뮤린 곰팡이 패혈증 모델에서 효율적인 꼬리 정맥 주사를위한 현대 온난화 / 억제 장치

꼬리 정맥 주사 및 온난화 /억제 장치의 사용과 관련된 모든 동물 프로토콜은 현지 기관 동물 관리위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인되었습니다. 1. 준비 적어도 1 주 동안 주거 환경에서 동물을 적응하고 음식과 물 광고 리비툼을 허용합니다.참고: 이 주입 기술의 대부분의 새로운 사용자에 대 한, 흰색 또는 밝은 색깔의 모피동물 긴장 꼬리 정맥 피부를 통해 쉽게 볼 수 있는 바람직할 수 있습니다. 쥐의 어두운 색변종 (예를 들어, C57BL/6) 또는 쥐 (예를 들어, 브라운 노르웨이)는 정맥에 대한 약한 색상 대조의 결과로 깊은 색소 꼬리를 가지고있다. 숙련도가 취득할 때까지 새로운 사용자가 적절한 교육을 받는 것이 좋습니다. 꼬리 정맥 주입을위한 에이전트 모든 테스트 에이전트와 솔루션을 무균적으로 준비합니다. 유기체 또는 세포 물질을 투여할 때, 파이로겐이 없는 조건을 유지하기 위해 모든 처리 단계에서 예방 조치를 취하십시오. 일반 식염수(염화나트륨 0.9% w/v)를 사용하거나 인산염 완충식식염수(PBS)와 같은 균형 잡힌 염액을 테일 정맥 주입용 차량으로만 사용하십시오.주의: 혈관 손상의 잠재적 위험으로 인해 물, 오일 또는 점성 솔루션을 사용하지 마십시오. 광범위한 pH(4.5-8.0)는 설치류의 혈액 완충 효과와 빠른 혈류율 때문에 견딜 수 있습니다. 그러나, 고산성 또는 알칼리성 솔루션 은 주사 부위에 불필요한 조직 손상을 초래할 수 있으며 피해야한다. 주입의 부피와 빈도를 최소한으로 제한합니다. 주사 전 체온에서 쥐와 쥐(≤200 μL 및 ≤500 μL)에 권장되는 부피를 사용하여동물3에대한 스트레스를 최소화한다. 주사기와 바늘의 각 준비는 용액의 기포가 없는지 확인하십시오. 거품이 존재하는 경우, 색전증에 대한 위험을 방지하기 위해 완전히 제거.참고: 일반적으로, 1 mL 주사기 와 27 G, 1/2-에 바늘은 대부분의 꼬리 정맥 주사에 대 한 적절 한. 일회용 또는 전용 가운과 라텍스 또는 니트릴 장갑을 최소화할 수 있는 현지 IACUC에서 요구하는 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용하십시오. 꼬리 정맥 주입을 수행 할 때 안전 안경의 사용은 매우 권장됩니다. 온난화 및 구속 장치 기기가 결함이 없는지 확인하기 위해 사용하기 전에 모든 구성 요소를 주의 깊게 검사합니다(그림1). 온난화 장치 초기화(그림 2A) 온난화 장치를 깨끗한 평평한 벤치탑에 놓고 장치에 전원을 공급합니다. 온도 조절기 전원 표시등램프가 녹색으로 켜지는지 확인합니다. 침구 재료를 온난화 챔버 내부에 배치하여 이 지역을 건조하게 유지하고 열을 유지합니다. 구속 장치 설정(그림 2B) 데징 유닛을 온난화 장치와 함께 배치하고 동물에 적합한 원뿔 크기를 결정합니다. 필요한 경우 유연한 알루미늄 콘의 기본 폭을 수동으로 조정하여 동물에 적합한 구속을 제공합니다. 또는 콘을 다양한 신체 크기의 마우스 또는 쥐를 수용할 수 있도록 맞춤 장착 모델로 교체하십시오. 2. 꼬리 정맥 주입 장치 조정 내부 온도 설정 컨트롤 다이얼을 사용하여 온도 조절기를 원하는 온도로 설정합니다. 히터 표시등이 빨간색으로 켜지고 전구가 켜지는지 확인합니다. 전구가 켜지는 동안 내부 온도 디스플레이를 주의 깊게 모니터링합니다(가열). 온도 조절기는 목표 온도가 약 10-15분 후에 전구를 자동으로 비활성화합니다.참고: 주변 온도보다 높은 온도를 설정하면 히터가 활성화됩니다. 일반적으로, 표준 vivarium 조건에서 권장되는 하우징 온도는 20~26°C에 이르기까지 다양하며, 실험실 마우스의 중성(즉, 쾌적한) 온도는 30과 32°C42사이로 간주됩니다. 따라서, 온난화 챔버의 내부 온도는 약 32-36 °C에서 열중성보다 약간 높은 것이 좋습니다. 체온 위에 온도 조절기를 설정하지 마십시오. 구속 플랫폼 위치 지정 높이 조정 노브를 사용하여 원뿔 높이를 사용자의 최적의 수준으로 조정합니다. 열처리(그림 3A) 목표 온도(32-36°C)에 도달하면 하우징 케이지에서 동물을 따뜻하게 하는 챔버로 부드럽게 이송합니다.참고: 5-10 분 동안의 열 처리는 혈관 확장을 유도하고 꼬리 정맥의 가시성을 향상시키기에 충분합니다. 그러나, 동물은 절차의 기간 동안 열 조절 챔버에서 안전하게 개최 될 수있다 (일반적으로 20-30 고열증의 흔적없이 분). 온난화 챔버는 안전하게 4-6 마우스 또는 하나의 쥐를 포함 할 수 있습니다. 급성 열 응력의 징후 (예 : 빠른 호흡, 혼수, 점프 탈출 동작)에 대한 동물을 모니터링합니다.주의: 고열증의 징후를 보이는 동물은 케이지로 돌아와 재사용 전에 정상적인 활동을 재개할 때까지 모니터링해야 합니다. 최적의 범위를 초과하는 내부 온도 때문인 경우 온난화 장치가 꺼져 있는지 확인합니다. 사출 단계 꼬리의 기지에 의해 동물을 들어 올려, 온난화 챔버에서 제거합니다. 억제 장치의 원뿔 개구부에 동물을 소개합니다.주의: 꼬리 끝에서 마우스를 들어 올리지 마십시오. 이로 인해 심각한 부상을 초래할 수 있습니다. 취급의 대체 방법은 비만 또는 임신한 마우스(28)를위해 이용되어야 합니다. 동물이 앞다리로 원뿔의 먼 가장자리를 잡으면서 꼬리를 부드럽게 뒤로 당기고 꼬리를 열린 슬릿을 통과합니다. 원뿔의 밑면에 있는 동물의 뒷쪽 끝을 고정하고 원뿔에서 한쪽 뒷다리가 튀어나와 측면 정맥이 12시 의 위치에 표시되도록 합니다. 양쪽 뒷다리는 양쪽에 두 개의 측면 정맥이 있기 때문에 돌출될 수있습니다(그림 3B). 엄지와 집게 손가락 사이의 비 지배적 인 손으로 중간에서 2/3 길이의 꼬리를 잡고 측면 정맥에 약간의 장력을 넣어 꼬리 위치 지정 및 혈관 확장을 유지합니다.참고: 열처리에 의한 팽창된 정맥의 가시성향상을 통해 사용자는 최상의 결과를 위해 주사 부위를 신속하게 결정할 수있습니다(그림 4). 70%의 알코올로 촉촉한 거즈 스폰지 나 패드로 주사 부위의 피부를 닦으부습니다. 꼬리에 자극을 피하기 위해 가능한 한 부드럽고 빠르게 청소하십시오.참고: 이 절차는 기관 IACUC의 재량에 따라 생략할 수 있습니다. 주사기를 우세한 손으로 잡고 바늘을 꼬리에 평행하게 배치합니다. 바늘을 혈류 방향으로 삽입하고, 10-15°각도(도 5A-B)로돌이키고, 2-4mm(그림5C-D)를관통하여 정맥의 루멘으로 더 나아가게 한다. 용액을 천천히 주입하십시오.참고: 주사가 성공하면 플런저에 대한 저항을 느껴야 하며, 액체가 정맥을 통과하는 것을 볼 수 있습니다. 주사 부위 위에 저항또는 백색 물집이 있는 경우, 바늘을 제거하고 원래 바늘 배치 위의 부위에서 두 번째 주사를 시도한다. 유체가 초기 사이트를 통해 방출될 때 초기 주사 부위 아래에 주입을 시도하지 마십시오. 한 측면 정맥의 주입이 실패하는 경우, 반대편에 동물을 재배치하고 반대 정맥에 더 많은 시도를합니다. 시도의 최대 수는 정맥을 따라 시도 된 주입을 시작하는 곳과 놓친 시도로 발생할 수있는 붓기에 따라 달라집니다. 잘못된 주사 및 관련 부상에 대한 기관 IACUC 규정을 참조하십시오. 바늘을 제거하고 엄지 손가락으로 단단히 눌러 주입 된 용액 및 / 또는 혈액의 역류를 방지하십시오. 출혈이 멈출 때까지 깨끗한 거즈/닦아 또는 조직으로 부드러운 압축을 계속 적용합니다(그림6). 동물을 케이지로 돌려보내 최소 5분 동안 모니터링합니다. 동물이 추가 출혈없이 정상적인 활동을 재개하도록하십시오. 3. 곰팡이 혈류 감염 및 패혈증의 뮤린 모델 마우스 균주 기관적으로 추천된 지침당 6주에 달하는 여성 스위스 웹스터 의 쥐를 어기고 있습니다. 또는 변형된 이 프로토콜에 대해 근친/유전자 변형 균주(예: C57BL/6 배경)를 사용하여 수정된 이노쿨라(참고 참조)를 사용합니다.참고 (세부 사항에 대한 토론 참조): 어두운 털을 가진 마우스의 꼬리 정맥은 종종 깊은 색소 꼬리(그림 4)로인해 밝은 모피를 가진 것보다 덜 볼 수 있습니다. 다른 마우스 긴장 중 곰팡이 패혈증 / 치사에 대한 다양한 감수성이 있습니다. 스위스 웹스터 이외의 마우스 균주를 사용하면 호스트 면역 상태에 영향을 줄 수 있는 관련 요인(예: 유전적 배경, 나이, 성별, 신체 크기)을 고려하여 추가 프로토콜 최적화가 필요할 수 있습니다. 예를 들면, C57BL/6 마우스에 있는 치명적인 도전은 전형적으로 스위스 웹스터 마우스에서 보인 사망의 수준을 달성하기 위하여 더 높은 이노쿨라 (최대 10x)를 요구합니다. 미생물 치명적인 도전 (패혈증)의 경우, 칸디다 알비칸스 변형 DAY185 (또는 선택의 변종)의 줄무늬 냉동 주식은 사부라우드 덱스트로스 agar에 2 일 동안 30 °C에서 배양한다. 단일 콜로니를 10mL 효모 추출물-펩톤-덱스트로스 국물로 옮기고, 배양물을 30°C에서 18h의 성장단계로 옮기고 흔들림을 갖는다. 이노큐럼 솔루션 치명적인 도전의 날에, 국물 문화를 수집하고, 멸균 PBS에서 원심 분리 (800 × g)에의해 펠릿을 3 번 세척. 트라이판 블루 염료 배제에 의해 실행 가능한 효모 세포를 식별하고 혈류계를 사용하여 확대합니다. 실온에서 멸균 PBS에서 세포 농도를 1 x 106 셀/mL로 조정합니다.참고: 각 동물은 접종 용액의 100 μL을 받게 됩니다. 주입 시술 중에 잠재적인 손실을 허용하도록 접종(>500 μL)의 초과 부피를 준비합니다. 최종 접종은 마우스 당 1 x 105 세포입니다. 접종 부피는 그에 따라 세포 농도를 조정하여 최대 200 μL까지 증가될 수 있다.주의: 곰팡이 접종 용액은 주입 전에 실온에서 보관해야합니다. 체온에 대한 접종용액을 온난화하는 것은 효모 세포에서 최해로의 형태학적 변화를 유도할 수 있다. 반대로, 감기 솔루션의 bolus i.v 투여는 동물의 체온을 급속히 낮출 수 있으며 피해야 합니다. 정맥 예방 접종 동물을 따뜻하게 하고, 2절의 절차를 따라 혈관 확장을 유도한다. 27 G, 1/2인치 바늘을 사용하여 1mL 주사기를 사용하여 비통용액의 100 μL을 꼬리 정맥에 주입합니다. 접종 후 모니터링 패혈증으로 인한 이환율의 다음 징후: i) 모피 양태(예:, 매끄럽고, 주름진), ii) 활동 (예를 들어, 자유롭게 이동, 응답하지 않음), iii) 자세 (예를 들어, 구직, 뻣뻣함), iv) 행동 (예를 들어, 느리고, 재배치 없음), v) 가슴 움직임 (예를 들어, 정상적인 호흡, dyspnea), vi) 눈꺼풀 (예를 들어, 개방, 폐쇄)43. 패혈증 득점 각 범주에서 0에서 3까지 4점 채점 척도에서 패혈증(M-CASS)에 대한 수정된 마우스 임상 평가 점수에 따라 관찰된 이환율을 점수: 0, 보통; 1, 온화한; 2, 중간; 3, 심한43. 선택적 프로토콜: 곰팡이 패혈증 예방 접종 치명적인 도전 14 일 전에, 칸디다 더블린시스 균주 Wü284 또는 감쇠 C. 알비칸균균을 가진 접종 마우스, Δefg1/Δcph1 돌연변이체 (마우스 당 1×105 세포), 섹션에 설명 된 바와 같이 3.2-3.4 C. albicans DAY15. 3.2-3.4항에 설명된 바와 같이 예방 접종된 마우스에서 치명적인 도전을 수행하고, 3.5-3.6항에 기재된 패혈증 유발 이환율의 징후를 모니터링한다.