Un sistema di purificazione delle proteine ad alta produttività economico e versatile che utilizza un adattatore a piastre multi-colonna

Le tecniche di purificazione delle proteine per ottenere quantità di milligrammi di proteine purificate sono imperative per la loro caratterizzazione e analisi, specialmente per metodi biofisici come nmr. La purificazione delle proteine è centrale anche in altre aree di studio come i processi di scoperta di farmaci e gli studi di interazione proteina-proteina; tuttavia, il raggiungimento di tali quantità di proteine pure può diventare un collo di bottiglia per queste^{tecniche 1,2,3}. Il metodo principale per la purificazione delle proteine è la cromatografia, che include una varietà di metodi che si basano sulle caratteristiche individuali delle proteine e sui loro tag. Nella cromatografia di affinità, le proteine hanno un motivo proteico o peptidico aggiuntivo che funziona come un tag che ha un’affinità per un certo substrato sulla resina cromatografica⁴. Il metodo di affinità più comune è la cromatografia di affinità metallica immobilizzata (IMAC) usando proteine con tag His, mentre un altro metodo popolare è la cromatografia a scambio ionico che separa le proteine in base alla loro carica. Per la massima purezza, una combinazione di cromatografia di affinità e scambio ionico viene spesso utilizzata insieme, di solito richiedendo costose attrezzature da laboratorio per un’elevata produttività.

L’era in evoluzione della proteomica funzionale sta alimentando la domanda di tecniche ad alta produttività per purificare proteine non singolari per analisi specifiche ma un gran numero di proteine contemporaneamente per analisi complete e studi a livello genomico⁵. La cromatografia ad affinità metallica immobilizzata (IMAC) è uno dei metodi più utilizzati per la purificazione delle proteine ad alto contenuto^{di produttività 6,7 ma}i suoi sistemi automatizzati sono costosi e inaccessibili per i laboratori più^{piccoli 8.} Le alternative più convenienti basate su lastre attualmente disponibili utilizzano l’uso di apparecchiature accessibili basate su laboratorio, come il vuoto. Sebbene questi metodi siano riusciti a migliorare la velocità di purificazione, possono ottenere solo una purificazione ad alta produttività su scala più piccola, producendo solo proteine nell’intervallo dei microgrammi. Queste limitazioni significano che le piastre di filtro precondizione da 96 pozzi (ad esempio, di GE Healthcare ora di proprietà di Cytiva) non possono essere utilizzate prima delle tecniche biofisiche⁹. La cromatografia a gravità è il metodo di purificazione più conveniente; tuttavia, l’impostazione di più colonne è scomoda e può essere soggetta a errori per più proteine.

Un adattatore a piastre multi colonna (MCPA) è stato sviluppato e dimostrato di eseguire con successo e convenientemente colonne di cromatografia di affinità parallela contemporaneamente per purificare i domini SH3 del lievito con tag His-tagged¹⁰. L’MCPA offre un metodo di purificazione ad alta produttività economico che non dipende da costose strumentazioni. Il suo design flessibile può purificare efficacemente milligrammi di proteine da più colonne cromatografiche di affinità sotto gravità o collettore sottovuoto. Inoltre, il tipo di resina, il volume e altri parametri possono essere regolati per ogni singola colonna per un’ottimizzazione più rapida. Questo studio dimostra che la cromatografia a scambio ionico da parte dell’MCPA può essere utilizzata in combinazione con la cromatografia di affinità dall’MCPA per migliorare la purificazione del dominio Abp1 SH3. Inoltre, fino a 24 proteine diverse possono essere separate in parallelo usando questi metodi.