Kolektif Hareket Niteliklerini Analiz Etmek için Birincil Fare Embriyonik Palatal Mezenkim Hücrelerinin İzolasyonu ve Zaman Atlamalı Görüntülenmesi
Özet
İki boyutlu (2D) büyüme ve yara onarım testlerinin hızlandırılmış görüntülemesi için primer fare embriyonik palatal mezenkimal hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol sunuyoruz. Ayrıca hücre akışı oluşumunu ve yönlü hareketliliği belirlemek için zaman atlamalı görüntüleme verilerinin analizi için metodoloji sağlıyoruz.
Abstract
Damak gelişiminin gelişimi, dilin yanındaki bilateral damak raflarının dikey büyümesini ve ardından dilin üzerinde yükselme ve füzyonu içeren dinamik bir süreçtir. Bu süreçteki kusurlar, yaygın bir doğum kusuru olan yarık damağa yol açar. Son çalışmalar, palatal raf yüksekliğinin, rafın yönünü dikeyden yataya dönüştüren bir yeniden şekillendirme işlemi içerdiğini göstermiştir. Bu dinamik tadilatta palatal raf mezenkimal hücrelerin rolü üzerinde çalışmak zor olmuştur. Zaman atlamalı görüntüleme tabanlı nicel analiz son zamanlarda primer fare embriyonik palatal mezenkimal (MEPM) hücrelerinin kendi kendine kolektif bir harekete dönüşebileceğini göstermek için kullanılmaktadır. Nicel analizler, mutant MEPM hücrelerindeki farklılıkları damak yükselme kusurları olan bir fare modelinden belirleyebilir. Bu makalede, MEPM hücrelerini E13.5 embriyolarından izole etme ve kültürleme yöntemleri açıklanmaktadır- özellikle zaman atlamalı görüntüleme için- ve akış oluşumu, şekil hizalaması ve yönün kalıcılığı için önlemler de dahil olmak üzere kolektif hareketin çeşitli hücresel özelliklerini belirlemek. MEPM hücrelerinin dinamik yükselme sürecinde palatal raf mezenkiminin rolünü incelemek için bir proxy modeli olarak hizmet edebileceği öne sunun. Bu nicel yöntemler, kraniofasiyal alandaki araştırmacıların kontrol ve mutant hücrelerdeki kolektif hareket niteliklerini değerlendirmelerine ve karşılaştırmalarına izin verecek ve bu da palatal raf yükselmesi sırasında mezenkimal yeniden şekillendirmenin anlaşılmasını artıracaktır. Ayrıca, MEPM hücreleri genel olarak kolektif hücre hareketinin araştırılması için nadir bir mezenkimal hücre modeli sağlar.
Introduction
Damak gelişimi, palatogenezdeki kusurlar, izole vakalarda veya yüzlerce sendromun bir parçası olarak ortaya çıkan yarık damak-yaygın bir doğum kusuru olduğu için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir1,2. Embriyonik damak gelişimi embriyonik dokunun hareketini ve füzyonunu içeren dinamik bir süreçtir. Bu işlem dört ana adıma ayrılabilir: 1) palatal rafların indüksiyonu, 2) dilin yanındaki palat raflarının dikey büyümesi, 3) dil üzerindeki palat raflarının yükselmesi ve 4) orta çizgideki palatal rafların füzyonu1,3,4. Son birkaç on yılda, yarık damak 5 ,6,7,8. Bu modellerin karakterizasyonu palatal raf indüksiyonu, çoğalma ve füzyon adımlarında kusurlar olduğunu belirtmiştir; ancak, palatal raf yükselmesi kusurları nadirdir. Bu nedenle, damak raf yüksekliğinin dinamiklerini anlamak ilgi çekici bir araştırma alanıdır.
Palatal raf yükselmesi kusurları olan bazı fare mutantlarının dikkatli analizi, mevcut modelin palatal rafın çok ön bölgesinin yukarı doğru çevrildiğini gösterirken, damak1,3,4’ünorta kısmında yatay hareket veya palat raflarının “yeniden şekillendirilme” meydana geldiğinigösterdi. 9,10,11. Palatal rafın medial kenar epitelleri, daha sonra palatal raf mezenkim tarafından sürülen bu tadilat için gerekli sinyalizasyonu başlatır. Son zamanlarda, birçok araştırmacı palatal rafları içeren geçici oral yapışıklıklar gösteren fare modellerinde palatal raf yükselmesi gecikmesi tespit etti12,13. Mezenkimal remodeling, hücrelerin yatay yönde bir şişkinlik oluşturmak için yeniden düzenlenmesini içerirken, aynı zamanda palatal rafı dikey yönde geri çekme9,10,14. Palatal raf yüksekliğini ve altta yatan mezenkimal remodeling’i etkilemek için önerilen çeşitli mekanizmalar arasında hücre çoğalması15,16,17, kemotaktik gradyanlar18ve hücre dışı matris bileşenleri19,20vardır. Önemli bir soru ortaya çıktı: Specc1leksikliği olan farelerde gözlenen palatal raf yükselme gecikmesi de kısmen palatal raf tadilatındaki bir kusurdan kaynaklanıyor mu ve bu tadilat kusuru birincil MEPM hücrelerinin davranışında içsel bir kusurda ortaya çıkabilirmi 21?
Birincil MEPM hücreleri kraniyofasiyal alanda gen ekspresyasyonu22 , 23,24,25,26,27,28,29ve çoğalma 30,31ve göç 25,31 ,32 içeren birçok çalışma için kullanılmıştır. , ancak kolektif hücre davranışı analizi için yok. MEPM hücrelerinin zaman atlamalı görüntülemesi, MEPM hücrelerinin yönlü hareket gösterdiğini ve toplu hareketin yoğunluğa bağlı hücre akışlarını oluşturduğunu göstermek için 2B kültür ve yara onarım tahlillerindegerçekleştirildi 21. Ayrıca, Specc1l mutant hücreleri daha dar hücre akışları oluşturdu ve oldukça değişken hücre göç yörüngeleri gösterdi. Bu koordineli hareketlilik eksikliği Specc1l mutant embriyolarında damak yükselmesi gecikmesine katkıda bulunmak için kabul edilir13,21. Bu nedenle, birincil MEPM hücrelerini kullanan bu nispeten basit tahliller, palatal raf yüksekliği sırasında mezenkimal remodeling’i incelemek için bir proxy görevi görebilebilir. Bu makalede, birincil MEPM hücrelerinin izolasyonu ve kültürünün yanı sıra 2B ve yara onarım tahlilleri için zaman atlamalı görüntüleme ve analiz açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Palatal raf yüksekliği dikeyden yataya yeniden şekillendirme olayı1, 3,4,9,11oluşturur. Bu tadilat işleminin palatal raf mezenkimal hücrelerin koordineli davranmasını gerektirdiği açıktır. Wildtype MEPM hücreleri ile yapılan analizler, bu hücre davranışının içsel olduğunu ve21. Bu nedenle, bu tahliller, yarık dama…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri TARAFıNDAN DE026172 (I.S.) ve GM102801 (A.C.) hibeleri tarafından desteklendi. I.S. ayrıca kısmen Biyomedikal Araştırma Mükemmelliği Merkezi (COBRE) hibesi (Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü P20 GM104936), Kansas IDeA Biyomedikal Araştırma Mükemmellik Ağı hibesi (Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü P20 GM103418) ve Kansas Entelektüel ve Gelişimsel Engelliler Araştırma Merkezi (KIDDRC) hibesi (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development) tarafından desteklendi. HD090216).
Materials
| Beaker, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| Conical tubes, 15 mL (x1) | Midwest Scientific | C15B | |
| Debian operating system | computational analysis of time-lapse images | ||
| Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS Onstage Incubator | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | Dissection |
| Instrument sterilizer bead bath | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microcetrifuge tubes, 1.5mL | Avant | 2925 | |
| Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight | Roboz | RS-5910 | Dissection |
| NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Silicone Insert, 2-well | Ibidi | 80209 | |
| Small Perforated Stainless Steel Spoon | Fine Science Tools | MC17C | Dissection |
| Spring Scissors, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile 10 cm dishe(s) | Corning | 430293 | |
| Sterile 12-well plate(s) | PR1MA | 667512 | |
| Sterile 6-well plate(s) | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Sterile PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sterile plastic bulb transfer pipette | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| Trypsin, 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
Referanslar
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
- Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
- Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
- Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
- Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
- Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
- Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
- Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
- Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
- Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
- Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
- Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
- Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
- Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
- He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Gelişim Biyolojisi. 457 (1), 57-68 (2020).
- Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
- Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
- Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
- Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
- Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
- Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
- Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
- Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
- Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
- He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
- Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
- Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
- Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
- Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, 2840-2848 (2014).
- Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
- Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
- Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
- Soderholm, J., Heald, R. Scratch n’ screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
- Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
- Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , (2021).
