位点导向 的φC31介导的疟疾 按蚊 载体中的整合和盒式交换

注：图 2所示协议的工作流程示意图。 1. φC31 attB 标记质粒的设计（图3） 创建携带以下基本成分的 attB 供体质粒 显性荧光标记物 选择一种启动子来驱动荧光标记物的表达。注意：对于 按蚊 的转基因，荧光标志物通常在 3xP3 启动子39的调节下，其驱动眼睛和神经索的表达。或者，当需要在多个组织中表达时，可以使用 PUBc 启动子5 。使用 3xP3 启动子标记供体质粒和该方案中用作示例的对接线。 选择与接收对接线兼容的荧光蛋白（FP），以便它们易于区分。注意：不要使用对接线路中已经存在的相同标记，并避免同时使用GFP（绿色）/YFP（黄色）和GFP（绿色）/CFP（青色），因为它们很难可靠地区分。在该协议中用作示例的供体质粒用DsRed或YFP标记，因为它们将被集成到标有CFP的对接线中。 ATTB 重组位点 使用 单个 attB 位点集成转基因盒（单 attB 设计）（图 3A）。 使用 两个倒置的 attB 位点进行RMCE（双attB 设计），其中位点彼此倒置并包围供体DNA模板（图3B）。注意： attB 站点的方向必须与停靠线中存在的 attP 站点的方向兼容。 所需的转基因货物 根据实验的具体目的，使用任何其他期望的特征来整合到蚊子基因组中。在这里，我们描述了抗疟效应分子整合到 An. stephensi 的基因组中，以及GAL4 / UAS系统的组分整合到 An. gambiae 蚊子中。 质粒骨架组分 除用于在细菌中复制质粒的其他基本成分外，还包括体外质粒选择的标志物（即抗生素 耐药基因）。注：质粒骨架将整合到蚊子基因组的单attB 设计中进行整合（图3A），而不会插入RMCE的双attB 设计中（图3B）。 2. 用于显微注射混合物的质粒的制备 注意：这里说明的协议涉及使用两个质粒：一个携带目标转基因的attB标记的供体质粒，以及一个在果蝇Hsp70启动子40的监管下表达φC31整合酶的辅助质粒。 使用不含内毒素的质粒纯化试剂盒纯化供体和辅助质粒。注：对用于注射的最终质粒制剂进行测序，以验证所有组分的完整性。 当重悬于注射缓冲液中时，将适量的两种质粒混合以获得终浓度为350ng / μL供体质粒和150 ng / μL辅助质粒的混合物。注意：在计算必要的混合物体积时，请考虑10-15μL足以满足每天的计划注射，并且DNA可以提前制备并储存在-20°C。 还报告了整合酶辅助质粒浓度为60-500 ng/μL和供体质粒浓度为85-200 ng/μL21，22，26，41。 通过加入0.1体积的3M乙酸钠（pH 5.2）和2.5体积的冰冷100%EtOH和涡旋来沉淀DNA。白色沉淀物应立即可见。具有高度浓缩的初始质粒制剂（即~1μg/μL）可提高沉淀效率。注意：停止点 – 沉淀物可以在-20°C下储存过夜。 在4°C下以15，000× g 离心20分钟，弃去上清液，并用1mL冰冷的70%EtOH洗涤沉淀。 用1mL冰冷的70%EtOH洗涤沉淀，并在室温下以15，000× g 离心5分钟。 丢弃上清液而不干扰沉淀物并风干。 将沉淀重悬于1x注射缓冲液（0.1mM Na3PO4，5mM KCl，pH 7.2，0.22μm过滤器灭菌）中以达到总最终浓度为500ng / μL。注意：假设在沉淀过程中会丢失一些DNA;因此，首先加入较小体积的注射缓冲液，在分光光度计（例如，Nanodrop）上检查浓度，然后添加适当的剩余体积以达到500ng / μL。 确保DNA完全重悬，制备每个10-15μL的等分试样，并将其储存在-20°C。 在注射当天，解冻一个等分试样，并以15，000× g 离心5分钟以除去任何颗粒残留物。注意：去除颗粒的另一种方法是通过0.22μm过滤器过滤溶液。避免注射混合物中存在颗粒残留物，因为它们会导致胚胎显微注射期间针头堵塞。 3. 从 按蚊 对接线显微注射胚胎 在显微注射前72小时从所需的对接线喂养4-7天大的蚊子（即，在星期一和星期二注射，在前一个星期五喂养雌性;在同一周的星期一，星期四和星期五注射喂养雌性）。 在同一天给野生型（WT）蚊子（即具有相同对接线基因组背景的蚊子）供血;这些将是外杂交所必需的。注意：血粉的大小和质量会影响卵子的质量，因此建议始终使用新鲜血液（即 前7天内抽血）。手臂喂养或喂养小鼠可能会增加卵子的质量和数量，但不鼓励使用这些方法。对于人类和动物的使用，需要特定批准的协议。 进行胚胎显微注射 通过以45度角靶向胚胎的后极，在25 mM NaCl42中进行冈比亚胚微注射。有关胚胎收集，对准和显微注射的详细方案，请参阅Pondeville等人.43和Lobo等人.44。 通过以30度角靶向胚胎的后极，在卤烃油中以700：27（2：1）进行 An. stephensi 胚胎显微注射。胚胎收集，对齐和显微注射的详细方案可以在Terenius等人.45 和Lobo等人.44中找到。 注射后立即将鸡蛋转移到装满无菌蒸馏水（pH 7.2）的培养皿中，并将它们恢复到昆虫条件下。 孵化后，每天将G0 幼虫转移到装有盐渍蒸馏水（0.1%滋补盐）的托盘中，并返回蛹。 创纪录的孵化率（即孵化 的幼虫数量/注射的胚胎数量）。注意：胚胎运动有助于孵化，因此温和的旋转是可取的。孵化应在注射后约48小时开始。由于注射可能导致轻微的发育延迟，因此建议继续监测晚孵化幼虫3-4天。 4. 变种人的穿越和筛查 [可选步骤]筛选G0（注射）1龄或2龄幼虫（L1-L2）用于荧光标记物的瞬时表达。 使用细尖玻璃移液器将G0 L1-L2幼虫转移到带有孔的显微镜载玻片上。在每个孔中放置一个幼虫。 使用带有适当滤光片的荧光立体镜来筛选荧光标记物是否存在瞬态表达。注意：瞬时表达的模式由所使用的启动子决定。当使用3xP3启动子时，荧光标记物的瞬时表达在肛门乳头中可见（参见Pinderville等人的图6. 后 G0 阳性个体单独。 在立体镜下按性别对G0 蛹进行排序52。 让雄性以3-5个（创始人家庭）为一组，在单独的笼子里出现，并增加10倍的年龄匹配的WT雌性。注意：由于雄性多次交配，因此重要的是提供过量的WT雌性，以最大限度地提高每个雄性的交配机会。 让雌性以10-15（创始人家庭）为一组，在单独的笼子中出现，并添加相同数量的年龄匹配的WT雄性。注意：如果昆虫的空间有限，雌性可以一起出现在一个笼子里。男女比例可以低至1男3女。 允许成年人交配4-5天，并为女性提供血粉。注意：多次从G0 雌性中进血和收集卵子，以最大限度地提高从多个淋巴结周期中获得转化者的机会。 同时为WT个体提供血液喂养以进行异型杂交。 收集鸡蛋并饲养新兴的下一代G1。 筛选 G1 L3-L4 幼虫以形成适当的荧光以识别转化子。 在衬有滤纸的培养皿中收集幼虫，或使用荧光立体镜在显微镜载玻片和屏幕上收集幼虫，该荧光立体镜具有适当的过滤器，以显示随 attB标签货物引入的标记物的存在。注意：由 3xP3 启动子驱动的荧光在所有胚胎后阶段都是可见的，并且可以对较年轻的幼虫进行筛选，但是这些幼虫更脆弱，必须相对小心地处理。蛹也可以进行筛查。 对于单 attB 设计，用于集成屏幕，用于存在新的和预先存在的标记;它们都应该存在，因为新盒插入到原始盒旁边（图3A， 图4）。注：筛选单个 attB 设计的异常：使用无标记对接线22 时，仅筛选是否存在新标记。当使用对接线时，如果积分导致预先存在的标记21失活，请筛选是否存在新标记和丢失预先存在的标记。 对于 RMCE 的双 attB 设计，筛选是否存在新标记和丢失预先存在的标记，应仅存在新引入的标记，因为新盒取代了原始盒（图 3B， 图 5）。注意：在RMCE实验中，偶尔的整合事件可以恢复，其中只有一个attP重新组合，因此两个标记物都将存在。G1个体的筛查也可以按照相同的程序在蛹阶段进行52。 转移将G1 个体转化为幼虫托盘并后部到蛹。丢弃非荧光个体和具有意外标记表达模式的个体。 按性别对转化的G1 蛹进行分类，并与异性年龄匹配的WT个体 集体 交叉。 让成虫交配4-5天，提供血粉，收集卵子，并饲养下一代G2 后代。 对于单次整合实验，直接从 集体 交叉收集卵子，因为所有个体的整合位点是相同的。 对于RMCE实验，从单个雌性收集卵子并保持后代分离，直到分子评估完成，因为可能存在两个替代的盒取向（图3B）。 筛选G2 后代（在幼虫或蛹阶段）是否存在荧光标记物（预计50%的个体为阳性），丢弃非荧光后代。 留出一部分G2 阳性个体进行分子分析，其余部分留到成年期。注意：如果必须保持所有G2 个体的存活，则可以对单个成年人的腿进行分子分析46 或蛹病例DNA提取（L. Grigoraki个人通信）。或者，可以在所有G2 个体产卵和卵孵化后进行分子分析。 允许成年雄性和雌性在同一笼子中杂交，以建立新的转基因品系。注意：对于RMCE实验，成年杂交必须发生在来自单个雌性的兄弟姐妹之间，直到通过分子分析确定插入的方向。 5. 通过DNA扩增（PCR）对插入位点进行分子验证 准备转化后对接线基因组中预测的插入位点的图谱。 单次整合：确保预测的插入位点携带原始对接结构以及两个杂交位点 attL 和 attR 之间的供体质粒的整个序列（图3A）。 RMCE：确保预测的插入站点与对接线的插入站点相同，其中混合倒置 attL 站点替换原始倒置 attP 站点，交换模板替换它们之间最初存在的盒式磁带（图 3B）。 设计寡核苷酸引物以扩增整合位点两侧的插入连接。 单一整合：设计跨越 attR 和/或 attL 位点的寡核苷酸引物对。一个引物必须与先前集成的对接结构结合，另一个引物必须与新集成的转基因结合（图3A）。 RMCE：盒式替换可以相对于染色体（指定为A和B）以 两种不同的方向 发生。设计4种寡核苷酸引物的替代组合，仅在其中一个取向中给出离散产物，其中一对用于定向A，另一对用于定向B（图3B， 图6）。 从G2 阳性个体中提取基因组DNA，并执行诊断性PCR和凝胶电泳，以从预测的整合位点图中可视化预期诊断扩增子的存在。注意：DNA也可以从单个成年人的腿中提取46 或蛹病例（L. Grigoraki个人交流）。 对PCR产品进行测序以确认预期的序列。 图 2.按蚊中定点性φC31基因组修饰的工作流程图。请点击此处查看此图的放大版本。 图 3.φC31介导的单积分（A）和RMCE（B）的分子基础。 A）在携带单个attP位点并用CFP标记的An. stephensi对接线（80.9，表1）中的基因组插入示意图，单attB设计供体质粒标有DsRed（中间），以及成功整合后产生的预期插入位点（底部）。B）在携带两个倒置attP位点并用CFP标记的冈比亚锥形对接线（A11，表1）中的基因组插入示意图，标有YFP（中间）的双attB设计供体质粒以及成功RMCE后产生的预期插入位点（底部）。波浪线：蚊子基因组;条纹箭头：小猪Bac转座臂;3xP3：荧光标记物的启动子;SV40： 病毒终结者;Ori：复制的起源;AmpR：氨苄西林抗性基因。交叉线表示 attP 和 attB 站点之间重组的站点。编号的黑色箭头代表用于插入位点的分子验证的引物结合位点（方案的步骤5）。作者可根据要求提供完全注释的单质粒和双 attB 标记质粒。请点击此处查看此图的放大版本。