流式细胞术分析人髓系U937细胞中SAMHD1限制性

该协议不包含任何作者进行的涉及动物或人类参与者的研究。该协议的所有步骤均按照执行它们的机构的准则和业务守则执行。 1. 转染 293T 细胞用于 VLP 生产（SAMHD1 表达载体和测试仪 HIV 颗粒） 注意：成功生产病毒颗粒的最重要因素是生产者293T细胞的健康，转染时的汇合度和收获时间。实验室通常会有他们首选的转染试剂和逆转录病毒颗粒生产的方案。以下方案产生高质量的传染性颗粒，但等效的方案也适用于此应用。为了保持良好的质量293T细胞，每周至少传代三次以保持恒定的生长速度。应在生长的对数期接种细胞，以实现高效转染。 第 1 天：接种所需数量的 10 cm 培养皿，从接近汇合的 293T 细胞培养皿中分离 1/4，以在第二天产生约 60% 的汇合度（约 5 x 105 个细胞/mL）。在使用新细胞原液时，可能需要接种几种密度，以达到适当的密度，以便在第二天进行转染。 第 2 天（早晨）：通过显微镜检查约 60% 的汇合度，并用 10 mL 新鲜的 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 轻轻替换细胞上的培养基。 第 2 天（下午，更换培养基后至少 4 小时）：转染用于 VLP 生产。在 600 μL 无血清 DMEM 中补足含有 3 μg gag-pol 表达质粒、长末端重复 （LTR） 驱动的报告质粒和水疱性口炎病毒 G 蛋白 （VSV-G） 表达质粒（总计 9 μg，参见注释）的 DNA 稀释混合物。涡旋并短暂离心（15秒，>500 x g ）。 加入20μL转染试剂（参见 材料表），涡旋（不要离心）并在20°C孵育15-20分钟。将转染混合物滴加到平板中，轻轻旋转混合，然后返回培养箱。注意：对于表达SAMHD1的MLV VLP，请使用KB45，6 （gag-pol 表达质粒），pLGatewaySAMHD1IeYFP1 （LTR驱动的报告质粒）和pczVSV-G7。对于 HIV-RFP VLP，使用 p8.918，9 （gag-pol 表达质粒）、SCRPSY10 （LTR 驱动的报告质粒）和 pczVSV-G。 替代品在材料表中讨论。可能需要针对不同的质粒/转染系统优化质粒比例。 第 3 天（上午晚些时候）：通过移液小心地从细胞中取出培养基，用 5 mL 新鲜 DMEM 洗涤，并用 5 mL 新鲜 DMEM 替换。 第4天（早晨）：通过从细胞中收集上清液来收获病毒，并用5mL新鲜DMEM替换。将含VLP的上清液通过0.45nm过滤器，等分试样并转移到-70°C储存。确保等分试样的大小适合计划的实验（建议为 250 μL），因为重复冻融循环会导致病毒滴度损失。 第5天（早晨）：像1.5一样收获病毒，但在收集上清液后丢弃平板。 2. 使用前滴定新的 VLP 第 1 天：在 24 孔板的每孔 2 x 105 个细胞下接种 293T – 每个要滴定的病毒 4 个孔，包括每个骨架具有已知感染性的病毒。优化给定细胞原液的接种密度。 第 2 天：观察板以检查汇合度（理想情况下~70%）。解冻步骤1.5和1.6中的含病毒上清液。向每个孔中加入 0、10、25 或 100 μL。 第4天（上午）：收获细胞通过流式细胞术进行分析。通过小心移液或抽吸取出培养基。用 250 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 轻轻洗涤细胞。用 250 μL PBS 上下移液，从板中取出细胞，然后转移到微量离心管中。加入 250 μL 4% 多聚甲醛（使终浓度为 2%）。注意：多聚甲醛有毒。不应与氯基消毒剂混合。 通过以 500 x g 离心 5 分钟来沉淀细胞，弃去上清液并将细胞沉淀重悬于 200 μL PBS 或替代流式细胞术缓冲液中。通过流式细胞术酌情分析RFP或YFP。根据已知传染性储备的值规范化给定病毒储备的感染性。注意：VLP 也可以通过 p24 酶联免疫吸附测定 （ELISA） 进行标准化;然而，这不一定是VLP感染性的良好指标，特别是在不同转染中制备VLP储液的情况下。已公布的中位组织培养感染剂量或感染多重性 （TCID50/MOI） 方法11 也可以提供相对定量，尽管这些方法尚未很好地确定 MLV。相对荧光为商业逆转录酶ELISA方法提供了一种经济高效的替代方案。 3. U937与表达SAMHD1和YFP的VLP的转导 注意：步骤3-6构成限制性实验。为了便于计划，日期已编号。 第1天（下午）：解冻VLP进行转导，包括MLV-野生型SAMHD1-YFP（阳性对照），MLV-SAMHD1（HD206-7AA）-YFP（阴性对照）和变体MLV-SAMHD1-YFP（实验样品）。在微量离心管中用罗斯威尔公园纪念研究所 1640 培养基 （RPMI） 将标准化的 VLP 稀释至 500 μL 的最终体积，加入 0.5 μL 聚溴乙烯 （10 mg/mL），然后轻弹混合。如果无法事先滴定VLP，则首先使用100 μL。使用 VLP 与 RPMI 的最大 1：1 比率来限制 VLP 诱导的毒性。目标是大约 30% 的转导率。 将5 x 105 U937细胞等分到无菌微量离心管中，用于每种转导条件。通过以500× g 离心5分钟沉淀，并除去上清液（包括两个额外的管作为流式细胞术的未转导对照）。将细胞沉淀重悬于 500 μL 稀释的 VLP（或未转导对照的 RPMI）中，并转移到 24 孔板的一个孔中。 在台式离心机中以800× g 在20°C下旋转90分钟。 向孔中加入1mL的37°C RPMI，并在37°C培养箱中回收3天。 4. 转导U937的分化 第 4 天（早晨）：轻轻移液重新悬浮细胞，并将 350 μL 转移到 12 孔板的 4 个孔中的每一个中。向每个孔中加入 700 μL 含有 150 nM PMA 的 37 °C RPMI，最终浓度为 100 nM，并允许分化 3 天。注意：PMA以粉末形式购买，应在DMSO中重悬至1 mM并储存在黑暗中。应通过用DMSO从1mM储备液中稀释1/10来制备100μM的工作储备液。 5.分化，表达SAMHD1的U937感染HIV-RFP 第7天：通过显微镜观察细胞。确保细胞贴壁。从所有孔中吸出培养基，向每组 4 个孔中的 1 个孔中加入 1 mL RPMI，允许未转导、未感染的对照以及单色对照。将含有大约 10 μL HIV-1-RFP（大约 10 ng p24 作为指南）的 0.5 mL RPMI 重新添加到所有其他孔中。目标是大约 50% 的感染。 第 8 天（早晨）：向每个感染孔中加入 0.5 mL RPMI。 6. 流式细胞术分析 注意：最好在流式细胞术管道中使用活死染色剂。但是，如果U937细胞质量良好，则可以省略此步骤，而不会对下游分析产生负面影响。对胰蛋白酶消化的细胞进行轻柔移液应容易产生单细胞悬液。 第10天（早上）：从孔中吸出培养基并用PBS洗涤一次。加入 300 μL 细胞解离酶（或胰蛋白酶）5-10 分钟。再加入 300 μL PBS，彻底重悬以确保所有细胞都已从平板上脱落，然后转移到流式细胞术管中。 加入 300 μL 4% 多聚甲醛（使终浓度达到 2%）。通过以 500 x g 离心 5 分钟来沉淀细胞，弃去上清液并将细胞沉淀重悬于 200 μL PBS 或替代流式细胞术缓冲液中。通过流式细胞术分析。注意：以下步骤适用于Fortessa分析仪，但可以使用任何能够读取RFP和YFP荧光的分析仪进行等效分析。在设置任何流式细胞术分析之前，请咨询当地流式细胞术支持或其他经验丰富的研究人员。当需要同时筛选多个样品时，高通量采样器可能是合适的。在这种情况下，建议使用更大的细胞数量和体积。 7. 流式细胞术分析 在需要前10分钟打开细胞仪并打开计算机。检查废物是否为空，护套罐是否已满。 登录机器并打开分析软件。 将手臂移到一边，取下水管，将流速设置为 高 ，然后按 Prime。等待灯熄灭，再重复三次。 重新打开水并在高处运行 3 分钟，然后切换到 低 并按 待机 ，直到继续采集。 同时在软件中设置实验：选择 “实验/新建实验 ”（根据本地指南命名）。在检查器中，删除不需要的荧光染料，保留蓝色激光 530/30 和黄色激光 610/20 或机器推荐的 YFP 和 RFP 激光和滤光片组合。 右键单击实验并选择 细胞仪设置/应用程序设置/创建工作表。在工作表上，通过单击相应的图标并通过单击轴标签更改轴来更改轴，创建前向散射区域 （FSC-A）/侧散射区域 （FSC-A） 点印迹和 YFP 直方图、RFP 直方图和 GFP/YFP 点印迹。 再次右键单击 实验 并添加新 标本。根据需要重命名。通过单击加号打开标本以显示新管。 从 View 打开采集仪表板，加载未感染、未转导的控件，然后按 采集。调整仪表板中的 FSC 和 SSC 电压，以将单元格定位在左下象限（轴上没有单元格）。此种群 P1 周围的门。右键单击其他图并选择显示 P1 以从后续分析中去除碎片。 加载 YFP（仅限野生型 SAMHD1）的单色对照并采集。在仪表板中调整YFP电压，使大多数荧光细胞都在检测器的范围内（不在轴的边缘）。对单色 RFP 控件重复此操作。 使用未转导、未感染和单色对照运行自动补偿。从菜单中选择“ 实验>补偿设置”>“创建补偿控件 ”以切换到普通工作表。选择未染色的普通工作表，按“ 运行” 并获取未染色的对照。 在完整单元格（P1）周围画一个门并记录。取下管子并将机器置于 待机状态。右键单击 P1，单击 应用于所有补偿控件。 切换到 RFP 普通工作表，然后按 运行。记录单色 RFP 控件，并将机器置于 待机状态。 软件应自动选择阳性总体。 对 YFP 单色控制重复此操作。选择 实验>补偿设置>计算补偿>链接并保存。 切换到全局工作表。获取用野生型SAMHD1转导的细胞，感染HIV-RFP，并检查在象限的角落中可以看到四个不同的群体，这些群体分别垂直和水平排列YFP和RFP。取下管子并按 待机。 重新加载未转导、未感染的样本，按 运行 并 记录 30，000 个事件，P1 作为停止门。对其余样本（包括其他对照）重复此操作。在运行时或 事后重命名示例。导出后，无法重命名文件。 将数据导出为 .fcs 文件，并根据当地说明清洁流体。 8. 数据分析 注意：以下步骤对应于 FlowJo v10 中的分析;但是，可以在其他分析软件中轻松执行等效步骤。 打开软件并将所有 .fcs 文件拖到仪表板中。选择补偿控件并将其拖到补偿子文件夹中。双击打开未转导、未感染管的文件，这将调出 FSC-A/SSC-A 图。 选择面工具并在完整像元群上浇口，排除左下角的碎片。命名此单元格。将此门拖动到 “所有样本” 栏中的整个管群上。使用水平箭头按钮滚动浏览每个单独的样品，以确保门控适用于每个试管。 双击未转导、未感染样品的 细胞 群，并将轴调整为 FSC 高度 （H） 与 FSC 面积 （A）。使用矩形门选择单个大种群以排除双峰。该软件将自动建议命名此单个单元格。 将此门拖到所有 细胞 群上，然后再次检查门控是否适用于所有样品。为未感染、未转导的样品选择 单细胞 群，将轴更改为补偿蓝色激光（y ，YFP）与补偿黄色激光（x， RFP）。按轴上的 T 并为 x 和 y 选择 双指数 刻度。 选择象限设门工具，然后单击阴性细胞群的右上角极值。通过拖动到“所有样本”栏中，将此初步门控应用于所有单细胞群体。如果象限门不能令人满意地分离种群，则可能需要使用面工具对各个象限进行门控，如图 2 所示。 滚动到仅野生型SAMHD1样本（仅限YFP），并检查未转化（YFP阴性）和YFP阳性之间的门控是否正确。切换到轮廓视图以区分阴性和昏暗的YFP细胞可能会有所帮助。如果最上层的 YFP +ve 细胞分布广泛，请将上部垂直门调整到右侧。 滚动浏览所有样本并检查有关 YFP 阳性的门控。使用对所有样本都有效的YFP阴性和阳性之间的最佳划分。注意：补偿将根据野生型SAMHD1 YFP表达水平计算。如果不同SAMHD1-YFP转导细胞之间的感染水平差异很大，则可能需要调整补偿。因此，优选在使用前对YFP VLP进行标准化。 滚动到未转导的HIV-RFP感染管，并检查未感染的RFP阴性和受感染的RFP阳性之间的门控是否正确。根据需要使用轮廓视图进行适当调整，并滚动浏览其余样品以检查门控是否对所有样品有效。 每个样本都需要双阴性（Q4：左下角，未转导，未感染），YFP阳性（Q1：左上角，SAMHD1表达，未感染），RFP阳性（Q3：右下，未转导，HIV感染）和双阳性（Q2：右上，SAMHD1表达HIV感染）。通过单击图标打开表格编辑器，然后将四个象限门拖到仪表板中。选择“ Excel 导出 ”，然后单击“ 创建表”。根据本地文件命名约定保存生成的电子表格。 要导出绘图和门控策略的表示，请单击 布局编辑器 图标。选择每个人口，然后拖动到编辑器中，其中包含所需的轴、标签和间距。 要创建具有所有样品显示的相同图的布局，请选择一列并按 Batch。按 “缩放到宽度” ，然后 避免使用分页符。以所需的文件格式保存。 在导出的电子表格中，通过生成 YFP-ves 的百分比 RFP （RFP+ve / （双负 + RFP+ve）） 和 YFP+ves 的百分比 RFP （双正 / （双正 + YFP+ve））和最后一列（YFP+ve 的 %RFP / YFP-ve 的 %RFP）来计算限制比率，请参见 图 1。使用适当的数据分析软件平均每个SAMHD1构建体的重复数据，并计算测试SAMHD1变体的限制值是否与野生型和/或206-7AA显着不同。