ライブイメージングのためのフィブリン・クロッツによる ショウジョウバエ 組織固定化の応用

1. 試薬の調製 注: このプロトコルのすべての手順は、特に説明がない限り、室温で実行されます。 1x PBS-BSA(0.1%w/v)の溶液を調製するために、1mgの牛血清アルブミン(BSA)をPBSの1mLに溶解する。トロンビン1,000ユニット・mL-1のストック溶液を準備するには、1,000単位のトロンビンをPBS-BSAの1mL(0.1%w/v)に溶解させます。10 μLのアリコートを作成し、-20°Cで4ヶ月間保存します。 ショウジョウバエ脳用の培地を調製し、1Gのグルコースを無菌状態でシュナイダー培地の1Lに溶解する。4 °Cで3ヶ月間フィルターして保管してください。 フィブリノーゲン溶液を調製するには、1mLの培養培地に10mgのフィブリノーゲンを室温で20分間、または37°Cで5分間溶解する。注:ステップ1.2で調製したものとは異なる培養培地が使用され、Fibrin血栓がこのステップで既に形成されている場合、培養培地には活性トロンビンが含まれている可能性が高く、事前に不活性化する必要があります。トロンビンの可能性が高いソースは胎児の牛の血清であり、血清を56°Cに加熱して30分間不活性化することができる。 PBS-BSA(5%w/v)のコーティング溶液を調製し、1xPBSの1mLに50mgの牛血清アルブミン(BSA)を溶解する。 ステップ4で使用した試薬例については、1mg NAPP1を315μLのジメチルスルホキシドに溶解して10mM NAPP1のストック溶液を調製する。 2. ショ ウジョウバエ 幼虫脳の解剖 注: この手順は、両眼解剖の下で実行します。 ブラシを使用して、L3幼虫をPBSを含む9ウェルホウケイ酸ガラス皿に移します。幼虫からフライフードのほとんどを取り外し、別のよく含まれる培養培地に移すためにかき混ぜます。 鉗子(例えば、デュモン#55)を使用して、体の長さの中央にある幼虫を全径にわたって把握します( 図1A,Bを参照)。幼虫を保持しながら、200μLの新鮮な培養培地を含むホウケイ酸プレートの別のウェルに移します。 幼虫を解放しないでください。幼虫を全径(図1B)で半分に切る場合は、鉗子の先端(図1A、上パネル)の横移動でつかんだ領域を粉砕するか、幼虫を保持する2つの鉗子先端の間に別の鉗子の1つの先端をスライドさせる(図1A、下パネル)。幼虫を四肢の1つを引っ張って半分に切らないでください, それは体の長さを横切る神経を介してそれを引っ張ることによって脳を損傷する可能性があります ( 図 1Bの赤い線). 鉗子を使って幼虫をキューティクルで保持し、別の鉗子を使って、脳を引っ張らずにキューティクルを剥がす(図1C)。図 1Dに示すように、脳から出る神経が見え、脳と口の部分をつなぐ器官にアクセスできるまで繰り返します。 脳から生じる神経を保持するために鉗子を使用してください。他の鉗子のペアでは、図1Aに示す技術のいずれかを使用して、脳と口の部分との間の接続を切断し、脳を残りのキューティクルから分離する(図1D)。 鉗子を使用して、腹側神経コードから出てくる軸索によって脳を保持します。 図1E に灰色で描かれた器官を、脳からそっと引き離して摘み取ります。注:目/アンテナの想像力ディスク(濃い黄色)を引っ張って脳から取り外しないでください。これらの組織間の接続は、脳を損傷することなく引っ張ることによって壊れるには堅牢すぎます。 脳を保持し、向きに神経を保持しながら、他の鉗子のペアと目/アンテナの想像力ディスク(濃い黄色)と脳の間の接続を把握する(図1F)。図1Aに示すいずれかの技術を使用して、脳を引っ張らずにこの接続を切断します。脳が他の組織(図1G)を適切にクリアし、損傷していないかどうかを確認する(図1H)。損傷の兆候を示す場合は、脳を破棄します。 ピペットチップを塗布するためにP20を入れ、および出してコーティング溶液をピペット。コーティングされた先端を3 μLの培地(図2A、左)と共に脳にピペットし、200μLのクリーンな培養培地を含む別のウェルにピペットアウトする。 十分な脳が解剖されるまで、ステップ2.2〜2.8を繰り返し、時折解剖が行われる井戸の培養培地を置き換えます。 図1:D.メラノガスター幼虫脳の解剖。(A)鉗子を使用して引っ張らずに切断する技術。サンプル(淡い緑色)は、鉗子の先端(上パネル)の間に接地されるか、サンプル(下部パネル)を保持する鉗子の先端に沿って鉗子の先端を動かすことによって切断することができる。(B–F)幼虫の脳を損傷することなく隔離するためのステップ(テキストを参照)。赤:脳。濃い黄色:目/アンテナディスク。青のテキスト: 対応する鉗子で実行するアクション。(G) 目に見える損傷のない孤立した脳の外観。Dは裏側、Vは側面図の側である。(H) 解剖中に脳を過度に引っ張ることによって引き起こされる一般的な損傷。トップパネル:腹側神経コードの剥離。ボトムパネル:ローブの変形。後部は左、前は全パネルで右です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 3. フィブリンの血栓が付いているカバースリップの固定化 注: この手順は、両眼解剖の下で実行します。 ステップ2.8のようにコーティングされた先端を有するP20ピペットを使用して、200μLの培養培地+フィブリノーゲンを含むホウケイ酸プレートの別のウェルに解剖された脳を移す(図2A)。 9 μLの培養培地+ フィブリノーゲンと共に1つの脳内のピペット。先端の端部が35mm細胞培養皿のカバーガラス底部にほとんど触れると、培養培地がピペット先端を出た直後にカバースリップに触れ、脳と培地が先端の側面にスライドしないように、脳に損傷を与える可能性がある内容物(培養培地と脳)をピペットアウトする( 図2A)。 一対の鉗子または閉じた鉗子の1つの先端を使用して、脳を穏やかに押し、培養培地+フィブリノーゲンの低下の中に位置付ける。注:開いた鉗子でドロップをタッチすると、培養培地が鉗子の先端の間の毛細血管によって引っ張られる可能性があります(図2B)。 脳の腹側部分を画像化する必要がある場合は、以下のようにフィブリノーゲン凝固を誘導して、血栓内の脳を適切に配向させる(図2C)。 脳をドロップの片側に押し込む。P1チップを搭載したP1ピペット、ピペット1μLのトロンビン溶液を備え、ピペットチップで脳の反対側のドロップの端に触れ、トロンビンをピペットアウトします(図2C、最初の図)。 フィブリノーゲンが重合を開始するまで1〜2分待ち、落下の片側に曇りの沈殿物が形成されます(図2C、2番目の図面)。脳をそっと押してフィブリン血栓に「押し込む」と、画像への部分(例えば、腹側)が脳を変形させることなくカバースリップにできるだけ近いことを確認します(図2C、3番目の図面)。 フィブリン血栓に押し込まれていない脳の側面に近いトロンビン溶液のピペットアウト1 μL.(図2C、4番目の図面)。 2番目のフィブリン血栓が設定されるまで2〜3分待ちます(図2C、5番目の図面)。血栓の端を押して、カバースリップに強く付着させ、脳を変形させないように注意してください(図2C、6番目、7番目の図面)。脳がカバースリップから遠すぎるように見える場合は、脳の近くにフィブリン血栓を押すことによってそれを近づけます。 脳の後部を画像化しなければならない場合は、次のようにフィブリン凝固を誘導する(図2D)。 脳をドロップの中央に置き、後ろ側をカバースリップに向けます。薄い先端を備えたP10ピペット、トロンビン溶液のピペット1μLで、ピペット先端で脳の反対側のドロップの端に触れ、トロンビンをピペットアウトします(図2D、最初の描画)。 フィブリノーゲンが重合を開始するまで2〜3分待ち、曇り、繊維状の沈殿物が形成されます(図2D、第2の図面)。血栓の端を押して、カバースリップに強く付着させ、脳を変形させないように注意してください(図2D、3番目、4番目の図面)。 カバースリップ上に複数の血栓サンプルを固定する必要がある場合は、ステップ3.1~3.5を繰り返します。 先端の端部が血栓の上に約0.5cm配置された場合、フィブリノーゲンが血栓の上に滴り落ちることなく、390μLの培養培地を静かにピペット化します(図2B、右ペトリ皿)。カバースリップから脱離する可能性があるため、血栓の側面に培養培地を添加しないでください。 残りのトロンビンを洗い流すために、ピペットを使用して300μlの培養培地を取り除き、300μlのクリーンな培養培地を加え、血栓が完全に浸漬したままであることを確認します。余分なトロンビンを洗い流すために2回繰り返します。 図2:フィブリン血栓を用いたショウジョウバエ幼虫脳の固定化(A)BSAコーティングされたピペットチップを用いて、脳は培養培地(黄色)から培養培地+フィブリノーゲン溶液(オレンジ)に移され、培養培地+フィブリノーゲンの3.5μLとともに培養皿のカバースリップ(水色)にピペット化される。フィブリノーゲン凝固は、トロンビンを添加して、脳を後側または腹側位置に固定化することによって誘導される(DおよびEを参照)。血栓中の確保された脳は、その後フィブリノーゲンなしで培養培地で覆われ、過剰なトロンビンは、培養培地を3回加減することによって除去される。(B) カバースリップ上の培養培地+フィブリノーゲン(オレンジ)の滴下内の脳の位置は、閉じた鉗子の先端でそっと押すか、または1つの鉗子の先端で穏やかに押すことによってのみ調節すべきである。開いた鉗子のペアでドロップに触れると、培養培地が鉗子の先端の間の毛細血管によって引っ張られる可能性があります。(C)腹側を撮像するための幼虫脳の位置決めのステップ(テキスト参照)。(D) 後方を画像化するための幼虫脳の位置決め手順(テキスト参照)。(D) および (E) 緑: トロンビン.ダークオレンジ:フィブリン血栓。淡い青:カバースリップ。青い矢印:血栓を安定させるためにカバースリップに押し付ける血栓のエッジ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 4. ライブイメージング中の試薬の添加 温度変化が焦点の変化を引き起こすのを避けるために、培養皿自体と同じ温度で培養皿に添加する試薬と一緒に溶液を保ち、添加する前に同じ温度に保ちます。環境室が使用されている場合は、チャンバー内に溶液を残します。 文化皿自体を置き換えることなく、培養皿の蓋を取り除きます。取り外しが容易な場合は、35mm皿の蓋をイメージする前に皿の上に逆さまに置きます。 P1000ピペットを使用して、培養皿の中の培養液の表面にピペットチップを近づけ、適切な量の試薬溶液を適度に放出して、所望の試薬濃度(例えば、20μM NAPP1の溶液の400 μLを400 μLにして最終濃度10μMNAPP1)、血栓を取り外すことができる強いフラックスを発生させることなく。 培養皿内で溶液を均質化するには、P200ピペットを使用して少量の溶液を5回(例えば、皿内の800 μLの体積に対して150 μL)ゆっくりとピペットします。 培養皿自体を置き換えずに培養皿の上に蓋を交換し、イメージングを再開します。 5. ライブイメージング中の試薬の洗い流し 洗い流しの前に、洗浄液を培養皿と同じ温度に保ちます。 文化皿自体を置き換えることなく、培養皿の蓋を取り除きます。 P200またはP1000ピペットを使用すると、血栓の上部を露出させることなく、培養皿から培養培地をゆっくりと取り除きます(例えば、皿の中の培養培地の800μLから600 μLを取り除きます)。 試薬を希釈するには、P1000ピペットを用いて、培養液の表面にピペットチップを培養皿の表面近くに置き、洗浄液をゆっくりと放出する(例えば、希釈係数6の場合は皿内に残された200μLの培養液に1mLの洗浄液を加える)。 必要に応じて試薬が希釈されるまでステップ5.3と5.4を繰り返します(例えば、別の3つの同様のラウンドは1296の希釈因子となり、初期濃度の10 μM NAPP1を7.7nMに減少させます)。 培養皿自体を置き換えずに培養皿の上に蓋を交換し、イメージングを再開します。 6. 三次元および/または多チャンネルタイムラプス上のドリフトXYZの補正 準備 ダウンロードしてインストールします。TurboReg25 と MultiStackReg26 プラグインをダウンロードし、ImageJ のプラグインフォルダー内に配置します。 マルチハイパースタックレグ (補足コーディングファイル 1) と AutoHyperStackReg ImageJ マクロ (補足コーディングファイル 2)をダウンロードします。マクロをインストールするには、ImageJ のプラグイン フォルダ内に .ijm ファイルを配置するか、または .ijm ファイルの内容を ImageJ/マクロ/StartupMacros.txt ファイルに追加します。 ImageJ では、いくつかのスライスや複数のチャンネルを含むタイムラプスムービーを開きます (それ以降は「ハイパースタック」と呼ばれる、図 3A、4A)。タイムラプスにスライスが1つ、チャンネルが1つしかない場合、位置合わせはMultiStackRegを使用して直接実行できます。 マルチハイパースタックレグを用いた横ドリフトの補正 アライメントの基準として使用するハイパースタックのチャンネルやスライスを決定します。1 チャンネルの 1 スライス参照スタック(「参照スタック」と呼ばれる)を生成するには、[イメージ]|Duplicate…、重複ハイパースタックチェックボックスをオンにし、関連するチャンネル番号を「チャンネル(c)」に入力します(例えば、1–2を1に置き換える)、およびスライス(z):(例えば、1-15を8に置き換える)、フレーム:(例えば、1-50)にすべてのフレームが含まれていることを確認します( または、ステップ6.2.1の場合、1チャンネルの1スライス参照スタックに複数のスライスの投影が優先される場合は、[ イメージ]をクリック|スタック |Z Project. をクリックし、最初と最後のスライスと投影の種類を選択し、[ すべての時間枠 ] にチェックマークが付いていることを確認し 、[OK] をクリックします。タイムラプスに複数のチャンネルがある場合は、無関係なチャンネルを削除します(イメージ|スタック |作成された投影からスライスを削除するか、選択した参照チャンネル(画像|複製) (図 3B) 必要に応じて、ツールバーの長方形ツールを選択し、対象領域の長方形をトレースし、[イメージ]をクリックして、参照として 1 つの部分のみを参照として使用するように参照スタックをトリミング| 作物. マルチスタックを起動するには、プラグインをクリック|登録|マルチスタックレグ.ポップアップメニューの「スタック 1:」で、前のステップで生成された 1 つのチャンネル、1 つのスライスのスタック名を選択します。ポップアップメニューで[変換: ]を選択します。[変換ファイルを保存]チェックボックスをオンにして、他のすべてのフィールドを無視します。注: その他の変換タイプ(25)を参照してください。 [OK] をクリックします。位置と名前を選択して、位置合わせファイルを保存し、[保存] をクリックします。参照スタックウィンドウで、フレームが自動的に移動しなくなるのを待ち、登録が終了したことを示します(図3B)。 基準スタックで、アライメントが満足しているかどうかを確認します。ない場合は、別の参照スライス、チャンネル、トリミングでステップ6.2.1~6.2.5を繰り返します。参照スタックを閉じます。 ハイパースタックウィンドウを選択し、マルチハイパースタックRegマクロを実行します。ステップ 6.2.5 で作成した変換ファイルを選択し、開くをクリックします。ハイパースタックのすべてのチャンネルやスライスにアライメントが適用されるのを待ち、その時点で「_aligned」という接尾辞を持つ新しいウィンドウが開きます (図 3C)。 マルチハイパースタックレグを使用したフォーカスドリフトの補正 画像|をクリックします。[プロパティ]をクリックし、[ピクセル幅] に表示されている値をコピーします。1 チャンネルのハイパースタックを 1 ピクセルの間隔で直交的に再スライスするには、[イメージ]|スタック |再スライス [/]…をクリックし、ピクセル幅の値を[出力間隔:数値] フィールドに貼り付けます。[開始位置: ]ポップアップメニューで[上]を選択し、[補間を避ける]にチェックマークを付けて[OK]をクリックします。メモ:ImageJでメモリを解放する必要がある場合は、再スライスの後にハイパースタックを閉じることができます。 再スライスによって生成された新しいウィンドウを選択します (これ以降は「再スライスハイパースタック」と呼ばれます(図4B)。再スライスされたハイパースタックに複数のチャンネルがある場合は、チャンネルスクロールバーでそれらのチャンネルを選択して、整列を実行する参照チャンネルを選択し、他のチャンネルを削除します。[画像]|をクリックします。スタック |スライスを削除し、現在削除ポップアップメニューでチャンネルを選択し、OKをクリックします。 再スライスされたハイパースタックの単一スライス(ステップ6.2.1を参照)の複製するか、再スライスされたハイパースタックのスライスを複数投影して、シングルスライスされたハイパースタック(それ以降は「再スライスされた参照スタック」と呼ばれる)を生成します(図4C)。 必要に応じて、イメージとして 1 つのパーツのみを参照として使用するように、再スライスされた参照スタックをトリミングします(ステップ 6.2.3 を参照)。 MutiStackReg を使用して再スライスされた参照スタックに対してイメージ登録を実行します (手順 6.2.4 – 6.2.6 を参照してください) (図 4C)。 再スライスされたハイパースタックウィンドウを選択し、マルチハイパースタックRegマクロを実行します。ステップ 6.3.5 で作成した変換ファイルを選択し、[ 開く ] をクリックし、ハイパースタックのすべてのチャネルまたはスライスにアラインメント _alignedが適用されるのを待 ちます。元の再スライスされたハイパースタックを閉じます。 再スライスされたハイパースタックを元のハイパースタックのxyビューに変換するには、[スタック]をクリック|再スライス [/]….をクリックし、[開始位置: ]ポップアップメニューで[トップ]を選択し、[補間を避ける]にチェックマークを付けて[OK]をクリックします。最後のフォーカスに合わせたハイパースタックを含む新しいウィンドウが開いたら (図 4E)、再スライスされた整列したハイパースタックを閉じます。 横向きのドリフトとフォーカスドリフトを自動的に修正するには、AutoHyperStackReg マクロを実行します。参照チャネルを選択し、該当する場合は、横向きおよび/またはフォーカスドリフトを補正するかどうかを選択します。 [OK] をクリックします。 図 3: マルチハイパースタックRegによる横ドリフトの補正用パイプライン(A)横向きとフォーカスドリフトは、いくつかのスライスとタイムポイントを含むハイパースタックで観察することができます。(B) 単一のスライス、単一のチャネル参照スタックは、複写または Z 投影のいずれかによってハイパースタックから生成されます。参照スタックは、マルチスタックRegプラグインによって整列され、アライメントファイルが生成されます。(C) MultiHyperstackReg マクロは、ハイパースタックにアライメントファイルを適用するために使用され、その結果、横方向のドリフトが補正されるハイパースタックが整列されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 4: マルチハイパースタックRegによるフォーカスドリフトの補正のためのパイプライン(A) フォーカスドリフトは、複数のスライスとタイムポイントを含むハイパースタックで観察できます。(B) ハイパースタックは、補間なしで、Y 軸に沿ったピクセルの各線に沿って、上から直交して再スライスされます。その結果、再スライスされたハイパースタックはハイパースタックと同じ情報を含み、y と z の座標が切り替わります。元のハイパースタックのフォーカスドリフト(z)は、再スライスされたハイパースタック上のyのドリフトとして発生します。(C) 単一のスライス、単一チャネルの再スライスされた参照スタックは、複製または Z 投影のいずれかによって、再スライスされたハイパースタックから生成されます。再スライスされた参照スタックは、MultiStackReg プラグインによって整列され、アライメントファイルが生成されます。(D) MultiHyperstackReg マクロは、再スライスされたハイパースタックにアライメントファイルを適用するために使用され、その結果、フォーカスドリフト(y)が修正される再配置された再スライスされたハイパースタックが生成されます。(E) 第 2 の直交リスライスはハイパースタックの元の座標を復元しますが、現在はフォーカスドリフト(z)を表示しません。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 7. 回転ラインスキャンによる皮質信号測定 回転ラインスキャン ImageJ マクロ (補足コーディングファイル 3) をダウンロードします。 ImageJ でタイムラプスを開きます。フレームを最初のフレームに移動し、タイムラプスに複数のスライスが含まれている場合は、信号を測定するスライスにスライスのスクロールバーを配置します。 トラッキングモード ツールバーで直線ツールを選択します。測定する皮質ゾーンを横切る線をトレースする (図 5A),線が皮質にほぼ垂直であることを確認し、線が次の時間ポイントで皮質を横切るのに十分な長さであることを確認します (図 5B,第 1 および第 2 パネル). ツールバーの線ツールアイコンをダブルクリックして、[ 線幅 ] ウィンドウを開きます。線と皮質の交差を直線に保ちながら、必要に応じて線の幅を広げます (図 5B、 第 3 パネル)。 [ラインスキャンの回転]マクロを開始します。測定する皮質帯の向きが 1 つのタイムポイントから次の時点に大きく変化しない場合は、回転範囲 (図 5E)を低い値 (約 10 度) に設定します。 [周りを計測] の値を 0 ピクセルに設定すると、最大信号強度が検出されたライン上の信号のみを測定し、このラインの周りの信号も測定するには高い値に設定します。注: [周りを測定]の値は、皮質の検出後の信号測定にのみ影響し、検出自体には影響しません。 [Cortex を 検索するチャネル: ] ポップアップメニューで、検出を実行するチャンネルを選択します。各タイムポイントでの皮質の検出場所を視覚化するには、[ 表示位置..] チェックボックスにチェックを入れておいてください (推奨)。[ 再センターと方向を変更する] チェックボックスをオンにします。 [OK] をクリックします。 [完了]、[クリップボードにコピーされた結果] ステータスが ImageJ ウィンドウのステータスに表示されたら、タイムラプスをスクロールして、検出された皮質の位置(黄色のオーバーレイ)と測定領域(シアン オーバーレイ)が満足しているかどうかを確認します。行がない場合は、ラインスキャンオプションウィンドウで、異なるライン位置、長さ、幅、および異なる設定で手順 7.3.1 ~ 7.3.4を繰り返します。 測定値をスプレッドシート ソフトウェアに貼り付けます。注: 列はタイムラプスの表示順にチャネルに対応し、ラインはフレームに対応します。 非トラッキング モード ツールバーで直線ツールを選択します。測定する皮質ゾーンを横切って線(シアン、図5Aで示す)をトレースし、線が皮質に対してほぼ垂直であり、ラインが各時間点で皮質を横切るのに十分な長さであることを確認します(図5C、第1および第2パネル)。 ツールバーの線ツールアイコンをダブルクリックして、[ 線幅 ]ウィンドウを開きます。線と皮質の交差を直線に保ちながら、必要に応じて線の幅を広げます (図 5C、 第 3 パネル)。 [ラインスキャンの回転]マクロを開始します。全体のタイムラプス全体で測定される皮質帯の向きの変化に応じて回転範囲(図5E)を設定します。 [周りを計測] の値を 0 ピクセルに設定すると、最大信号強度が検出されたライン上の信号のみを測定し、このラインの周りの信号も測定するには高い値に設定します。注: [周りを測定]の値は、皮質の検出後の信号測定にのみ影響し、検出自体には影響しません。 [Cortex を 検索するチャネル: ] ポップアップメニューで、検出を実行するチャンネルを選択します。各タイムポイントでの皮質の検出場所を視覚化するには、[ 表示位置] チェックボックスにチェックを入れておいてください(推奨)。[ 再センターと方向の変更]チェックボックスのチェックを 解除します。 [OK] をクリックします。 完了すると、クリップボードにコピーされた結果がImageJウィンドウのステータスに表示され、検出された皮質の位置(黄色のオーバーレイ)と測定領域(シアンオーバーレイ)が満足しているかどうかを確認するためにタイムラプスをスクロールします。行がない場合は、ラインスキャンオプションウィンドウで、行の位置、長さ、幅を変更し、設定を変更して、前の手順を繰り返します。 測定値をスプレッドシート ソフトウェアに貼り付けます。注: 列はタイムラプスの表示順にチャネルに対応し、ラインはフレームに対応します。 図5:回転ラインカンを用いる皮質信号の測定。(A) 線(シアン)は、信号が測定される皮質(黒)に垂直にトレースされます。グレーの異なる網掛けは、3 つのタイムポイント (t1、t2、t3) にわたって変化するセルの位置を示します。(B)左:トラッキングモードでの行の正しい位置。中央: 次のタイムポイントでの皮質との重複がないため、トラッキングモードでのラインの位置が正しくない。右: 広い線で、皮質と直線が直線でない間の交点(オレンジ線) になります。(C)左: 非トラッキングモードでの行の正しい位置。中央: 各タイムポイントでのコルテックスとの重複がないため、非トラッキングモードでのラインの位置が正しくない。右: 広い線で、皮質と直線が直線でない間の交点(オレンジ線) になります。(D) スキャンラインの長さと幅。(E) ラインカンは、「回転範囲」パラメータで定義された「回転範囲」パラメータで定義された元の方向を中心に、方向の範囲内で実行されます。(F)皮質に対する走査線の非最適の向きにより、線に沿って測定される低信号が生じる。(G)ラインの最適な方向は、ラインに沿って測定される信号強度の最高峰をもたらすものとして定義されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。