הכנת סרטי תמיכה לדוגמה במיקרוסקופיית אלקטרונים שידור באמצעות בלוק הצפה תומך

1. הכנה כללית של רשתות TEM לפני העברת תמיכה באמצעות זוג פינצטה נקייה ועדיפה, הרמה וטביעה של רשתות TEM ברצף במים מזוקקים כפולים (ddH2O) או במים אולטרה-ספיריים למשך 10-15 s, ואחריהן אתיל אצטט, במשך 10-15 s.הערה: כאן נעשה שימוש ב-2000 עם פעולה שלילית, פינצטה עם קצה אלפ’ים. מניחים את פינצטה, עם רשת עדיין באחיזה, לצד אחד לייבוש אוויר במשך ~ 5 דקות. פלזמה לנקות את הרשתות כדי להפשיט את פני השטח של כל מזהמים שנצברו דרך האוויר או צעדי כביסה.הערה: כאן, ניקוי פלזמה נעשה עבור 10-15 s באוויר עם כוח גלי רדיו של 25 W. 2. הכנה כללית של פתרונות ריאגנט פתרון אצטט (UAc) של אורניל (2% w/v) עוטפים צינור 50 מ”ל בנייר כסף, ממלאים ב-50 מ”ל של מים אולטרה-תותים, ומוסיפים גרם אחד של אבקת UAc.הערה: UAc הוא רגיש לאור ומזרז לאורך זמן כאשר הוא חשוף. כמו UAc הוא רדיואקטיבי ורעיל, לשמור על רמה גבוהה של ניקיון. עם הסכנה החמורה ביותר הנובעת משאיפה או בליעה, יש לנקוט זהירות נוספת כדי למנוע כל אפשרות של שאיפת חלקיקים עדינים. כפפות תמיד חייב להיות משוחק בעת טיפול או שוקל את מלחי האורניום. מסכות ומשקפי מגן מומלצים מאוד. יש להיפטר מלחי אורניום בהתאם לדרישות החוק שנקבעו לסכנות רדיואקטיביות בתוך המדינה. השאירו את הפתרון תוך ערבוב במשך שעה אחת כדי לאפשר לכל UAc להתמוסס. יש לאחסן ב-4°C. לפני השימוש, לסנן 1 מ”ל של פתרון הכתם לתוך 800000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 השעיית תחמוצת גרפן (GrOx) Pipette 2.5 μL של GrOx לתוך צינור 1.5 מ”ל (1% ריכוז סופי). פיפט 2.5 μL של 10% (w/v) n-דודסיל β-D-maltoside (DDM) חומר ניקוי לתוך GrOx, ומערבבים בעדינות (0.1% (w/v) ריכוז סופי). הוסיפו 245 מיקרו-אל של מים אולטרה-תערובת לתערובת GrOx-DDM, ומיד מערבולת במרץ למשך 5 דקות. השתמשו במתלים של GrOx תוך שעה אחת מההכנה, מערבולת במרץ לפחות דקה אחת לפני השימוש המיידי. פתרון ברזל(III) כלוריד (FeCl3) (10% w/v) בזהירות לשקול 5 גרם של FeCl3 בסירת שקילה. מעבירים לצילינדר מדידה של 100 מ”ל המכיל 35 מ”ל של ddH2O וחטיף מוקפץ מגנטי. מניחים על צלחת ערבוב מגנטית, וממיסים את FeCl3, ומוסיפים ddH2O לנפח סופי של 50 מ”ל. סנן את פתרון FeCl3 באמצעות מסנן מזרק 0.8 מיקרומטר לבקבוק נקי לאחסון.הערה: FeCl3 הוא מאכל ומעצבן; לשטוף ידיים ואזורים חשופים אחרים עם סבון ומים קלים לפני אכילה, שתייה או עישון וכאשר עוזבים את העבודה. לספק אוורור טוב באזור התהליך כדי למנוע היווצרות של אדים. אל תנשום ערפל, אדים, ספריי. כפפות תמיד חייב להיות משוחק בעת טיפול או שוקל את המלח. מסכות ומשקפי מגן מומלצים מאוד בכל פעם בשימוש. 3. חילופי חוצצים לסרטי תמיכה בפחמן על נציץ כדי להכין דוגמאות מוכתמות שליליות באמצעות בלוק הצפת התמיכה רשת TEM לשטיפה ופלזמה.הערה: כאן, 300 רשתות נחושת חורי רשת פחמן שימשו כמתואר לעיל בסעיף 1. Pipette 10-12 μL של מדגם לתוך חילופי המאגרים היטב (עם הערוצים הקטנים) של בלוק הצפה ו 10-12 μL של פתרון UAc 2% (ראה סעיף 2.1) עבור כתמים שליליים לתוך באר חילופי שאינו מאגר הסמוכה.הערה: הבאר יש נפח של 10 μL; עם זאת, להתאים את נפח המדגם, כך מניסקוס קמור נוצר על פני השטח של הנוזל כדי לאפשר הצפת סרט נכונה. כמות נמוכה של מדגם עלולה לגרום לשבירה של הסרט. תחתוך בזהירות שתי חתיכות קטנות של נציץ עם סרט פחמן מראש על גבי. ודא כי שברי הנציץ רחבים מספיק כדי להתאים לבאר (רוחב 3.4 מ”מ) וארוך יותר מאורך הבאר (3.45 מ”מ), כך שהשבר יישב על הבאר בזמן שהפחמן צף, ויש מספיק מקום להתמודד עם השבר עם הפינצטה.הערה: כדי להתמודד עם הפחמן, השתמש פינצטה שטוחה של פעולה שלילית ארוכת קצה. בעת חיתוך שברי הנציץ, לחתוך באמצעות תנועות בודדות כדי לשמור על שלמות סרט הפחמן. לטבול את הנציץ לתוך הבאר עם זווית משוערת של 45° עד הנציץ יושב על הרמפה של הבאר שכבה של פחמן נצפתה על פני השטח של מדגם הנוזל. לאחר הדגירה הראשונית על מדגם (בדרך כלל 20 s עד 20 דקות בהתאם לדבקות המדגם; לייעל תקופה זו בהתבסס על צרכים ניסיוניים), למשוך את גיליון נציץ לאט מאוד כדי לשחזר את סרט הפחמן ולמזער את שימור מדגם צמיג שיורית. בזהירות כתם את הנציץ על ידי הקשה על המשטח התחתון (צד שאינו פחמן) עם נייר מסנן כדי להסיר נוזל עודף, ולאחר מכן להחליף את הפחמן נושא את המדגם לתוך כתם שלילי על ידי יישום לבאר היריבה (כלומר, לטבול את הנציץ כמו בשלב 3.4) המכיל את פתרון 2% UAc.הערה: שכבת פחמן יש לראות צף על גבי פתרון הכתם בשלב זה. לשחזר את שכבת הפחמן הצפה עם הצד המכוסה פחמן חורי של רשת EM שטופה וניקוי פלזמה. השאר את הרשתות לייבוש אוויר עד הדמיה על TEM. באופן אידיאלי, לכסות את הרשתות במהלך תהליך הייבוש כדי למנוע זיהום מוטס. 4. יישום בלוק הצפת התמיכה להכנת רשתות TEM מצופות תחמוצת גרפן לשטוף ורשתות TEM נקיות פלזמה באמצעות 300 רשתות נחושת חורי רשת פחמן כפי שמתואר לעיל (סעיף 1). Pipette 10-12 μL של מתלה GrOx (ראה סעיף 2.2) לתוך 4 בארות חילופי שאינן מאגר לאורך בלוק הצפה. Pipette 10-12 μL ddH2O או מים אולטרה-תזרים לתוך 4 בארות חילופי המאגרים הנותרות של הבלוק.הערה: נפח זה של מים צריך להיות מספיק כדי ליצור מניסקוס קמור קל עולה מעל גובה הבלוק. זרוק 4 רשתות בעדינות על ההשעיה GrOx של כל באר במשך 1 דקות, להבטיח כי הצד המכוסה פחמן חורי יוצר קשר עם הפתרון. לאחר דקה אחת, לשחזר כל רשת בזהירות על ידי הזזת פינצטה לתוך חריץ פינצטה של כל חילופי שאינו חוצץ היטב. נוגעים בעדינות ובקצרה בצד הנחושת, שאינו מכוסה בפחמן של כל רשת, ל-ddH2O בבאר הסמוכה. לאחר מכן, בזהירות ובעדינות להחזיק את הרשת, מים טיפת צד כלפי מטה, נגד פיסת נייר מסנן.הערה: חבטה מחוץ למים תמשוך את ההשעיה GrOx דרך הרשת על ידי פעולה נימה. זה חיוני כדי למנוע טביעת הרשת ב ddH2O, כך מגע צריך להיות קצר מאוד. כאשר הרשת מורמת, טיפת מים צריכה להחזיק לחלק התחתון של הרשת. יש להקפיד לא להזיז את הרשת על נייר המסנן כמו זה יכול להרגיז את ההתיישבות של פתיתי GrOx. השאירו את הרשתות בפינצטה לייבוש אוויר עד להכנה עם מדגם. באופן אידיאלי, לכסות את הרשתות במהלך תהליך הייבוש כדי למנוע זיהום מוטס. 5. יישום בלוק הצפת התמיכה להכנת דגימות על סרטי מונו-קלייה-גרפן לשטוף את רשתות TEM כפי שמתואר לעיל (סעיף 1), אך השמטת ניקוי פלזמה.הערה: כאן, 300 רשתות זהב חורי רשת פחמן שימשו, אבל רשתות אחרות שאינן נחושת או רשתות סגסוגת נחושת הם גם מעשיים. כדי להפקיד רשתות עם גרפן, העברה ישירה גרפן גדל על נחושת (Cu-גרפן) מצעים לרשתות cryo-EM, כפי שתואר בעבר25. מניחים ארבע רשתות שטופים על גבי גיליון Cu-graphene (10 מ”מ × 10 מ”מ) המופקדים על שקופית זכוכית, ומכסים כל רשת בטיפת איזופרופנול (5-10 μL) כדי לאפשר מגע אינטימי בין גרפן monolayer לרשת.הערה: הקפד למקם את הצד המכוסה בפחמן של הרשתות במגע עם גיליון הגרפן. כאשר האיזופרופנול מתאדה לחלוטין (בדרך כלל 2 שעות), לצוף גיליון Cu-graphene עם רשתות על 10% (w / v) פתרון FeCl3 (ראה סעיף 2.3) בצלחת פטרי, ולהשאיר לחרוט בטמפרטורת החדר לילה. מכסים את המנה כדי למנוע זיהום מוטס.הערה: לאחר החריטה הושלמה, רק monolayer גרפן יישאר צף על פתרון FeCl3 – זה צריך להיות גלוי בעין עם תאורה מתאימה. השתמש בלולאה עם קוטר גדול יותר מגודל רשת TEM כדי לדוג את הרשתות הצפות על monolayer גרפן, ולהעביר בזהירות צלחת פטרי המכיל ddH2O לשטוף.הערה: היזהר מאוד בעת דיג הרשתות כדי למנוע פגיעה בקירות של צלחת פטרי, אשר עלול לגרום שבירת סרט גרפן או כיפוף. לשטוף עוד פעמיים במים על ידי רשתות דיג והעברה לצלחת פטרי נקייה המכילה ddH2O כדי להסיר את כל שאריות FeCl3. לבסוף, מעבירים רשתות לצלחת פטרי המכילה חוצץ מדגם עד להכנת דגימה והקפאת צלילה.הערה: יש לשמור את הצד המכוסה גרפן של הרשתות רטוב בכל עת כדי למנוע את חשיפתם למזהמים מוטסים. Pipette המדגם (10-12 μL) לתוך באר חילופי שאינו מאגר של בלוק הצפה. כאשר המדגם מוכן בבלוק, בחר רשת מצופה גרפן מפתרון המאגר באמצעות זוג פינצטה נקייה, והנח על פני השטח של הבאר המכילה מדגם. לאחר תקופת דגירה מתאימה (1-5 דקות בהתאם לדגימה; לייעל על פי הצרכים הניסיוניים), לבחור את הרשת עם זוג פינצטה הקפאה נקי, ולהמשיך עם סופג וvitrification.