Özet

Воздушная инфляция мышиных легких с сосудистой перфузией-фиксацией

Published: February 02, 2021
doi:

Özet

Представлен метод воздушной инфляции с сосудистой перфузией-фиксацией легких, сохраняющих расположение клеток в дыхательных путях, альвеолах и интерстиции для структурно-функционального анализа. Постоянное давление в дыхательных путях поддерживается с помощью воздушно-инфляционной камеры, в то время как фиксатор перфузируется через правый желудочек. Легкие обрабатываются для гистологических исследований.

Abstract

Гистология легких часто используется для исследования вклада, обеспечиваемого клетками воздушного пространства во время гомеостаза легких и патогенеза заболеваний. Однако широко используемые методы фиксации на основе инстилляции могут вытеснять клетки воздушного пространства и слизь в конечные дыхательные пути и могут изменять морфологию тканей. Для сравнения, методы фиксации сосудов превосходят в сохранении местоположения и морфологии клеток в воздушном пространстве и слизистой оболочки. Однако, если одновременно не применяется положительное давление в дыхательных путях, области легких могут коллапсировать, а капилляры могут выпячиваться в альвеолярные пространства, что приводит к искажению анатомии легких. Здесь мы описываем недорогой метод воздушной инфляции во время сосудистой перфузии-фиксации для сохранения морфологии и расположения дыхательных путей и альвеолярных клеток и интерстиций в легких мышей для последующих гистологических исследований. Постоянное давление воздуха подается в легкие через трахею из герметичной, заполненной воздухом камеры, которая поддерживает давление через регулируемую колонку жидкости, в то время как фиксатор перфузируется через правый желудочек.

Introduction

Гистология легких представляет собой золотой стандарт для оценки архитектуры легких во время здоровья и болезни и является одним из наиболее часто используемых инструментов исследователямилегких1. Одним из наиболее критических аспектов данной методики является правильная изоляция и сохранение легочной ткани, так как вариабельность на этом этапе может привести к ухудшению качества тканей и ошибочным результатам1,2,3. У живых животных объем легких определяется балансом между внутренней упругой отдачей легкого и внешними силами, передаваемыми от грудной стенки и диафрагмы поверхностным натяжением. Соответственно, при входе в грудную клетку теряются внешние силы и легкое разрушается. Гистологические срезы, подготовленные из коллапсированных легких, имеют переполненный вид, и границы между анатомическими компартментами (т. Е. Воздушные пространства, сосуды и интерстиции) может быть трудно различить. Чтобы обойти эту проблему, исследователи часто раздувают легкие во время химической фиксации, чтобы сохранить размер и архитектуру воздушного пространства.

Легкие могут быть раздуты воздухом или жидкостью. Давление, необходимое для надувания легких до одного и того же объема, различается между надуванием воздуха и жидкости из-за межмолекулярных сил на границе раздела воздух-жидкость. Для преодоления поверхностного натяжения и вскрытия разрушенных альвеол 4 требуется более высокое давление (например, 25 смН2О), чем давление жидкости (например,12смН2О). После того, как альвеолы были набраны, более низкое давление может держать альвеолы открытыми до того же объема, что и плато кривой давления-объема, и давления выравниваются по всему легкому в соответствии с законом Паскаля4,5,6,7,8.

Существуют два основных метода инфляции и фиксации легких для сохранения мышиных легких для гистологии. Чаще всего воздушные пространства закапываются жидкостью , часто содержащей фиксатор. Основным преимуществом такого подхода является то, что он относительно прост и требует небольшой подготовки. В то время как интратрахеальная инстилляция фиксатора может быть предпочтительной в исследованиях, которые сосредоточены на сосудистой сети, жидкость, которая закапывается через трахею, имеет тенденцию выталкивать проксимальные клетки дыхательных путей и муцины в более дистальные области воздушногопространства,в то время как инфляция воздуха не составляет1,3,4,9,10,11. Более того, непреднамеренное отслоение лейкоцитов от эпителия во время жидкой инфляции изменяет их морфологию, артефактно придавая им простой, округлый вид4,10,11,12. Наконец, надув легких жидкостью может непреднамеренно сжимать интерстиций4,10,11. Вместе эти факторы могут искажать нормальную анатомию и клеточное распределение в сохранившихся легких, тем самым ограничивая технику.

Альтернативным методом сохранения тканей является сосудистая перфузия-фиксация. При этом методе фиксатор перфузируется в легочную сосудистую систему через полую вену или правый желудочек. Этот метод сохраняет расположение и морфологию клеток в просвете воздушного пространства. Однако, если легкие не раздуваются во время фиксации перфузии, легочная ткань, вероятно, разрушится.

Воздушная инфляция с сосудистой перфузион-фиксацией использует сильные стороны каждого из вышеперечисленных методов фиксации. Здесь мы предоставляем протокол для этой техники. Материалы и оборудование, которые требуются, относительно недороги и могут быть легко получены и собраны. Завершенная установка, показанная на рисунке 1А,обеспечивает постоянное давление в дыхательных путях легких с помощью регулируемой, заполненной жидкостью колонки, в то время как перистальтический насос обеспечивает фиксацию через правый желудочек. Легкие с сохраненной морфологией затем могут быть дополнительно обработаны для структурно-функционального анализа.

Protocol

Все методы, описанные в этом протоколе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Национального еврейского здравоохранения. ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол состоит из трех компонентов. Первый компонент детализирует конструкцию возду?…

Representative Results

В неповрежденной грудной клетке легкие удерживаются открытыми внешними силами, приложенными стенкой грудной клетки через плевральное пространство6,14. При введении диафрагмы во время рассечения целостность плеврального пространства упраздняется и лег…

Discussion

Хотя обычно используются, методы фиксации на основе интратрахеи вытесняют лейкоциты из дыхательных путей и могут изменить нормальную архитектуру легких. Метод воздушной инфляции с сосудистой перфузией-фиксацией, который предусмотрен в данном протоколе, преодолевает эти подводные ка…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась грантами Национального института сердца, легких и крови (NHLBI) HL140039 и HL130938. Авторы хотели бы поблагодарить Шеннон Хотт и Джазалле МакКлендон за их технический опыт.

Materials

00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer Cole-Parmer Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF Stopcock
BD 60 mL syringe, slip tip BD 309654 Syringe used to construct the water column
BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 BD Biosciences 305122 Needle for vascular perfusion/fixation
Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer Nordson Medical FTLLBMLRL-1 Female Luer
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H3393 Heparin solution.
Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge BD Biosciences 427564 Luer-Stub Adapter
Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee Nordson Medical LT787-9 Male Luer
Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing ThermoFisher Scientific 8000-9020 Tubing
Paraformaldehyde Aqueous Solution – 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline
Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker Permatex 81724 Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium Corning 21-040-CV Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions
Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container Sterilite 0342 Animal processing container

Referanslar

  1. Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
  2. Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).
  3. Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).
  4. Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).
  5. Harris, R. S. Pressure-Volume Curves of the Respiratory System. Respiratory Care. 50 (1), 78-99 (2005).
  6. Bachofen, H., Schürch, S. Alveolar surface forces and lung architecture. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).
  7. Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).
  8. Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation. Frontiers in Physiology. 11, 600492 (2020).
  9. Braber, S., Verheijden, K. a. T., Henricks, P. a. J., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
  10. Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I. Airway Macrophages. American Review of Respiratory Disease. 129 (5), 823-826 (1984).
  11. Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method. Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).
  12. Matulionis, D. H. Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).
  13. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564 (2012).
  14. Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species. The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).
  15. Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols. , 115-128 (2017).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Thomas, S. M., Bednarek, J., Janssen, W. J., Hume, P. S. Air-Inflation of Murine Lungs with Vascular Perfusion-Fixation. J. Vis. Exp. (168), e62215, doi:10.3791/62215 (2021).

View Video