监测人类痰样中的中性粒细胞和导管素 G 活性

以下协议描述了对人类痰的分析。人类样本处理已获得海德堡大学道德委员会的批准，并获得了所有患者或其父母/法定监护人的书面知情同意（S-370/2011）和健康控制（S-046/2009）。 注：以下协议描述中性粒细胞血清蛋白酶 （NSP） 活性中的样品制备和定量。本文提出的实验程序侧重于人类痰和中性粒细胞elastase 14、20、21（NE）或导管素G 15（CG）活性测量。然而，样本制备协议的轻微适应使血液衍生细胞和肿瘤同质化的分析成为可能。此外，矩阵金属蛋白酶12和导管素S活动可以通过专用FRET探针22，23，24，25，26进行类似的调查。 1. 样品制备：细胞分离和超自然分离 注意：如果可能，痰的治疗应在预期后120分钟内进行，痰应储存在冰上，直到进一步处理。 如果不能自发地预测痰，诱导痰如前所述19。简言之，在启动痰诱导程序之前吸入200微克的β-2受体-拮抗剂沙丁胺醇。之后，使用雾化器吸入高压（6%）盐水溶液15分钟。在培养皿中收集预期的痰。 在移液器尖的帮助下，将唾液中的粘液团块分离到培养皿中。 称重粘液。注：粘液样本的平均重量为0.8克（变化在0.1克至5克之间）：0.1 g 通常足以执行上述程序。 在痰中加入 4 个 10% 的痰素 （在 PBS 中） 的 4 个部分 （v/w）： 4 mL 的 10% 痰素每克痰）。注意：孢子素由磷酸盐缓冲剂中的浓缩二硫三醇组成，因此小心处理。 在室温下（RT）将混合物在摇动摇床上孵育15分钟，溶解粘液。出于安全考虑，将摇床放入烟雾罩中。 通过添加相同体积的冷 PBS（例如：每 mL 10% Sputolysin 的 1 mL 冷 PBS 来抑制反应）。 通过管道混合以获得同质解决方案。 通过100μm尼龙细胞过滤器将混合物过滤成50mL管。 通过 40μm 尼龙细胞过滤器重复过滤步骤。 在4°C下，在300 x g下将解决方案离心10分钟。 小心地将超自然分数转移到一个新的管子中，并将其储存在冰上。注：超自然分数可存储在-20°C或-80°C，直到进一步分析。 轻轻地将细胞颗粒在 500 μL 的冷 PBS 中重新喷出，并将其放置在冰上。注意：必须立即处理单元格分数。 2. 中性粒细胞血清蛋白酶活性测量 注：这里采用不同的方法，通过FRET记者量化NSP活动。技术的选择取决于具体的生物医学问题和实验的目的。所展示的探针对一组肺相关酶14、15的特异性进行了广泛的测试。虽然探针针对其靶酶是特定的，但始终检查感兴趣的临床样本上的探针特异性。这可以通过在添加探针之前用特定的蛋白酶抑制剂孵育样品来实现，这应该会消除 D/A 比率的任何增加。 可溶性 NSP 活动量定量通过氟测定仪或板读取器检测注意：任何能够检测荧光的仪器都可以检测样品可溶性部分的蛋白酶活性。在冰上解冻酶。 在使用之前，将 NE 和 CG 保存在酸性存储缓冲区（50 mM 醋酸钠、200 mM NaCl、pH 5.5）以防止自乳化。 要设置酶标准曲线，在激活缓冲区（10 mM Tris-HCl，500m NaCl 在 pH 7.5 中）中准备 1：2 系列稀释酶（NE 为 33.9 – 0.271 nM;CG 为 42.6 – 0.333 nM）。激活缓冲器具有中性 pH，因此能够有效地进行酶催化。 要准备最高标准浓度（NE 浓度：33.9 nM），在 999 μL 的激活缓冲中稀释 1 μL NE（33.9 μM）。 要准备第二个标准（NE 浓度：16.95 nM），将第一次稀释的 200 μL 与 200 μL 的激活缓冲混合。 相应地准备剩余的1：2稀释。 最后一个标准，即空白，由纯激活缓冲区组成。建议测量技术重复或三脚架。在标准和样品准备过程中，尽量将小瓶放在冰上。 在标准制备的同时，在激活缓冲中稀释痰样。在评估其蛋白酶活性之前稀释人体样本，以保持在报告信号增加的线性范围内（捐赠者/接受者比率）。如果患者样本未稀释，发生得太快，无法进行可靠的安装。由于与CF和COPD患者的样本相比，健康的供体痰中含有较少的活性蛋白酶，通常会进行不同的稀释（健康痰超标剂为1：10，慢性阻塞性肺病或慢性阻塞性肺病患者的痰超标为1：20-500）。注意：为了定量测量浓度未知的样品中的蛋白酶活性，需要平行测量具有已知酶浓度的标准曲线，最好是在同一板块上测量。人类痰中活性酶的浓度是通过将人类痰样中测量的斜坡与标准曲线测量的斜坡进行插值来计算的。 在准备样品进行测量之前，先设置仪器。将 NE FRET 探头 （NEmo-114）的激发波长设置为 354 nm，并为供体设置检测波长至 400 nm，为接受者设置 490 nm。将 CG FRET 探头 （sSAM15）的激发波长设置为 405 nm，并将排放设定为 485（供体）和 580 nm（接受者）。 将 40 μL 的样品、标准或空白添加到黑色 96 井半区域板的井中。 要准备包含记者的主组合（主组合中的记者浓度：10 μM），在激活缓冲中稀释探头库存（DMSO中的1 mM）1：100。通过将所需的板井数量乘以 10 μL x 来准备所需的主混合体积。要达到 NEmo-1 和 sSAM 记者荧光测量的最佳最终浓度 （2 μM），请将主混合物的 10 μL 添加到每个井中（包含样本、标准或空白的 40 μL），然后开始读取。因此，NEmo-1和sSAM记者将分别监测可溶性中性粒细胞酶和导管素G活性。注：如果试剂喷油器不可用，请务必在记者加入样品后尽快开始读出。 启动读板器测量并记录每 60-90 秒的供体/接受者比率增加至少 20 分钟，或直到信号的增加达到高原。 数据导出后，通过将捐赠者相对荧光单位 （RFU） 与接受者 RFU 除以每个时间点和样本来计算供体/接受者比率 （D/A 比率）。 计算每个样本的 D/A 比率均值和标准偏差。 确定 D/A 比率变化的线性增长中的坡度。斜率是 FRET 探头酶率的指标。通过将从人类样本中提取的线性回归坡度与酶标准计算的线性回归坡度相配，计算痰中活性酶的浓度。 通过氟度计或板式读卡器检测，对膜绑定 NSP 活动进行量化 如上所述，分离痰细胞。在 40μL 的 PBS 体积中重新发送 3 x 104 个单元。将单元格添加到板读取器中。 设置仪器。将膜绑定 NE FRET 探头 （NEmo-214）的激发波长设置为 405 nm，并为供体设置检测波长至 485 nm，为接受者设置 580 nm。将膜绑定 CG FRET 探头 （mSAM15）的激发波长设置为 405 nm，并将排放设定为 485（供体）和 580 nm（接受者）。 要准备包含记者的主混合，请将激活缓冲中的探针库存稀释到浓度为 10 μM。要达到 NEmo-2 和 mSAM 记者的荧光测量的最佳最终浓度 （2 μM），请向每口井添加 10 μL 的主混合物（包含样本、标准或空白的 40 μL），然后开始读取。因此，NEmo-2和mSAM记者将分别监测膜绑定中性粒细胞和导管素G活性。注意：可以使用细胞负控制，例如，不主动分泌 NSP 的细胞。例如，记者用3×104 白细胞祖细胞 HL – 60 前列肌细胞的孵化代表有效的负控制。 记录捐赠者/接受者比率的变化至少20分钟，或直到信号的增加达到一个高原。分析上述数据。 通过荧光显微镜测量膜绑定 NSP 活动测量确定需要分析的条件数量。注意：对于每次痰样测量，建议准备和分析额外的正（PC）和负（NC）控制。 每次测量时，在 1.5 mL 管中以 50μL PBS 的体积重新喷出 3 x 104 个痰细胞。 作为负控制，用特定抑制剂（西维莱斯特、特定的NE抑制剂或导管素G抑制剂I，特定的CG抑制剂，在最终浓度为100μM时孵育痰细胞）。在 RT 孵化 10 分钟。 作为正控制，在RT用适当的酶（NE或CG分别在340纳米或200纳米孵育痰细胞10分钟）。 在每个管子（正控制处理细胞、负控制处理细胞和未经处理的细胞）中加入50μL的PBS，以达到2μM的探头最终浓度。在RT孵化10-20分钟。重要提示：添加核污渍可促进荧光显微镜成像，因为它允许在不使用 FRET 探针通道的情况下搜索感兴趣的痰细胞，从而避免记者漂白。此外，DNA污渍允许根据痰细胞的细胞核形状对痰细胞进行分割。例如，嗜中性粒细胞可以通过其多球核轻松识别。此外，还可以检索有关细胞生存能力的其他信息（具有更细分核的嗜中性粒细胞更有可能存活）。注：除了膜绑定外，通过H-NE和H-CG、细胞外DNA关联FRET探针27，可以以同样的方式测量人类痰中DNA结合NE或CG的活性。在准备主混合物时，H-NE 和 H-CG 可在浓度为 10 μM 时添加，并在细胞平和幻灯片制备之前用痰孵育。细胞外DNA的D/A比例定量与NEmo-2和mSAM相同，唯一的区别是细胞外DNA聚合物被分割，而不是单细胞27。 通过添加 100 μL 的冰冷 PBS 并在冰上传输样品来抑制反应。 细胞将混合物放在显微镜滑梯上，空气干燥，用冰冷的甲醇固定10%，10分钟，空气干燥，并安装适当的安装介质。注：显微镜幻灯片可在黑暗中储存在4°C，长达一个月，直到进一步分析。 使用具有PL APO 40倍或63倍油目标的协聚焦显微镜获取显微镜图像。为了提高图像质量并缩短采集时间，建议采用顺序图像采集模式。 通过氦-霓虹-激光线首先通过633 nm激发核污渍，并记录其650至715纳米之间的排放。 用阿贡激光在 458 nm 兴奋时记录 FRET 记者的捐赠者（库马林 343）470 至 510 nm。获得感性接受者（5，6-TAMRA）排放在570至610纳米之间，在唯一的捐赠者兴奋后。 使用二极管泵送固态 （DPSS） 激光，在 561 nm 接收者最佳激发时，在 470 至 510 nm 之间的单独通道中记录直接接受器发射。 在实验开始时设置针孔，并在成像过程中保持。注意：由于其体积小，建议使用40倍或63倍显微镜目标来正确可视化嗜中性粒细胞。通常，图像是通过多个连续的渠道获得的，从更长的激发波长开始，以防止记者在采集过程中拍照。 图像至少100个细胞每个条件，以决定性的统计。对于显微镜图像分析，请使用适当的软件：分段单元格并按像素逐像素计算 D/A 比率，然后计算用户手动选择的特定感兴趣区域的平均值或中位数。有关代表性结果，请参阅 图 1。 图1：从 CF 患者痰中分离出的中性粒细胞的膜绑定 NE 活性的代表性图像和定量。 a） 代表共聚焦显微镜图像的嗜中性粒细胞预孵育（顶部面板）10分钟与100μM的西维莱斯特（w/）或离开未经处理（w/o）（底部面板）之前，记者NEmo-2 （2 μM）添加。左侧的第一列显示核污渍，第二列显示捐赠通道，第三列显示接受者通道，最后一列显示按像素分隔捐赠者和接受者通道获得的计算的 D/A 比率。感兴趣区域的边界（单中性粒细胞）被描绘成虚线。表示比例（10 μm）和校准条（D/A比率）。b） 显示具有代表性的 CF 患者痰中性粒细胞的 D/A 比例的盒状图和点图。用抑制剂和未经处理的细胞孵育的细胞分别以灰色和蓝色显示。每个点代表一个细胞（N：w/ 抑制剂 = 113 和 w/o 抑制剂 = 96）。请单击此处查看此图的较大版本。 通过流动细胞测量测量膜绑定 NSP 活动 在 5 mL FACS 聚苯乙烯圆底管中，在 100 μL 的 PBS 中补充 1 x 106 个细胞，并将管子放在冰上。 要门痰嗜中性粒细胞，请使用以下抗体：CD14（1：50）、CD16（1：50）、CD45（1：33）和CD66b（1：50）。为所有样品准备足够的主组合。将主混合物放在黑暗中的冰上。 设置图 2中描述的门控策略。嗜中性粒细胞被封为7AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+事件。然后，将分析封闭事件，以分析其供体（λexc = 405 nm，λem = 450/50 nm）和接受者（λexc = 405 nm，λem = 585/42 nm）的平均荧光强化 （MFI）。 在每个样本中加入 2 μL 的 FcBlock，并在 RT 孵化 5 分钟。 将选定的抗体添加到每个管中，并在黑暗中的冰上孵育30分钟。 通过添加 2 mL 的冷 PBS 和离心机在 300 x g 和 4 °C 下洗涤细胞 5 分钟。 在200μL的冷PBS中丢弃超自然和再补充细胞。 将 200 μL 拆分为两个管，每个管 100μL，并在每个管中添加 5 μL 的细胞生存能力染色溶液。将管子放在冰上。 在负控制 （NC） 试管中添加适当的特定 NSP 抑制剂（用于 NE 使用 Sivelestat，总浓度为 225 μM，用于 CG 在 100 μM 处使用导管素 G 抑制剂 I）。在 RT 中孵化样品 10 分钟。 在样品中加入 100 μL 的冷 PBS，通过干净的 FACS 管中的 40μm 过滤器进行过滤，以防止仪器堵塞。 将报告器（NE，NEmo-2在最终浓度为4μM，CG，mSAM在最终浓度为2μM）添加到NC样本中，轻轻漩涡管。 开始获取用特定抑制剂孵育的细胞，以便在必要时稍微调整门以及记者 PMT 的电压。 记录至少1000个嗜中性粒细胞。将样品保持在室温下。注意：虽然可以记录更多的事件，但 1000 个单元格可确保在适当的统计和记录时间之间达成良好的折衷。 相应地进行以下管（未经处理的痰样）。 要记录膜绑定蛋白酶活性导致的 D/A 比率变化，请每 5 到 10 分钟记录 1000 个来自每个管子的嗜中性粒细胞。注： FRET 记者成功后，捐赠渠道最惠国待遇强度将随着时间的推移而增加。接受者通道最惠国待遇强度应随着时间的推移而降低或保持不变。 通过将捐赠者除以接受者通道值来计算在门控可行单嗜中性粒细胞上测量的样本的 FRET 比率。 通过将样本测量与相应的 0 分钟时间点除以来使样本测量正常化（代表结果和分析请参阅图 2）。注：对于 D/A 比率变化的动态测量，至少需要记录两个时间点（即 0 和 10 分钟）。为了使每个样本的活动测量正常化，在以后的时间点（例如 10 分钟）中测量的 D/A 比率除以探头添加后立即计算的比率（0 分钟）。 图2：从CF患者痰中分离出的中性粒细胞上测量的加丁策略和具有代表性的膜绑定NE活性图。a） 用于门痰嗜中性粒细胞，使用以下抗体：CD14 （1：50）、 CD16 （1：50）、 CD45 （1：33） 和 CD66b （1：50）。嗜中性粒细胞被封为7-AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+事件。门禁事件分析为他们的捐赠者（λexc= 405 nm，λem= 450/50 nm）和接受者 （λexc= 405 nm， λem= 585/42 nm） 均值荧光强化 （MFI）。b） 代表直方图的CF痰中性粒细胞分析其膜绑定NE活性。左列显示供体信号，右列显示接收器信号。上排显示与西维莱斯特（w/）治疗的细胞的平均荧光强化度10分钟，然后再添加记者。下排显示未经处理（w/o）细胞，其记者荧光立即测量（0分钟，灰色）和10分钟（蓝色）后，记者添加。根据小组a.c显示的策略，中性粒细胞被关上门） 数据表显示了一个具有代表性的数据集，包括供体的原始最惠国待遇和接受者信号，这些信号是根据几个时间点（0-3-5-10-15-20 分钟）测量的中性粒细胞的接收信号以及计算的 D/A 比率。D/A 比率可以正常化，即到 0 分钟时间点（白色字体）。0分钟表示记者加入带有染色痰细胞的流管后尽快完成记录。MFI 数据显示为 1000 个嗜中性粒细胞的平均±标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本。