサスペンション溶液)を各ウェルに加えます。 テープパッドまたは他のシールフィルムでブロックを密封し、5〜10分間75 rpmの揺れプラットフォームに置きます。適切な細胞のリシスを確認するために各ウェルを確認し、必要に応じて、1 mLの先端を使用して再中断します。 各ウェルに250 μLの溶液(細胞溶解液)を加え、ブロックを密封し、75 rpmで30sの揺れプラットフォームに置きます(サンプルの交差汚染を避けるために、24ウェルブロックを反転させない)4分間室温でインキュベートします。 250 μLの溶液3(中和液)を加え、ブロックを密封し、30 sの75 rpmで揺れプラットフォームに置きます。タンパク質と 大腸菌 ゲノムDNAの厚い白色沈殿物が形成されます。サンプルを氷の上に10〜15分間置きます。 4°Cで2,100xgで60分間の遠心分離機を白色沈殿物にしっかりとペレットする。遠心分離の間、新しいマイクロ遠心管にラベルを付け、絶対イソプロパノールの0.8 mLを加えます。 上清をイソプロパノールを含むチューブに静かに移し、白色の沈殿物を避けます。チューブを数回そっと反転して混ぜ、氷の上に5〜10分間置きます。この段階では、サンプルは一晩−20°Cで保存することができる。 サンプルを15分間、4°Cで14,000 x g で遠心分離します。 上清を取り除き、各チューブに70%エタノールの0.5 mLを加えます。チューブを数回反転させてペレットを洗浄します。室温で14,000 x g で5分間の遠心分離機。(オプション:繰り返し洗浄) プラスミド調製の無菌性を確保し、できるだけ多くの上清を取り除くために、ラミナーフローフードの内側にサンプルを持参してください。注:ペレットはチューブの底部から外れる可能性があるため、上清を捨てる際にはペレットを注意深く見てください。 薄層流フード内のペレットを15~20分間エアドライし、50μLのろ過溶出バッファー、10 mM Tris-Cl、pH 8.5(ペレットが過剰乾燥していないことを確認してください) 組換えバクミドDNAは135kbを超える大きさであるため、DNAの剪断を避けるために、ペレットを緩やかなタッピングで溶解する。 バクミドDNAに関心のある遺伝子の存在を確認するために、PCR反応ミックスを96ウェルPCRプレートにセットします。 PCR ミックスを次のように準備します: バッファー 1 μL、0.2 μL (各 10 mM) の dNTP、0.1 μL の Taq DNA ポリメラーゼ、0.1 μL (25 μM) のフォワードおよびリバースプライマー (BACV2FWD: tattccggatataccg;BACV2REV:ctctacaatgtggatc)、バクミドDNA1 μL、水8μL。 95°Cで2分間の初期変性を有する標的遺伝子の増幅を行い、続いて94°Cの25サイクルを30s、30sで55°C、1分/kbの72°Cを行います。 72°Cで7分間の最終延長後に反応を終了する。 増幅産物の10μLを、電気泳動による核酸染色液を含むアガロースゲル1%(w/v)で分析します。 検証済みのバクミド・ドナを4°Cに保存します。 2. 組換えバキュロウイルス株の生成 注:バキュロウイルス生成、バキュロウイルスの容積増幅、タンパク質発現スクリーニング、タンパク質産生のための細胞トランスフェクションを含む、バキュロウイルス発現プロトコルの任意のステップに対して95%以上の生存率を持つ指数関数的に成長するSf9細胞を使用してください。 ジェットプライムやX-tremeGENE 9などのバクミドDNAおよびトランスフェクション試薬(T.R.)を用いたSf9細胞のトランスフェクション。注:トリパンブルー染色と血球計を使用して、生存細胞数と%細胞生存率を決定することができます。生存不可能な細胞は染色を取り込み、顕微鏡下で青色に見えますが、生存細胞は染色されていないままです。細胞生存率 %を計算するために、総細胞数が得られ(染色されず、染色)、生存セル数を総細胞数で割り、100倍になります。 指数関数的に成長するSf9細胞を、血清フリー昆虫培地中の4 x 105 細胞/mLの最終的な細胞密度に希釈し、滅菌試薬貯留槽に注ぎます。 プログラム可能なマルチチャンネルピペットを使用して、希釈されたSf9細胞の0.5mLを24ウェルプレートの各ウェルに播種します。 プレートの1つの井戸をコントロール(未感染)としてラベル付けし、トランスフェクトされた細胞と非トランスフェクトされた細胞を比較して感染の潜在的な兆候を評価するコントロールとして使用します。 プレートに細胞を播種した後、プレートを数回ゆっくりと前後に揺らし、細胞の単層を均等にします。細胞がウェルの中心に集落するので、プレートを旋回しないでください。 培養プレートへの細胞付着を可能にするために、27°Cでプレートを少なくとも1時間インキュベートする。 トランスフェクション試薬バイアルをよく混ぜます。トランスフェクションごとに、トランスフェクション試薬の2 μLをトランスフェクションバッファーの100 μLに加えます。他の任意の非補充昆虫培地も使用することができます。希釈したトランスフェクション試薬を滅菌試薬リザーバーに堆積させ、10 sのために穏やかに混合する。 12チャネルピペットを使用して、希釈トランスフェクション試薬の102 μLを滅菌96マイクロウェルプレートに移します。 組み換えバクミドDNAの0.2 μg/μL溶液を96ウェルマイクロウェルプレートの対応するウェルに10 μL移動し、プレートを側面から穏やかに振る(タッピング)して混ぜます。 トランスフェクション混合物を15〜20分間インキュベートし、複雑な形成を可能にします。 96~24ウェルプレート間の移動用に設計された調整可能な6チャンネルピペットを使用して、トランスフェクションミックスを細胞に滴下してトランスフェクションプレートの対応するウェルに追加し、27°Cで4〜5時間インキュベートします。 インキュベーション時間中にプレートを数回ゆっくりと前後に揺らし、細胞単層上のトランスフェクション混合物の均等な分布を確保します。 トランスフェクション後4〜5時間、1.5mLの無血清培地を加え、10%(v/v)の加熱不活化ウシ胎児血清と抗生物質抗ミコティックの最終量(ペニシリン100単位/mL、ストレプトマイシン100μg/mL、および0.25m)を添加した。 27°Cインキュベーターで細胞を72〜96時間インキュベーターでインキュベートする。可能な場合は、トランスフェクションプレートを1日1回軽く揺らします。 トランスフェクション後72-96時間のトランスフェクト細胞に明らかな感染の兆候(SOI)を探す(図2)。トランスフェクトされた細胞はウイルスの産生を開始し、さらに培養物に感染することを覚えておいてください。したがって、感染の兆候を探してください。注:感染の兆候は、昆虫細胞の構造変化であり、例えば、細胞径の25〜50%の増加、拡大細胞核、均一に丸みを帯びた形状、培養皿表面への増殖および付着の喪失、ならびに細胞生存率の低下である(図2.バキュロウイルス感染および感染していないSf9細胞)。 3. 小規模タンパク質発現スクリーニングとウイルス増幅 P1バキュロウイルス株によるSf9細胞の感染。注:トランスフェクションの4〜5日後、逆顕微鏡下でのコントロール(未感染)細胞と比較すると、感染の兆候がトランスフェクション細胞で明らかであるべきです。細胞培養培地に分泌される最初の組換えバキュロウイルスは、収集する準備ができているべきである。 種子2 x 105 は、P1ウイルスに感染してウイルス量を増幅するため、24ウェルプレートの各ウェルに無血清昆虫培地中のSf9細胞を指数関数的に増殖させ、ウイルス量を増幅する(P2ウイルスの生成をもたらす)。 細胞をプレートにピペット化した後、プレートを穏やかに揺らし、前後の動きを使用して均一な単層を確保します。細胞がウェルの中心に集落するので、プレートを旋回しないでください。 プレートに細胞の付着を可能にするために、27°Cでプレートを少なくとも1時間インキュベートします。 4 mLのSf9細胞を、24ウェルブロックの各ウェルに昆虫無血清培地で3.5-4 x 106 の濃度で分配し、タンパク質発現スクリーニングのためにP1ウイルスに感染します。注:SOIを探すときに感染した細胞と感染していない細胞を比較するための未感染制御として、24ウェルプレートと24ウェルブロックの1つのウェルにラベルを付けます。 プログラム可能な電子マルチチャネルを使用して、P1ウイルスの同時収集(ステップ2.1.13)、播種したばかりのSf9細胞の感染(ステップ3.1.1)、およびP1ウイルスの150 μLを有する24ウェルブロック(ステップ3.1.4)の懸濁液細胞の感染を可能にする。 収集したP1ウイルスストックの残りの部分を17,970 x gで15分間スピンダウンし、マイクロ遠心チューブに移し、4°Cで暗闇の中に保管します。 24ウェルプレート(ステップ3.1.1)を往復シェーカーにそっと揺らし、細胞単層上に追加されたP1ウイルスの均等な分布を確保します。インキュベーション時間中にこれを数回繰り返します。 感染したSf9細胞の懸濁液培養液(ステップ3.1.4)で24ウェルブロックをエアポアシートで覆います。 24ウェルブロックを27°Cでインキュベートし、245rpmで72-96時間振ります。 P2ウイルス(ステップ3.1.1)を有する24ウェルプレート(ステップ3.1.1)および24ウェルブロック(ステップ3.1.4)で感染後72-96時間以内にSOIを探して、発現スクリーニングのために感染細胞を用いる。注:P1ウイルスによるSf9細胞の感染から4~5日後、SOIは、逆顕微鏡下で非感染した対照細胞と比較した場合、感染細胞に明らかであるべきです。 P2ウイルスを24ウェルプレートから収集し、遠心分離機を15分間17,970xgで15分間収集し、マイクロ遠心チューブに移し、4°Cで暗闇の中に保管してください。 72-96 hポスト感染時に、70%エタノールで24ウェルブロックの上にスプレーし、層流フードに持ち込み、トリパンブルー染色によっていくつかのウェルの細胞密度と生存率をチェックする。 細胞に感染の兆候があり、生存率が70-75%に近い場合は、トリパンブルー染色で評価されたタンパク質精製に進みます。 ペレット細胞は、24ウェルブロックを4°Cで525xgで15分間遠心して行った。 上清を捨て、25 mM Tris pH 8.0を含む1mLのリシスバッファーにペレットを完全に再中断し、 300 mM NaCl, 0.6 % NP-40, 2 mM イミダゾール, 5% グリセロール (v/v) および 1x プロテアーゼ阻害剤カクテル (100x プロテアーゼ阻害剤カクテルはアプロチニン 0.25 mg/mL, ロイペプチン 0.25 mg/mL, ペプスタチン A 0.25 mg/25 mg/mL;E-64 0.25 mg/mL)。 その後の試験精製のために、細胞懸濁液を-80°Cに保存してください(3.2.2参照)。 凍結細胞懸濁液からのタンパク質精製を24ウェル試験発現ブロックで行う。 バインド ブロックのアセンブリ (図 3) 96深層ウェルブロック(96-深井戸2.4mL)の上部にパラフィルムの重なり合う3層を配置します。 96ウェルフィルタープレート(フィルターマイクロプレート、96ウェル、25 μm超高分子量ポリエチレン膜付きポリプロピレン)を96深層ウェルブロックの上部に配置します。 フィルタープレートを押し下げて、先端をパラフィルムに固定し、96ウェル深いブロックからフィルタープレートを密封します。 50 μLの事前平衡化された 50% Ni-NTA 樹脂スラリーをフィルタープレートの各ウェルに移します。 テスト式の手順 冷凍セル懸濁液(ステップ3.1.15)を24ウェルブロックに入れ、RTのウォーターバスに5〜10分間置き、450rpmで20分間振ります。 24ウェルブロックを3,275 x g で15分間遠心します。 マルチチャンネルピペットを使用して、クリアしたライセートを50μLの事前平衡化された50%Ni-NTA樹脂スラリー(ステップ3.2.1.4)を含むフィルタープレートに移し、96ウェルキャップマット(96ウェルキャップマット、正方形ウェル、2 mLで使用)でフィルタープレートを密封します。注:インキュベーションと遠心段階でバインドブロックを一緒に保つために、いくつかのゴムバンドを使用してください。 安全な結合ブロックを冷たい部屋の回転器に45-60分間置き、クリアしたライセートをNi-NTA樹脂でインキュベートします。 インキュベーション後、フィルタープレートを慎重に持ち上げ、96深ウェルブロックの表面からパラフィルム層を取り除きます(ステップ3.2.1.1)。 96深いウェルブロックの上にフィルタープレートを戻し、235 x gで2分間、固定されたバインドブロックをスピンダウンします。 洗浄結合Ni-NTA樹脂2x 2mLの洗浄バッファーは25 mM Tris pH 8.0、300 mM NaCl、5%グリセロール、および15 mMイミダゾールを含む洗浄バッファー。 235 x g で毎回5分間洗浄バッファーでブロックをスピンダウンして、残留液を完全に除去します。 4x負荷染料の10 μLを含む96ウェルPCRプレートの上部にフィルタープレートを移します。 40 μL の溶出バッファー (25 mM トリス pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% グリセロール、 500 mM イミダゾール) をフィルタープレートの各ウェルに加え、5 分間インキュベートします。 ブロックをスピンダウンして、タンパク質を96ウェルPCRプレートに10分間235 x g で溶出させます。 96ウェルPCRプレートを高温に耐えるタップパッドでシールし、98°Cで3分間加熱します。 溶出したタンパク質サンプルを、タンパク質ラダーの横にある4-20%SDS-PAGEゲルの標準Laemmliバッファーに15μLロードし、SDSを含む標準ランニングバッファでゲルを実行します。 クーマシーブルーでゲルを染色し、水で汚れを取り出します。テスト式の結果を分析し、大規模生産に最適な発現構造を特定します。 4. タンパク質産生のためのバキュロウイルス感染昆虫細胞(SCBIIC)の調製 予定生産時間の4日前に、指数関数的に成長するSf9細胞を2 x 106 細胞/mLの最終細胞密度に分割し、125 mL / 250 mL / 500 mLエルレンマイヤーガラスシェイクフラスコを50 mL / 100 mL / 200 mLの昆虫血清フリー培地1%(v/v)を含む 0.150 mL /0.300 mL /0.6 mLの適切なP2ウイルスを加え、1インチのストロークで軌道シェーカー上で165rpmで感染細胞をインキュベートし、25°Cの低温で細胞分裂を遅くする。 感染後4日間で、細胞を顕微鏡下でSOIをチェックし、トリパンブルー染色で検証された細胞生存率が70〜75%に近い場合は産生に進む。 5. 大規模タンパク質製造のためのSf9細胞製剤 予定生産時間の4日前に、大規模タンパク質生産に必要なSf9細胞の量を計算する。 昆虫血清フリー培地中のSf9細胞の種子2Lを、2.8 Lフェルンバッハシェイクフラスコで1 x 106 細胞/mLの細胞密度にする。 27°Cでインキュベートフラスコを150rpmに設定した振れを使用。注:Sf9細胞培養で細菌汚染を防止するには、ゲンタマイシンを10 μg/mL、またはペニシリン/ストレプトマイシンをそれぞれ50 U/mLおよび50 μg/mLに最終濃度にします。 6. 大規模タンパク質生産のためのSCBIISによるSf9細胞の感染 2.5 L タネアシェイクフラスコまたは 5 L 試薬ボトルで 4 x 106 細胞/mL の最終的な細胞密度に昆虫血清フリー培地で指数関数的に成長する Sf9 細胞の 2 L または 4 L を分割します。 バキュロウイルス感染昆虫細胞(SCBIIC)懸濁液培養液の10-12 mL/Lを加える。 Sf9細胞の感染培養物をシェーカー上で、25°Cの低温で145rpm(細胞分裂を遅くする)で72〜96時間培養します。 72時間の感染後、顕微鏡下で細胞を検査し、細胞の生存率を評価する。 通常、約72時間後感染後、Sf9細胞の生存率は70%-75%に低下する(トリパンブルー染色を用いて測定)。1 Lポリプロピレンボトルに感染したSf9細胞を、4°Cで15分間900xgで遠心分離して収穫する。 1Lの産生細胞培養液から採取した細胞ペレットを、緩やかに旋回して1xPBSの20〜25mLで再懸濁し、50mL円錐形チューブに移します。 細胞懸濁液を900 x g で15分間回転させ、PBS溶液を捨てます。 洗浄した細胞ペレットを、20-25 mLの懸濁液バッファー(20 mM Tris-HCl pH 8.0,500 mM NaCl,5%グリセロール、1xプロテアーゼ阻害剤カクテル)と液体窒素中のフラッシュフリーズで再懸濁する。精製まで-80°Cで保管してください。注: PRMT の精製手順については、SGC の論文6に詳しく説明されています。