Воздушная инфляция мышиных легких с сосудистой перфузией-фиксацией

Гистология легких представляет собой золотой стандарт для оценки архитектуры легких во время здоровья и болезни и является одним из наиболее часто используемых инструментов исследователями^{легких1}. Одним из наиболее критических аспектов данной методики является правильная изоляция и сохранение легочной ткани, так как вариабельность на этом этапе может привести к ухудшению качества тканей и ошибочным результатам^1,2,3. У живых животных объем легких определяется балансом между внутренней упругой отдачей легкого и внешними силами, передаваемыми от грудной стенки и диафрагмы поверхностным натяжением. Соответственно, при входе в грудную клетку теряются внешние силы и легкое разрушается. Гистологические срезы, подготовленные из коллапсированных легких, имеют переполненный вид, и границы между анатомическими компартментами (т. Е. Воздушные пространства, сосуды и интерстиции) может быть трудно различить. Чтобы обойти эту проблему, исследователи часто раздувают легкие во время химической фиксации, чтобы сохранить размер и архитектуру воздушного пространства.

Легкие могут быть раздуты воздухом или жидкостью. Давление, необходимое для надувания легких до одного и того же объема, различается между надуванием воздуха и жидкости из-за межмолекулярных сил на границе раздела воздух-жидкость. Для преодоления поверхностного натяжения и вскрытия разрушенных альвеол 4 требуется более высокое давление (например, 25 смН₂О), чем давление жидкости (например,₁₂смН²О). После того, как альвеолы были набраны, более низкое давление может держать альвеолы открытыми до того же объема, что и плато кривой давления-объема, и давления выравниваются по всему легкому в соответствии с законом Паскаля^4,5,6,7,8.

Существуют два основных метода инфляции и фиксации легких для сохранения мышиных легких для гистологии. Чаще всего воздушные пространства закапываются жидкостью , часто содержащей фиксатор. Основным преимуществом такого подхода является то, что он относительно прост и требует небольшой подготовки. В то время как интратрахеальная инстилляция фиксатора может быть предпочтительной в исследованиях, которые сосредоточены на сосудистой сети, жидкость, которая закапывается через трахею, имеет тенденцию выталкивать проксимальные клетки дыхательных путей и муцины в более дистальные области воздушного^{пространства,}в то время как инфляция воздуха не составляет^{1,3,4,9,10,11.} Более того, непреднамеренное отслоение лейкоцитов от эпителия во время жидкой инфляции изменяет их морфологию, артефактно придавая им простой, округлый вид^4,10,11,12. Наконец, надув легких жидкостью может непреднамеренно сжимать интерстиций^4,10,11. Вместе эти факторы могут искажать нормальную анатомию и клеточное распределение в сохранившихся легких, тем самым ограничивая технику.

Альтернативным методом сохранения тканей является сосудистая перфузия-фиксация. При этом методе фиксатор перфузируется в легочную сосудистую систему через полую вену или правый желудочек. Этот метод сохраняет расположение и морфологию клеток в просвете воздушного пространства. Однако, если легкие не раздуваются во время фиксации перфузии, легочная ткань, вероятно, разрушится.

Воздушная инфляция с сосудистой перфузион-фиксацией использует сильные стороны каждого из вышеперечисленных методов фиксации. Здесь мы предоставляем протокол для этой техники. Материалы и оборудование, которые требуются, относительно недороги и могут быть легко получены и собраны. Завершенная установка, показанная на рисунке 1А,обеспечивает постоянное давление в дыхательных путях легких с помощью регулируемой, заполненной жидкостью колонки, в то время как перистальтический насос обеспечивает фиксацию через правый желудочек. Легкие с сохраненной морфологией затем могут быть дополнительно обработаны для структурно-функционального анализа.