JoVE Journal > Neuroscience
Özet
Abstract
Introduction
Protocol
Sonuçlar
Discussion
Açıklamalar
Acknowledgements
Materials
Referanslar
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Nörobilim

Активность афферентных нейронов задней боковой линии во время плавания у рыбок данио

Published: February 10, 2021
doi:
10.3791/62233
,
1Biyoloji Bölümü,University of Florida, The Whitney Laboratory for Marine Bioscience

Özet

Описан протокол мониторинга изменений активности афферентных нейронов во время двигательных команд в модельной системе волосковых клеток позвоночных.

Abstract

Сенсорные системы собирают сигналы, необходимые для направления поведения, но животные должны расшифровать, какая информация является биологически значимой. Локомоция генерирует повторяющиеся сигналы, которые животные должны отпутать от соответствующих сенсорных сигналов окружающей среды. Например, когда рыба плавает, поток, генерируемый волнами тела, обнаруживается механорецептивными невриномачами, состоящими из волосковых клеток, которые составляют систему боковой линии. Затем волосковые клетки передают информацию о движении жидкости от датчика к мозгу через сенсорные афферентные нейроны. Одновременно, сопутствующий разряд двигательной команды передается волосковые клетки для предотвращения сенсорной перегрузки. Поэтому учет ингибирующего эффекта прогностических двигательных сигналов во время локомоции имеет решающее значение при оценке чувствительности системы боковых линий. Мы разработали электрофизиологический подход in vivo для одновременного мониторинга активности афферентного нейрона задней боковой линии и вентрального двигательного корня у личинок рыбок данио (4-7 дней после оплодотворения), которая может длиться в течение нескольких часов. Внеклеточные записи афферентных нейронов достигаются с использованием техники свободного зажима пластыря, которая может обнаруживать активность от одного или нескольких нейронов. Записи вентральных корней выполняются через кожу со стеклянными электродами для обнаружения активности двигательных нейронов. Наш экспериментальный протокол обеспечивает возможность мониторинга эндогенных или вызванных изменений сенсорного ввода в двигательном поведении у неповрежденного позвоночного.

Introduction

Афферентные нейроны механосенсорных систем передают информацию от волосковых клеток к мозгу во время слуха и равновесия. Электрофизиология может выявить чувствительность афферентных нейронов через прямые записи. В то время как патчинг целых клеток из волосковых клеток может быть сложным, запись из нисходящих афферентных нейронов проще и позволяет оценить потенциалы действия в ответ на контролируемые стимуляции1,2,3. Стимуляция волосковых клеток приводит к их отклонению, что модифицирует механосенсорные структуры, тем самым запуская увеличение потенциалов действия (шипов) в афферентных нейронах4,5,6. В отсутствие внешних стимулов афферентные нейроны также спонтанно скачут из-за утечки глутамата из волосковых клеток на афферентные постсинаптические терминали7,8и, как было показано, способствуют поддержанию чувствительности9,10. Запись афферентной активности за патч-зажимом позволяет наблюдать чувствительность волосковых клеток и динамику сигнала, которые невозможны с использованием методов с более низким временным разрешением, таких как в микрофонике11,12 или функциональной кальциевой визуализации13,14,15. Следующий протокол позволит регистрировать афферентную активность одновременно с двигательными командами, чтобы выявить мгновенные изменения чувствительности волосковых клеток.

Рыбки данио (Danio rerio) используют волосковые клетки, содержащиеся в нейромаматах, которые составляют систему боковой линии, для обнаружения движения воды относительно их тела, что переводится в нейронные сигналы, необходимые для навигации16,17,18,избегания хищников, захвата добычи19,20и стайки21. Поток воды также может быть самогенерируемым движениями плавания22,23,24,дыхания22,25,26и кормления27. Это поведение включает в себя повторяющиеся движения, которые могут утомлять волосковые клетки и ухудшать восприятие. Поэтому крайне важно, чтобы система боковых линий различала внешние (экзафферентные) и самогенерируемые (рефафферентные) стимулы потока. Вытекающий из этого разряд ожижает самогенерируемые сигналы потока во время передвижения у рыбок данио. Этот тормозной прогностический двигательный сигнал передается через нисходящие нейроны к сенсорным рецепторам для изменения входного сигнала или прерывания обработки обратной обратной связи28,29. Основополагающая работа, способствовающая нашему раннему пониманию этой системы, опиралась на препараты in vitro, где связь и эндогенная активность нейронной цепи не поддерживались28,30,31,32,33,34,35. Этот протокол описывает подход к сохранению неповрежденной нейронной цепи, где поддерживается динамика эндогенной обратной связи, что позволяет лучше понять сопутствующий разряд in vivo.

Протокол, описанный здесь, описывает, как контролировать активность афферентных нейронов задней боковой линии и двигательных нейронов одновременно у личинок рыбок данио. Характеристика динамики афферентного сигнала до, во время и после двигательных команд дает представление о эндогенной обратной связи центральной нервной системы в режиме реального времени, которая модулирует чувствительность волосковых клеток во время передвижения. В этом протоколе описывается, какие материалы необходимо будет подготовить до экспериментов, а затем описывается, как парализовать и подготовить личинок рыбок данио. Протокол будет описывать, как установить стабильную запись свободных пятен афферентных нейронов и внеклеточных вентральных корневых (VR) записей двигательных нейронов. Репрезентативные данные, которые могут быть получены с помощью этого протокола, представлены образцовым индивидуумом и анализ проводился на нескольких репликах экспериментального протокола. Предварительная обработка данных выполняется с использованием пользовательских письменных скриптов в MATLAB. В целом, эта экспериментальная парадигма in vivo готова обеспечить лучшее понимание сенсорной обратной связи во время передвижения в модельной системе волосковых клеток позвоночных.

Protocol

Все исследования по уходу за животными и эксперименты проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Университета Флориды. 1. Подготовка материалов для электрофизиологических записей Сделайте силиконовую элас…

Representative Results

После того, как личинки рыбок данио должным образом обездвижены и достигнут афферентный ганглий задней боковой линии и запись VR, активность как в афферентных, так и в двигательных нейронах может быть измерена одновременно. Каналы записи отображаются с использованием протоколов записи…

Discussion

Описанный экспериментальный протокол обеспечивает потенциал для мониторинга эндогенных изменений сенсорного ввода в двигательном поведении у неповрежденного, ведомого позвоночного. В частности, в нем подробно описывается подход in vivo к выполнению одновременных внеклеточных записей…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы с благодарностью признаем поддержку со стороны Национального института здравоохранения (DC010809), Национального научного фонда (IOS1257150, 1856237) и Лаборатории морских биологических наук Уитни J.C.L. Мы хотели бы поблагодарить бывших и нынешних членов Лаборатории Ляо за стимулирование дискуссий.

Materials

100 mL beaker PYREX 1000 resceptacle for etchant
10x water immersion objective Olympus UMPLFLN10xW low magnification for positioning larvae and recording electrode
40x water immersion objective Olympus LUMPLFLN40XW higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp
abfload.m supplemental coding file custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files
AffVR_preprocess.m supplemental coding file custom written MATLAB script for preprocessing recording data
BNC coaxial cables ThorLabs 2249-C-12 connecting amplifier and digitizer channels; require 4
borosilicate glass capillaries w/ filament Warner Instruments G150F-3 inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes
burst_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
computer N/A N/A any computer should work
DC Power Supply Tenma 72-420 used for electrically etching dissection pins
electrophysiology digitizer Axon Instruments, Molecular Devices Axon DigiData 1440A enables acquisition of patch-clamp data
filament Sutter Instrument Company FB255B 2.5 mm box filament used in micropipette puller
fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 used to manipulate larvae and insert pins
fixed stage DIC microscope Olympus BX51WI microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings
flexible, tapered pipette tip Fisher Scientific 02-707-169 flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip
FluoroDish World Precision Instruments Inc. FD3510-100 cover glass bottomed dish recording dish
KimWipe KimTech 34155 task wipe used for wicking away excess fluid from larvae
Kwik-Gard World Precision Instruments Inc. 710172 self-mixing sylgard elastomer
MATLAB MathWorks R2020b command line software for preprocessing data
microelectrode amplifier Axon Instruments, Molecular Devices MultiClamp 700B patch clamp amplifier for dual channel recordings
microforge Narishige MF-830 microforge to polish recording electrode
micromanipulator control unit Siskiyou MC1000-eR/T 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator
micropipette puller Sutter Instrument Company Flaming/Brown P-97 for pulling capillary glass into recording electrodes
microscope control unit Siskiyou MC1000e positions the microscope around the fixed stage and preparation
motorized micromanipulator Siskiyou MX7600 positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording
MultiClamp Commander Molecular Devices 2.2.2 downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page
optical air table Newport Corporation VH3036W-OPT breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings
pCLAMP Molecular Devices 10.7.0 downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page
permanent ink marker Sharpie order from amazon.com for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder
petri-dish Falcon 35-3001 used to immerse larvae in paralytic
pipette holder Molecular Devices 1-HL-U hold recording electrode and connect to the headstage
pneumatic transducer Fluke Biomedical Instruments DPM1B for controlling recording electrode internal pressure
potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473-25G etchant for etching dissection pins
silicone tubing Tygon 14-169-1A tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder
spike_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
stereomicroscope Carl Zeiss Stemi 2000-C used to visualize pin tips and during preparation of larvae
straight edge razor blade Canopus order from amazon.com cuts the tungsten wire while making dissection pins
swimbout_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
syringe Becton Dickinson Compoany 309602 filled with extracellular solution to inject into recording electrodes
transfer pipette Sigma-Aldrich Z135003-500EA single use, non-sterile pipette for transfering larvae
tricaine methanesulfonate Syndel 12854 pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage.
tungsten wire World Precision Instruments Inc. 715500 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins
vacuum filtration unit Sigma-Aldrich SCGVU11RE single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer
voltage-clamp current-clamp headstage Molecular Devices CV-7B supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages
α-bungarotoxin ThermoFisher B1601 for immobilizing the larvae prior to recording
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referanslar

  1. Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
  2. Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C. Afferent and motorneuron activity in response to single neuromast stimulation in the posterior lateral line of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 112 (6), 1329-1339 (2014).
  3. Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).
  4. Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
  5. Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. Connectomics of the zebrafish’s lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit. eLife. 7, 33988 (2018).
  6. Obholzer, N., et al. Vesicular glutamate transporter 3 is required for synaptic transmission in zebrafish hair cells. The Journal of Neuroscience. 28 (9), 2110-2118 (2008).
  7. Keen, E. C., Hudspeth, A. J. Transfer characteristics of the hair cell’s afferent synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).
  8. Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
  9. Manley, G. A., Robertson, D. Analysis of spontaneous activity of auditory neurons in the spiral ganglion of the guinea-pig cochlea. The Journal of Physiology. 258 (2), 323-336 (1976).
  10. Kiang, N. Y. S., Watanabe, T., Thomas, E., Clark, L. . Discharge patterns of single fibers in the cat’s auditory nerve. , (1965).
  11. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  12. Trapani, J. G., Nicolson, T. Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
  13. Reinig, S., Driever, W., Arrenberg, A. B. The descending diencephalic dopamine system is tuned to sensory stimuli. Current Biology. 27 (3), 318-333 (2017).
  14. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
  15. Pichler, P., Lagnado, L. Motor behavior selectively inhibits hair cells activated forward motion in the lateral line of zebrafish. Current Biology. 30 (1), 150-157 (2020).
  16. Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish larvae exhibit rheotaxis and can escape a continuous suction source using their lateral line. PloS One. 7 (5), 36661 (2012).
  17. Suli, A., Watson, G. M., Rubel, E. W., Raible, D. W. Rheotaxis in larval zebrafish is mediated by lateral line mechanosensory hair cells. PLoS One. 7 (2), 29727 (2012).
  18. Oteiza, P., Odstcil, I., Lauder, G., Portugues, R., Engert, F. A novel mechanism for mechanosensory-based rheotaxis in larval zebrafish. Nature. 547 (7664), 445-448 (2017).
  19. McHenry, M. J., Feitl, K. E., Strother, J. A. Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator’s strike. Biology Letters. 5 (4), 477-479 (2009).
  20. Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow. The Journal of Experimental Biology. 216, 388-398 (2013).
  21. Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A. B., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios. The Journal of Experimental Biology. 221, 175166 (2018).
  22. Palmer, L. M., Giuffrida, B. A., Mensinger, A. F. Neural recordings from the lateral line in free-swimming toadfish, Opsanus tau. The Biological Bulletin. 205 (2), 216-218 (2003).
  23. Ayali, A., Gelman, S., Tytell, E. D., Cohen, A. H. Lateral line activity during undulatory body motions suggests a feedback link in closed-loop control of sea lamprey swimming. Canadian Journal of Zoology. 87 (8), 671-683 (2009).
  24. Mensinger, A. F., Van Wert, J. C., Rogers, L. S. Lateral line sensitivity in free-swimming toad fish Opsanus tau. The Journal of Experimental Biology. 222, 190587 (2019).
  25. Montgomery, J., Bodznick, D., Halstead, M. Hindbrain signal processing in the lateral line system of the dwarf scorpionfish Scopeana papillosus. The Journal of Experimental Biology. 199, 893-899 (1996).
  26. Montgomery, J. C., Bodznick, D. An adaptive filter that cancels self-induced noise in the electrosensory and lateral line mechanosensory systems of fish. Neuroscience Letters. 174 (2), 145-148 (1994).
  27. Palmer, L. M., Deffenbaugh, M., Mensinger, A. F. Sensitivity of the anterior lateral line to natural stimuli in the oyster toadfish, Opsanus tau (Linnaeus). The Journal of Experimental Biology. 208, 3441-3450 (2005).
  28. Russell, I. J., Roberts, B. L. Inhibition of spontaneous lateral-line activity of efferent nerve stimulation. The Journal of Experimental Biology. 57, 77-82 (1972).
  29. Lunsford, E. T., Skandalis, D. A., Liao, J. C. Efferent modulation of spontaneous lateral line activity during and after zebrafish motor commands. Journal of Neurophysiology. 122 (6), 2438-2448 (2019).
  30. Russell, I. J. The pharmacology of efferent synapses in the lateral-line system of Xenopus laevis. The Journal of Experimental Biology. 54 (3), 643-659 (1971).
  31. Roberts, B. L., Russell, I. J. The activity of lateral-line efferent neurons in stationary and swimming dogfish. The Journal of Experimental Biology. 57 (2), 435-448 (1972).
  32. Flock, A., Russell, I. J. The post-synaptic action of efferent fibres in the lateral line organ of the burbot Lota lota. The Journal of Physiology. 235 (3), 591-605 (1973).
  33. Montgomery, J. C. Noise cancellation in the electrosensory system of the thornback ray; common mode rejection of input produced by the animal’s own ventilatory movement. Journal of Comparative Physiology. 155, 103-111 (1984).
  34. Tricas, T. C., Highstein, S. M. Action of the octavolateralis efferent system upon the lateral line of free-swimming toadfish, Opsanus tau. Journal of Comparative Physiology. 169 (1), 25-37 (1991).
  35. Weeg, M. S., Land, B. R., Bass, A. H. Vocal pathways modulate efferent neurons to the inner ear and lateral line. The Journal of Neuroscience. 25 (25), 5967-5974 (2005).
  36. Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boulter, J., Vetter, D. E., Heinemann, S. α9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell. 79 (4), 705-715 (1994).
  37. Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive swimming motor patterns in wild type and mutant larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3177-3188 (2005).
  38. Hentschke, H. abfload. 1.4.0.0. MATLAB Central File Exchange. , (2020).
  39. Harris, G. G., Milne, D. C. Input-output characteristics of the lateral-line sense organs of Xenopus laevis. The Journal of the Acoustical Society of America. 40 (1), 32-42 (1966).
  40. Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2615-2623 (2012).
  41. Song, S., et al. Mathematical modeling and analyses of interspike-intervals of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral line. Nature Science Reports. 8, 14851 (2018).
  42. Liao, J. C., Fetcho, J. R. Shared versus specialized glycinergic spinal interneurons in axial motor circuits of larval zebrafish. The Journal of Neuroscience. 28 (48), 12982-12992 (2008).
  43. von Holst, E., Mittelstaedt, H. The principle of reafference: interactions between the central nervous system and the peripheral organs. Die Naturwissenschften. 37, 463 (1950).
  44. Crapse, T. B., Sommer, M. A. Corollary discharge across the animal kingdom. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (8), 587-600 (2008).
  45. Brichta, A. M., Goldberg, J. M. Responses to efferent activation and excitatory response-intensity relations of turtle posterior-crista afferents. Journal of Neurophysiology. 83 (3), 1224-1242 (2000).

Etiketler

Posterior Lateral LineAfferent NeuronsZebrafishPatch ElectrophysiologyHair CellsDissectionMicroelectrodeZebrafish LarvaeParalysisExtracellular Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Bu Makaleden Alıntı Yapın
Lunsford, E. T., Liao, J. C. Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish. J. Vis. Exp. (168), e62233, doi:10.3791/62233 (2021).
Atıfı İndir
Tekrar Baskılar ve İzinler

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image