Metabolômica Quantitativa de Saccharomyces Cerevisiae Usando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem

Metabólitos solúveis em água são intermediários de baixo peso molecular e produtos do metabolismo que contribuem para processos celulares essenciais. Esses processos evolutivamente conservados incluem a conversão de nutrientes em energia utilizável, síntese de macromoléculas, crescimento e sinalização celular, controle do ciclo celular, regulação da expressão genética, resposta ao estresse, regulação pós-translacional do metabolismo, manutenção da funcionalidade mitocondrial, tráfico celular vesicular, autofagia, envelhecimento celular e morte celular regulada^1,2,3.

Muitos desses papéis essenciais de metabólitos solúveis em água foram descobertos por estudos na levedura S. cerevisiae^1,3^{,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22}. Este eucariote unicelular é um organismo modelo útil para dissecar mecanismos através dos quais metabólitos solúveis em água contribuem para processos celulares devido à sua comodidade às análises biológicas bioquímicas avançadas, genéticas e moleculares^23,24,25,26. Embora os métodos LC-MS/MS de metabolômica não-direcionada tenham sido utilizados para estudar os papéis de metabólitos solúveis em água em^{leveduras brotantes 3,18,22,27}, este tipo de análise requer a melhoria de sua versatilidade, robustez, sensibilidade e capacidade de distinguir entre diferentes isômeros estruturais e formas estereotipadas desses metabólicos.

Os últimos anos são marcados por avanços significativos na aplicação dos métodos LC-MS/MS de metabolômica não direcionada ao perfil de metabólitos solúveis em água in vivo. No entanto, muitos desafios no uso dessa metodologia permanecem^{2,28,29,30,31,32,33,34,35,36}. Esses desafios incluem o seguinte. Em primeiro lugar, as concentrações intracelulares de muitos metabólitos solúveis em água estão abaixo de um limiar de sensibilidade para os métodos atualmente utilizados. Em segundo lugar, a eficiência da saciamento da atividade metabólica é muito baixa, e a extensão do vazamento celular associado à extinção de metabólitos intracelulares é muito alta para os métodos atuais; portanto, os métodos atualmente utilizados subestimam as concentrações intracelulares de metabólitos solúveis em água. Em terceiro lugar, os métodos existentes não podem diferenciar os isômeros estruturais (ou seja, moléculas com a mesma fórmula química, mas conectividade atômica diferente) ou estereomers (ou seja, moléculas com a mesma fórmula química e conectividade atômica, mas com o arranjo atômico diferente no espaço) de metabólitos específicos; isso impede a anotação correta de certos metabólitos pelos métodos atualmente utilizados. Em quarto lugar, as bases de dados on-line espectrais existentes de íons-pais (MS1) e íons secundários (MS2) estão incompletas; isso afeta a identificação e a quantitação corretas de metabólitos específicos utilizando os dados brutos LC-MS/MS produzidos com a ajuda dos métodos atuais. Em quinto lugar, os métodos existentes não podem usar um único tipo de extração metabólito para recuperar todas ou a maioria das classes de metabólitos solúveis em água. Em sexto lugar, os métodos existentes não podem usar um único tipo da coluna LC para separar-se entre si todas ou a maioria das classes de metabólitos solúveis em água.

Aqui, otimizamos as condições para a extinção da atividade metabólica dentro das células de S. cerevisiae, mantendo a maioria dos metabólitos solúveis em água dentro dessas células antes da extração, e extraindo a maioria das classes de metabólitos solúveis em água de células de levedura. Desenvolvemos um método versátil, robusto e sensível para a identificação e quantificação baseada em LC-MS/MS de mais de 370 metabólitos solúveis em água extraídos de células S. cerevisiae. Este método de metabolomia não-direcionada permite avaliar as concentrações intracelulares de várias moléculas portadoras de energia, nucleotídeos, aminoácidos, monossacarídeos, intermediários de glicólise e intermediários do ciclo tricarboxílico. O método desenvolvido LC-MS/MS permite a identificação e quantificação de diferentes isômeros estruturais e formas estereosméricas de metabólitos solúveis em água com diversas propriedades estruturais, físicas e químicas.