使用 D1S80 轨迹在实验室类中应用 DNA 指纹

注：此协议仅在学生或各自的法定监护人同意执行此协议时使用，因为基因特征特征有助于深入了解遗传关系。DNA指纹是一种常见的分子生物学方法，主要应用于人口研究和法医研究。因此，应注意尽可能降低污染风险。为了避免用来自外部来源或 DNases 的 DNA 污染样品，应佩戴手套，对仪器进行彻底清洁或消毒，并在使用前对溶液进行过滤消毒或自动切割。 1. 收获布卡尔粘膜上皮细胞 注意：与唾液和上皮细胞合作可导致传染病的传播。因此，应采用标准和基于传输的预防措施（例如使用适当的个人防护设备）。 注：包括由讲师提供的正对照（例如，讲师提取的DNA），并包含在下游处理步骤中。 在采集标本之前，在进食或刷牙后至少等待1小时。 标记一个空的和无菌的2.0 mL微中微管。 从包装中取出一个无菌布卡拭子，在脸颊内侧大力摩擦30-40次或30-40秒，以收获布卡穆科萨上皮细胞。 将收集拭子的尖端放入先前标记的无菌微中冲管中，并用手或使用无菌剪刀打破延伸至边缘以外的塑料长度。 将盖子安全地放在管子上，将收集的拭子密封在里面。 2. 从人类细胞中提取基因组DNA 提取前，将热搅拌机或加热块设置为 65 °C 以进行样品裂解。注意：使用的某些化学品属于危险类。仔细阅读安全数据表，在处理前采取相应的安全措施。 通过过滤或自动过滤所有所需的缓冲和溶液（裂解溶液、8 M 醋酸钾、2 丙醇、70% 乙醇和洗脱缓冲器）来准备和消毒。注意：除非指定，否则所有离心步骤应在室温（20-30 °C）下执行。 在吸血拭子中加入 500μL 的裂解溶液（50 mM Tris/HCl，pH 8.0;10 mM 四乙酰胺四乙酸乙烯酸;2% 硫酸钠 （SDS）），确保样品完全浸入裂解溶液中。 涡流大力至少5s。 在热混合器中以 65 °C 的温孵化样品 10 分钟。 在孵化过程中，通过脉冲涡流混合样品 3-4 次，进行 5 s。 从裂解缓冲区中取出拭子，将拭子压在管子内部，以获得最大样本量。 在解体细胞中加入100微升的8M醋酸钾。 通过倒置管子彻底混合，直到有一个白色沉淀物。 在室温下孵化5分钟。 在 18，000 x g下将样品离心 5 分钟。 将超自然的 450 μL 转移到清洁无菌的 1.5 mL 微中微富格管中。 加入450微升的2丙醇，通过倒置管（DNA的沉淀）彻底混合。 在室温下孵化5分钟。 离心机5分钟，18，000 x 克。 丢弃超自然剂，将管子倒置在干净的纸巾上，以干燥颗粒，避免交叉污染。 在加热块中以 65 °C 将 DNA 孵化 5 分钟，以完全干燥颗粒。 要清洗DNA，添加500微升的70%乙醇。 离心机1分钟，18，000 x 克。 丢弃超自然剂，将管子倒置在干净的纸巾上，以干燥颗粒。 在颗粒中加入 30μL 的悬念缓冲（10 mM 三轮/HCl pH 8.0，1 mM EDTA）。 在加热块中以 65 °C 将 DNA 孵化 10 分钟，以激活 DNases。 3. 使用 PCR 放大 D1S80 VNTR 轨迹 注：在收集必要的塑料和其他材料之前，记录将要使用的样品数量，并用所需的试剂及其体积准备工作表。将无菌管/条状/板贴有标签，用于使用样品编号的 PCR。请记住，使用 H2O 代替 DNA 和正对照（例如，使用讲师提供的 DNA）来验证 PCR，包括负对照。 准备包含 10 μL 5x PCR 反应缓冲器（包含 15 mM MgCl2）、1μL脱氧核糖核酸三磷酸 （dNTPs） （10 mM）、 5 μL （10pmol） 的 1 倍 PCR 主混合 每个引物 pMCT118-f 和 pMCT118-r （前进 – 5′-加法特卡卡阿克特克-3’， 反向 – 5′- GTCTTGGGATGCGCCC-3’） 根据卡赛等人。2， 23.8 μL 超纯 H2O， 和 0.2 μL 的塔克 DNA 聚合酶 （5 U/μL）.注：pMCT118-f/pMCT118-r的引物设计在 D1S80 VNTR区域的侧翼区域，放大了整个轨迹。 将 PCR 管/条形/板与要使用的示例编号进行标记。 阿里报价 45 μL 的主混合到每个标记的 PCR 样品管或井。 在每个 PCR 管/板井中将 DNA 模板的 5μL 添加到主混合物中，以获得总容量为 50 μL 的营养。 更改每个 DNA 样本的移液器尖端，以避免交叉污染。 使用超纯 H2O 而不是 DNA，包括无模板控制 （NTC）。 关闭 PCR 管/条或密封板并混合。 使用桌面离心机将PCR管/条/板离心机进行20次。注：本协议中给出的 PCR 条件使用 DNA 聚合酶和使用 PCR 热循环器进行优化。一般来说，PCR条件必须适应DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶的标准延长时间为1分钟/kb。 将样品管/条状/板放在热循环器中，并使用以下条件（DNA聚合酶延长时间）孵化反应：1周期95°C 2分钟：25个周期，94°C代表15s，60°C代表15s，72°C代表30s;1个周期72°C，10分钟。 程序完成后，从恒温器中取出产品，并在 4 °C 过夜或 -20 °C 存储，直到电泳。 4. PCR 产品的阿加罗斯凝胶电泳 准备1.5%的蔗糖凝胶。 使用 1.5 克的蔗糖粉末，将其与 100 mL 的 1x 三乙酸酯-EDTA （TAE） 缓冲液混合在烧瓶中。 在微波炉（600 W）中加热混合物约1.5-2分钟。如有必要，再次旋转内容和热量，以完全溶解糖。稍微冷却，并将2μL的佩克绿色添加到蔗糖中。 使用足够适合所有样品的梳子将凝胶以一种形式倒入，并添加至少一个分子重量标记。注意：可能会发生沸腾延迟。在重新悬念尚未溶解的浮油时，小心地摇动烧瓶。注：PeqGreen 是一种用于检测核酸的无毒染料。它适用于双链DNA（dsDNA）和单链DNA（sSDNA）以及RNA的染色。灵敏度可与溴化钠相媲美。 从 4 °C 和离心机中取出 PCR 产品约 10s。 用 10 μL 样品装载凝胶井。不要过载凝胶。注：DNA聚合酶缓冲器还包括增加样品密度的化合物，以便样品可以直接加载到凝胶上，而无需装载染料。这使得样品能够沉入井中，染料有助于跟踪DNA样本的迁移程度。 在侧翼油井中加入分子重量标准（最好是 50 bp 分子重量标准）。注意：将残留的 PCR 样品存储在 -20 °C，以防必须重复 agarose 凝胶电泳。 在 1x TAE 中运行缓冲区，在 150 V（常数）下运行约 40 分钟，或直到以大约 50 bp 的速度行驶的黄色染料前部到达凝胶的下端。 应用蓝光或紫外线（UV）光时对凝胶进行成像，并记录图像以进行碎片长度分析。注意：紫外线会损害你的眼睛和皮肤。使用紫外线灯箱时，请务必佩戴防护服和紫外线安全眼镜。 按照机构危险品政策处置凝胶。 5. 碎片长度结果分析 注意：使用线性回归分析来估计碎片的长度。 为了调整 D1S80 PCR 片段的大小，在 50 bp 分子重量标准车道上的凝胶照片上放置一把尺子，使标尺顶部与装样品的井底排成一行（图 1）。注意：为了计算分子重量标准（50 bp 分子重量标准）的线性回归方程，使用了电子表格程序。 使用电子表格程序（图 2）在表中记录 50 bp 分子重量标准中每个波段与油井的距离（例如，以厘米为准）。 确定每个50 bp分子重量标准的每个片段大小的日志（例如，基数10），并将日志值输入表（图2）。 使用散射图（图 3）绘制每个数据点，其中带有垂直轴 （y 轴） 上的波段大小日志以及从凝胶顶部到水平轴 （x 轴） 分子重量标准每个波段的测量运行距离的图形。 适合趋势线（线性回归线），并显示回归方程（y = ax + b）和图形上的 R2值（图 4）。 测量每个 D1S80 放大器（图 5）的迁移距离（例如以厘米为数）。 使用回归方程估计每个 D1S80 放大器的大小：y = ax + b其中y=碎片大小的日志a =线的斜度（以第5点计算）x=与井的距离（厘米）b=回归线拦截y轴的点（以点5计算）注：由于 y 值表示碎片大小的日志，必须计算抗日志 （10y）以获得 D1S80 放大器 bp 的碎片大小。 6. 估计被测试个体等位基因中的重复单位数 注 ：D1S80 重复装置长度为 16 bp。 D1S80 已知的最小等位基因有 14 次重复。此处描述的放大灯方案产生与侧翼区域加起来额外的 145 bp 到最终大小的放大灯。 使用 表 1 来估计每个 PCR 片段中包含多少重复单元。使用线性回归推断的大小应在任何特定等位基因的 8 bp 以内。 将每个被测试个体的基因型记录为等位基因重复大小数字的组合。