Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes

Jeremy P. Goering; Dona Greta Isai; Andras Czirok; Irfan Saadi

doi:10.3791/62151

JoVE Journal > Developmental Biology

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Gelişim Biyolojisi

Isolement et imagerie en accéléré de cellules de mésenchyme palatales embryonnaires primaires de souris pour analyser les attributs de mouvement collectif

Published: February 13, 2021

doi:

10.3791/62151

Jeremy P. Goering*¹, Dona Greta Isai*¹, Andras Czirok^1,2, Irfan Saadi¹

¹Anatomi ve Hücre Biyolojisi Anabilim Dalı,University of Kansas Medical Center, ²Department of Biological Physics,Eotvos University

Özet

Nous présentons un protocole d’isolement et de culture de cellules mésenchymateuses palatales embryonnaires primaires de souris pour l’imagerie en accéléré de la croissance bidimensionnelle (2D) et des tests de réparation des plaies. Nous fournissons également la méthodologie d’analyse des données d’imagerie time-lapse afin de déterminer la formation de flux cellulaire et la motilité directionnelle.

Abstract

Le développement du palais est un processus dynamique, qui implique la croissance verticale des étagères palatines bilatérales à côté de la langue, suivie d’une élévation et d’une fusion au-dessus de la langue. Les défauts de ce processus entraînent une fente palatine, une anomalie congénitale courante. Des études récentes ont montré que l’élévation de la plate-forme palatale implique un processus de remodelage qui transforme l’orientation de l’étagère d’une verticale à une horizontale. Le rôle des cellules mésenchymateuses du plateau palatal dans ce remodelage dynamique a été difficile à étudier. L’analyse quantitative basée sur l’imagerie time-lapse a récemment été utilisée pour montrer que les cellules mésenchymateuses palatales embryonnaires primaires de souris (MEPM) peuvent s’auto-organiser en un mouvement collectif. Des analyses quantitatives ont pu identifier des différences dans les cellules MEPM mutantes à partir d’un modèle murin présentant des défauts d’élévation du palais. Cet article décrit des méthodes pour isoler et mettre en culture des cellules MEPM à partir d’embryons E13.5 – spécifiquement pour l’imagerie time-lapse – et pour déterminer divers attributs cellulaires du mouvement collectif, y compris des mesures de formation de flux, d’alignement de forme et de persistance de la direction. Il postule que les cellules MEPM peuvent servir de modèle proxy pour étudier le rôle du mésenchyme du plateau palatal pendant le processus dynamique d’élévation. Ces méthodes quantitatives permettront aux chercheurs dans le domaine craniofacial d’évaluer et de comparer les attributs de mouvement collectif dans les cellules témoins et mutantes, ce qui améliorera la compréhension du remodelage mésenchymateux pendant l’élévation du plateau palatal. De plus, les cellules MEPM fournissent un modèle cellulaire mésenchymateux rare pour l’étude du mouvement cellulaire collectif en général.

Introduction

Le développement du palais a été largement étudié car les défauts de la palatogenèse conduisent à une fente palatine – une anomalie congénitale courante qui survient dans des cas isolés ou dans le cadre de centaines de syndromes¹^,². Le développement du palais embryonnaire est un processus dynamique qui implique le mouvement et la fusion du tissu embryonnaire. Ce processus peut être divisé en quatre étapes principales: 1) induction des étagères palatales, 2) croissance verticale des étagères palatales à côté de la langue, 3) élévation des étagères palatales au-dessus de la langue et 4) fusion des étagères palatales à la ligne médiane¹^,³^,⁴. Au cours des dernières décennies, de nombreux mutants de souris ont été identifiés qui manifestent une fente palatine⁵^,⁶^,⁷^,⁸. La caractérisation de ces modèles a révélé des défauts dans les étapes d’induction, de prolifération et de fusion du plateau palatal; cependant, les défauts d’élévation de l’étagère palatale ont été rares. Ainsi, la compréhension de la dynamique de l’élévation du plateau palatal est un domaine de recherche intrigant.

Une analyse minutieuse de certains mutants de souris présentant des défauts d’élévation de la plate-forme palatine a conduit au modèle actuel montrant que la région très antérieure de la tablette palatine semble se retourner, tandis qu’un mouvement vertical à horizontal ou un « remodelage » des étagères palatines se produit dans les régions moyennes à postérieures du palais¹^,³^,⁴^, ⁹^,¹⁰^,¹¹. L’épithélium du bord médial de la plate-forme palatine initie probablement la signalisation requise pour ce remodelage, qui est ensuite entraînée par le mésenchyme de la plate-forme palatine. Récemment, de nombreux chercheurs ont identifié un retard d’élévation du plateau palatal dans des modèles murins qui ont montré des adhérences orales transitoires impliquant des étagères palatales¹²^,¹³. Le remodelage mésenchymateux implique une réorganisation des cellules pour créer un renflement dans la direction horizontale, tout en rétractant simultanément la plate-forme palatine dans la direction verticale⁹^,¹⁰^,¹⁴. Parmi les nombreux mécanismes proposés pour affecter l’élévation du plateau palatal et le remodelage mésenchymateux sous-jacent figurent la prolifération cellulaire¹⁵^,¹⁶^,¹⁷, les gradients chimiotactiques¹⁸et les composants de la matrice extracellulaire¹⁹^,²⁰. Une question importante s’est posée : le retard d’élévation du plateau palatal observé chez les souris déficientes en Specc1l est-ilégalement dû en partie à un défaut de remodelage du plateau palatal, et ce défaut de remodelage pourrait-il se manifester par un défaut intrinsèque de comportement des cellules MEPM primaires²¹?

Les cellules MEPM primaires ont été utilisées dans le domaine craniofacial pour de nombreuses études impliquant^{l’expression}^{génique 22},²³^,²⁴^,25^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹, et quelques-unes impliquant la prolifération³⁰^,³¹ et la migration²⁵^,³¹^,³² , mais aucun pour l’analyse collective du comportement cellulaire. L’imagerie en accéléré des cellules MEPM a été réalisée dans des tests de culture 2D et de réparation des plaies pour montrer que les cellules MEPM présentaient un mouvement directionnel et formaient des flux cellulaires dépendants de la densité – attributs du mouvement collectif²¹. De plus, les cellules mutantes Specc1l formaient des flux cellulaires plus étroits et présentaient des trajectoires de migration cellulaire très variables. Ce manque de motilité coordonnée est considéré comme contribue au retard d’élévation du palais chez les embryons mutants Specc1l ¹³^,²¹. Ainsi, ces essais relativement simples utilisant des cellules MEPM primaires peuvent servir de proxy pour l’étude du remodelage mésenchymateux pendant l’élévation du plateau palatal. Cet article décrit l’isolement et la culture des cellules MEPM primaires, ainsi que l’imagerie et l’analyse en accéléré, pour les tests 2D et de réparation des plaies.

Protocol

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été réalisées avec un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de kumc, conformément à leurs lignes directrices et règlements (numéro de protocole: 2018-2447). 1. Récolter des embryons E13.5 Euthanasier les souris femelles gravides à l’aide d’une chambre d’inhalation de CO2 ou par une procédure approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisa…

Representative Results

La dissection des étagères palatales est illustrée à la figure 1. La séquence d’incisions est conçue pour minimiser le glissement du tissu. Après le retrait de la tête (Figure 1A, B), la mâchoire inférieure est retirée ( Figure1B, C). L’incision de la partie supérieure de la tête (Figure 1C, D) est faite pour stabiliser le tissu lorsqu?…

Discussion

L’élévation du plateau palatal constitue un événement de remodelage vertical à horizontal¹^,³^,⁴^,⁹^,¹¹. Il est postulé que ce processus de remodelage nécessite que les cellules mésenchymateuses du plateau palatal se comportent de manière coordonnée. Les analyses avec des cellules MEPM de type sauvage montrent que ce comportement cellulaire est intrins…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce projet a été soutenu en partie par les subventions des National Institutes of Health DE026172 (I.S.) et GM102801 (A.C.). I.S. a également été soutenu en partie par la subvention du Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), la subvention du Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) et la subvention du Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).

Materials

Beaker, 250 mL (x2)	Fisher Scientific	FB-100-250
CO₂	Matheson Gas	UN1013
Conical tubes, 15 mL (x1)	Midwest Scientific	C15B
Debian operating system			computational analysis of time-lapse images
Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate	Cytiva Life Sciences	SH30243.01
EtOH, 100%	Decon Laboratories	2701
EVOS FL Auto	ThermoFisher Scientific	AMAFD1000
EVOS Onstage Incubator	ThermoFisher Scientific	AMC1000
EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates	ThermoFisher Scientific	AMEPVH028
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2)	Fine Science Tools	11295-10	Dissection
Instrument sterilizer bead bath	Fine Science Tools	18000-45
Microcetrifuge tubes, 1.5mL	Avant	2925
Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight	Roboz	RS-5910	Dissection
NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes	ThermoFisher Scientific	R37605
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Silicone Insert, 2-well	Ibidi	80209
Small Perforated Stainless Steel Spoon	Fine Science Tools	MC17C	Dissection
Spring Scissors, 4 mm	Fine Science Tools	15018-10
Sterile 10 cm dishe(s)	Corning	430293
Sterile 12-well plate(s)	PR1MA	667512
Sterile 6-well plate(s)	Thermo Fisher Scientific	140675
Sterile PBS	Corning	21-031-CV
Sterile plastic bulb transfer pipette	ThermoFisher Scientific	202-1S
Trypsin, 0.25%	ThermoFisher Scientific	25200056

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Etiketler

Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells Time-lapse Imaging Collective Movement Attributes Palatal Shelf Elevation Craniofacial Field Mesenchymal Remodeling Embryonic Day 13.5 Palatal Shell MEPM Culture Medium Fine Forceps Stainless Steel Scissors Cell Isolation

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Bu Makaleden Alıntı Yapın

Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes. J. Vis. Exp. (168), e62151, doi:10.3791/62151 (2021).