La preparazione del campione per la microscopia crioelettronica (cryo-EM) è un collo di bottiglia significativo nel flusso di lavoro di determinazione della struttura di questo metodo. Qui, forniamo metodi dettagliati per l’utilizzo di un blocco stampato tridimensionale facile da usare per la preparazione di film di supporto per stabilizzare i campioni per gli studi EM di trasmissione.
La determinazione della struttura mediante microscopia crioelettronica (cryo-EM) è cresciuta rapidamente nell’ultimo decennio; tuttavia, la preparazione dei campioni rimane un collo di bottiglia significativo. I campioni macromolecolari sono idealmente ripresi direttamente da orientamenti casuali in un sottile strato di ghiaccio vitreo. Tuttavia, molti campioni sono refrattari a questo e la denaturazione delle proteine all’interfaccia aria-acqua è un problema comune. Per superare tali problemi, i film di supporto, tra cui carbonio amorfo, grafene e ossido di grafene, possono essere applicati alla griglia per fornire una superficie che i campioni possono popolare, riducendo la probabilità che le particelle subiscano gli effetti deleteri dell’interfaccia aria-acqua. L’applicazione di questi delicati supporti alle griglie, tuttavia, richiede un’attenta manipolazione per prevenire rotture, contaminazione nell’aria o ampie fasi di lavaggio e pulizia. Un recente rapporto descrive lo sviluppo di un blocco di galleggiamento facile da usare che facilita il trasferimento bagnato delle pellicole di supporto direttamente al campione. L’uso del blocco riduce al minimo il numero di passaggi di movimentazione manuale richiesti, preservando l’integrità fisica del film di supporto e il tempo durante il quale la contaminazione idrofobica può accumularsi, garantendo che un sottile film di ghiaccio possa ancora essere generato. Questo documento fornisce protocolli passo-passo per la preparazione di carbonio, grafene e supporti di ossido di grafene per studi EM.
Nell’ultimo decennio, le scoperte, principalmente nella tecnologia dei rivelatori, ma anche in altri campi tecnici, hanno facilitato una successione di aumenti sostanziali della risoluzione alla quale i sistemi biologicamente rilevanti possono essere ripresi mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM)1,2. Nonostante il fatto che la crio-EM consenta già la risoluzione di strutture ad alta risoluzione da un minimo di 50 μg di proteine attraverso l’analisi a singola particella (SPA), il campione crio-EM e la preparazione della griglia rimangono i principali colli di bottiglia3,4,5. I campioni di SPA sono costituiti da macromolecole distribuite approssimativamente in modo casuale all’interno di uno strato di ghiaccio vitreo. Il ghiaccio deve essere il più sottile possibile per massimizzare la differenza di contrasto tra le particelle e il solvente. Le macromolecole biologiche sono più stabili (cioè, meno probabilità di perdere la loro struttura nativa) in ghiaccio più spesso, perché rimangono meglio solvate. Inoltre, le particelle sono spesso distribuite molto meglio sul campo visivo nel ghiaccio molto più spesso della dimensione delle particelle6 e spesso non possono essere trovate all’interno di buchi nei film di carbonio.
Inoltre, strati più spessi di ghiaccio riducono la probabilità che le molecole siano vicine all’interfaccia aria-acqua a causa dell’elevato rapporto superficie-volume, ed è stato stimato che l’utilizzo di metodi standard di congelamento a tuffo per gli studi crio-EM provoca l’adsorbimento di circa il 90% delle particelle all’interfaccia aria-acqua7. Il ghiaccio più spesso si traduce in uno sfondo indesiderabilmente elevato a causa dell’aumento degli eventi di scattering all’interno del solvente e della concomitante attenuazione del segnale6,7. È quindi necessario ottenere uno strato di ghiaccio vitreo il più sottile possibile; idealmente, lo strato sarebbe solo leggermente più spesso della particella. La sfida per il ricercatore, che deve essere superata per ogni diverso campione applicato a una griglia, è quella di preparare campioni abbastanza sottili per l’imaging ad alto contrasto mantenendo l’integrità strutturale delle particelle all’interno del loro campione. L’adsorbimento proteico all’interfaccia aria-acqua è accompagnato da diversi effetti, solitamente deleteri.
In primo luogo, il legame delle proteine a questa interfaccia idrofobica spesso induce la denaturazione della proteina, che procede rapidamente ed è tipicamente irreversibile8,9. Uno studio condotto utilizzando l’acido grasso sintasi del lievito ha dimostrato che fino al 90% delle particelle adsorbite sono denaturate10. In secondo luogo, le prove di uno studio che confronta la distribuzione dell’orientamento dei set di dati sui ribosomi 80S raccolti su carbonio amorfo11 o senza supporto12 hanno dimostrato che l’interfaccia aria-acqua può causare un grave orientamento preferenziale compromettendo la ricostruzione 3D del volume13. I metodi per ridurre l’interazione delle particelle con l’interfaccia aria-acqua includono l’integrazione del tampone di congelamento con tensioattivi (come i detergenti), l’uso di pellicole di supporto, la cattura di affinità o l’impalcatura dei substrati e tempi di immersione accelerati. L’uso di tensioattivi è associato a problemi propri, poiché alcuni campioni proteici possono comportarsi in modo non ideale in loro presenza, mentre i substrati di cattura dell’affinità e di impalcatura richiedono generalmente l’ingegneria di superfici a griglia su misura e strategie di cattura. Infine, sebbene ci sia molta ricerca sullo sviluppo di dispositivi a immersione rapida14,15,16, questi richiedono apparati che generalmente non sono ampiamente disponibili.
Sebbene la griglia TEM standard per crio-EM biologico presenti già un foglio di carbonio amorfo perforato17, sono disponibili numerosi protocolli per la generazione di film di supporto aggiuntivi e il loro trasferimento alle griglie TEM. L’uso di queste pellicole è un metodo consolidato da tempo per la stabilizzazione del campione18. I supporti in carbonio amorfo sono generati per evaporazione e deposizione su fogli di mica cristallina19, da cui gli strati possono essere fatti galleggiare su griglie, con l’utilità di supporti di galleggiamento come strumenti utili stabiliti in precedenti rapporti20. I fiocchi di ossido di grafene, tipicamente preparati utilizzando una versione modificata del metodo Hummers21, sono stati utilizzati come struttura di supporto preferibile al carbonio amorfo per il loro segnale di fondo diminuito e la capacità di immobilizzare e stabilizzare le macromolecole22. Più recentemente, c’è stato un crescente interesse per l’uso del grafene come pellicola di supporto TEM a causa della sua stabilità meccanica, alta conduttività, contributo estremamente basso al rumore di fondo23, nonché l’emergere di metodi riproducibili per generare macroscopicamente grandi aree di grafene monostrato24 e trasferirlo alle griglie TEM25 . Rispetto al carbonio amorfo, che subisce moti indotti dal fascio in modo simile o peggiore al ghiaccio privo di un film di supporto11,12,17, il grafene ha mostrato una significativa riduzione del movimento indotto dal fascio delle immagini crio-EM12.
Tuttavia, mentre il grafene idrofilizzato proteggeva l’acido grasso sintasi dalla denaturazione interfacciale aria-acqua, gli autori di questo studio hanno notato che il grafene è stato contaminato durante la preparazione del campione, probabilmente a causa di una combinazione di contaminazione da idrocarburi atmosferici e dal reagente utilizzato per idrofilizzare le griglie10. Infatti, nonostante molte delle qualità superiori del grafene, il suo uso diffuso è ancora ostacolato dalla derivatizzazione necessaria per diminuire la sua idrofobicità12, che alla fine è chimicamente difficile e richiede attrezzature specializzate. Questo documento riporta i protocolli per la preparazione di carbonio amorfo, ossido di grafene e supporti per campioni di grafene utilizzando un blocco di galleggiamento del campione stampato tridimensionalmente (3D)27 per trasferire direttamente i film di supporto dai substrati su cui sono stati generati alle griglie TEM (Figura 1). Un vantaggio chiave dell’utilizzo di un tale dispositivo è il trasferimento bagnato di film, riducendo al minimo la contaminazione idrofobica dei supporti e di conseguenza la necessità di ulteriori trattamenti e riducendo il numero di passaggi di movimentazione manuale potenzialmente dannosi. Questi approcci sono poco costosi da implementare e quindi ampiamente accessibili e applicabili per gli studi crio-EM in cui sono necessari supporti di campioni.
Questo documento presenta protocolli per la gestione di film di carbonio amorfo e grafene per la preparazione di campioni crio-EM utilizzando un blocco di galleggiamento del campione27. Un file STL per il blocco di supporto è disponibile gratuitamente dal repository pubblico Thingiverse [www.thingiverse.com/thing:3440684] e può essere stampato in 3D con qualsiasi stampante stereolitografica adatta da una resina adatta. L’uso di film di carbonio che coprono una griglia TEM di solito comporta la fluttuazione del carbonio sul campione28. Questo approccio alla preparazione di griglie di macchie negative riduce al minimo l’esposizione all’aria durante la manipolazione del supporto, riducendo così la contaminazione e la denaturazione delle proteine. La preparazione di griglie utilizzando carbonio galleggiante in piccoli pozzi è vantaggiosa per galleggiare su una superficie più ampia, cioè in un bagno d’acqua o in una capsula di Petri, nel qual caso la cesoiatura meccanica del carbonio avviene molto più facilmente.
UAc può essere difficile da acquistare a causa delle attuali normative in materia di salute e sicurezza al momento della pubblicazione. Sono disponibili molti altri reagenti di colorazione negativa non radioattivi di uso comune e sono stati descritti in precedenza protocolli per la loro preparazione29. Sebbene non siano state utilizzate macchie alternative con questo blocco di galleggiamento di supporto, non è probabile che ci siano differenze in questi protocolli oltre all’ottimizzazione del tempo di incubazione con il campione (passaggio 3.5), che è già intrinsecamente dipendente dal campione. Il passaggio chiave in questo protocollo di preparazione del supporto GrOx è il passaggio 4.4, evidenziato dalla nota per evitare che l’acqua e la soluzione GrOx entrino in contatto attorno al bordo della griglia. La miscelazione inappropriata dell’acqua e delle soluzioni GrOx impedisce l’assestamento unidirezionale dei fiocchi di GrOx per azione capillare. Avere fiocchi di GrOx su entrambi i lati della lamina di carbonio si traduce in strati spessi, annullando così i vantaggi dell’utilizzo di GrOx come supporto quasi a strato singolo, oltre a intrappolare l’acqua tra i fiocchi, causando la contaminazione delle aree utilizzabili con ulteriori strati di ghiaccio. La preparazione del supporto all’ossido di grafene è relativamente facile da ottenere utilizzando goccioline di soluzione su film poliolefinico flessibile. Tuttavia, se eseguito in questo modo, è più facile contaminare accidentalmente il lato rame della griglia con errori di manipolazione; l’uso del blocco di galleggiamento riduce la probabilità di questa eventualità.
Infine, questo documento presenta un protocollo per preparare griglie ricoperte di grafene che evita qualsiasi tipo di pretrattamento del grafene per renderlo idrofilo, riducendone così i costi e aumentandone l’accessibilità. Mantenere un film bagnato durante tutta la preparazione del campione e applicare il campione in situ nel blocco appena prima del congelamento è sufficiente per consentire la generazione di strati di ghiaccio adatti per crio-EM con una distribuzione omogenea del campione. Nel complesso, i protocolli qui presentati riducono al minimo il contatto del campione con l’interfaccia aria-acqua, riducendo così la denaturazione del campione e la contaminazione del supporto. Per i tre film di supporto utilizzati in questi approcci, è stato possibile ottenere distribuzioni omogenee del campione attraverso le griglie insieme all’imaging di singole particelle intatte e ben conservate.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri della Sezione di Biologia Strutturale e Sintetica dell’Imperial College di Londra che hanno contribuito a testare queste tecniche, così come Harry Barnett dell’Imperial College Advanced Hackspace e Paul Simpson del Centre for Structural Biology. CHSA è supportato da una Sir Henry Dale Fellowship finanziata congiuntamente dal Wellcome Trust e dalla Royal Society (206212/Z/17/Z).
Basic Plasma Cleaner (230 V) | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
Dumont tweezers N5A INOX. | Dumont Swissmade | 0302-N5A-PO | |
Dumont tweezers NGG INOX. | Dumont Swissmade | 0102-NGG-PO | |
Ehtylacetate | Sigma-Aldrich | 270989-250ML | |
Fishing Loops 10 μL | VWR | 612-9353 | |
Graphene Oxide 2 mg/mL | Sigma-Aldrich | 763705-25ML | |
Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 31232-250MG | |
Mica Sheets 75 mm x 25 mm x 0.15 mm | Agar Scientific | AGG250-1 | We usually coat mica with a target carbon film thickness of 2 nm |
Monolayer Graphene on Cu | Graphenea | N/A | 10 mm x 10 mm, pack of 4 |
n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) | GLYCON Biochemicals GmbH | D97002-C | |
Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-101-Cu300 | |
Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-102-Cu300 | |
Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids | Electron Microscopy Sciences | Q350AR1 | |
Scissors | Agar Scientific | AGT577 | |
Uranyl Acetate | TAAB Laboratories Equipment | U001 | |
Vitrobot Mark IV | FEI | N/A | |
Whatman filter paper 55 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-055 | |
Whatman filter paper 70 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-070 |