Toepassingen van immobilisatie van Drosophila-weefsels met fibrinestolsels voor live beeldvorming

1. Bereiding van reagentia OPMERKING: Alle stappen in dit protocol, tenzij anders uitgelegd, worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Om een oplossing van 1x PBS-BSA (0,1% w/v) te bereiden, lost u 1 mg Bovine Serum Albumine (BSA) op in 1 ml PBS. Om een voorraadoplossing van Trombine 1.000 eenheden·ml-1te bereiden, lost u 1.000 eenheden trombine op in 1 ml PBS-BSA (0,1% w/v). Maak aliquots van 10 μL en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 4 maanden. Om het kweekmedium voor te bereiden op Drosophila-hersenen, lost u 1 g glucose op in 1 L van Schneiders medium in steriele omstandigheden. Filtreer en bewaar tot 3 maanden bij 4 °C. Om de Fibrinogeenoplossing te bereiden, lost u 10 mg Fibrinogeen op in 1 ml kweekmedium gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur of 5 minuten bij 37 °C.OPMERKING: Als een ander kweekmedium wordt gebruikt dan het bij stap 1.2 bereide medium en fibrinestolsels zich al bij deze stap vormen, bevat het kweekmedium waarschijnlijk actieve trombine, die vooraf moet worden geactiveerd. Een waarschijnlijke bron van trombine is Foetale Runderserum, dat kan worden geactiveerd door het serum gedurende 30 minuten te verwarmen tot 56 °C. Om een coatingoplossing van PBS-BSA (5% w/v) te bereiden, lost u 50 mg Bovine Serum Albumine (BSA) op in 1 ml 1x PBS. Voor het voorbeeldreagens dat in stap 4 wordt gebruikt, bereidt u een stamoplossing van 10 mM NAPP1 voor door 1 mg NAPP1 in 315 μL Dimethylsulfoxide op te lossen. 2. Dissectie van drosophila larvale hersenen OPMERKING: Voer deze stap uit onder een verrekijker voor dissectie. Gebruik een borstel om L3-larven over te brengen in een 9-well borosilicaat glazen schaal met PBS. Roer om het grootste deel van het vliegvoedsel los te maken van de larven en over te brengen naar een ander goed bevattend kweekmedium. Gebruik een tang (bijv. Dumont #55) om een larve over zijn hele diameter te grijpen, in het midden van zijn lichaamslengte (zie figuur 1A,B). Terwijl u de larve vasthoudt, breng u deze over naar een andere put van de borosilicaatplaat met 200 μL vers kweekmedium. Laat de larve niet los. Om de larve doormidden te snijden over zijn gehele diameter(figuur 1B),maalt u het gegrepen gebied met zijdelingse beweging van de tangpunten(figuur 1A,bovenpaneel) of schuift u een punt van een ander paar tangen tussen de twee tangpunten die de larve vasthouden(figuur 1A,onderste paneel). Snijd de larve niet doormidden door aan een van zijn ledematen te trekken, omdat deze de hersenen kan beschadigen door eraan te trekken via de zenuwen die de lichaamslengte overschrijden (rode lijnen in figuur 1B). Gebruik een tang om de larve bij de nagelriem te houden en een ander paar tangen om de nagelriem uit elkaar te halen zonder aan de hersenen te trekken (Figuur 1C). Herhaal dit totdat de zenuwen afkomstig uit de hersenen zichtbaar zijn en de organen die de hersenen verbinden met de monddelen toegankelijk zijn zoals weergegeven in figuur 1D. Gebruik een tang om de zenuwen uit de hersenen vast te houden. Gebruik bij het andere paar tangen een van de technieken in figuur 1A om de verbinding tussen de hersenen en de monddelen te verbreken en de hersenen te scheiden van de rest van de cuticula (figuur 1D). Gebruik een tang om de hersenen vast te houden bij de axonen die uit het ventrale zenuwkoord komen. Pluk de in grijs afgebeelde organen in figuur 1E door ze voorzichtig van de hersenen af te trekken.OPMERKING: Trek niet aan de oog-/antenneschijven (donkergeel) om ze los te maken van de hersenen. De verbinding tussen deze weefsels is te robuust om te worden verbroken door te trekken zonder de hersenen te beschadigen. Terwijl u nog steeds de zenuwen vastgrijpt om de hersenen vast te houden en te oriënteren, grijpt u de verbinding tussen de fantasieschijven van het oog / de antenne (donkergeel) en de hersenen met het andere paar tangen (figuur 1F). Gebruik een van de technieken in figuur 1A om deze verbinding te verbreken zonder aan de hersenen te trekken. Controleer of de hersenen op de juiste wijze zijn ontdaan van andere weefsels (figuur 1G) en niet beschadigd zijn (figuur 1H). Gooi de hersenen weg als het tekenen van schade vertoont. Pipetteer de coatingoplossing met een P20 in en uit om de pipettip te coaten. Pipetteer de hersenen met de gecoate punt samen met 3 μL medium(figuur 2A, links)en pipetteer het uit in een andere put met 200 μL schoon kweekmedium. Herhaal stap 2.2–2.8 totdat voldoende hersenen zijn ontleed, waarbij af en toe het cultuurmedium van de put waarin de dissecties worden uitgevoerd, wordt vervangen. Figuur 1: Dissectie van D. melanogaster larvale hersenen. (A) Techniek voor snijden zonder te trekken met behulp van een tang. Het monster (lichtgroen) kan worden gesneden door te worden gemalen tussen de uiteinden van de tang (bovenpaneel) of door een punt van een paar tangpunten langs de uiteinden van een paar tangen te laten lopen die het monster vasthouden (onderste paneel). (B–F) Stappen voor het isoleren van de larvale hersenen zonder deze te beschadigen (zie tekst). Rood: hersenen. Donkergeel: oog-/antenneschijven. Blauwe tekst: acties om uit te voeren met de bijbehorende tang. (G) Uiterlijk van een geïsoleerd brein zonder zichtbare schade. D is de dorsale kant en V is de ventrale kant op het zijaanzicht. (H) Veel voorkomende schade veroorzaakt door overmatig trekken aan de hersenen tijdens de dissectie. Bovenpaneel: loslating van het ventrale zenuwkoord. Onderpaneel: vervorming van een kwab. Posterior is links en voorste is rechts in alle panelen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 3. Immobilisatie op coverslip met Fibrinestolsels OPMERKING: Voer deze stap uit onder een verrekijker voor dissectie. Gebruik een P20 pipet met een gecoate punt zoals in stap 2.8 om de ontlede hersenen over te brengen naar een andere put van de borosilicaatplaat met 200 μL kweekmedium + Fibrinogeen (Figuur 2A). Pipet in één brein samen met 9 μL kweekmedium + Fibrinogeen. Als het uiteinde van de punt bijna de glazen bodem van een 35 mm celkweekschaal raakt, spuit u de inhoud (het kweekmedium en de hersenen) uit, waardoor het kweekmedium de afdeklip direct na het verlaten van de pipetpunt aanraakt, zodat de hersenen en het medium niet naar de zijkanten van de punt glijden, waardoor de hersenen mogelijk worden beschadigd (figuur 2A). Gebruik een punt van een tang of een gesloten paar tangen om de hersenen voorzichtig binnen het kweekmedium + Fibrinogeendruppel te duwen en te plaatsen.OPMERKING: Het aanraken van de druppel met een open paar tangen kan ertoe leiden dat het cultuurmedium wordt getrokken door capillariteit tussen de tangpunten (Figuur 2B). Als het ventrale deel van de hersenen in beeld moet worden gebracht, induceer dan fibrinogeenstolling als volgt om de hersenen in het stolsel goed te oriënteren (figuur 2C). Duw de hersenen naar één kant van de druppel. Met een P1 pipet uitgerust met een P1 tip, pipet 1 μL trombine oplossing, raak de rand van de druppel aan de andere kant van de hersenen met de pipet tip, en pipet uit de Trombine (Figuur 2C, eerste tekening). Wacht 1-2 minuten tot het Fibrinogeen begint te polymeriseren, wat resulteert in de vorming van een troebel neerslag aan één kant van de druppel(figuur 2C,tweede tekening). Duw en “stop” de hersenen voorzichtig in het Fibrin-stolsel en zorg ervoor dat het deel dat in beeld komt (bijv. de ventrale kant) zo dicht mogelijk bij de deklip ligt zonder de hersenen te vervormen(figuur 2C,derde tekening). Pipetteer 1 μL trombineoplossing dicht bij de zijkant van de hersenen die niet in het Fibrine-stolsel is weggestopt. (Figuur 2C, vierde tekening). Wacht 2-3 minuten tot het tweede Fibrine-stolsel is ingesteld(figuur 2C,vijfde tekening). Druk op de randen van het stolsel om het sterker aan de deklip te laten hechten, waarbij u ervoor zorgt dat de hersenen niet vervormen(figuur 2C,zesde en zevende tekeningen). Als de hersenen te ver van de coverslip lijken te zijn, breng het dan dichterbij door het Fibrin-stolsel dicht bij de hersenen te drukken. Als het dorsale deel van de hersenen moet worden afgebeeld, induceer dan de Fibrine-stolling als volgt (Figuur 2D). Plaats de hersenen in het midden van de druppel, dorsaal deel tegenover de coverslip. Met een P10 pipet uitgerust met een dunne punt, pipet 1 μL trombine-oplossing, raak de rand van de druppel aan de andere kant van de hersenen aan met de pipetpunt en pipet uit de trombine(figuur 2D,eerste tekening). Wacht 2-3 minuten tot het Fibrinogeen begint te polymeriseren, wat resulteert in de vorming van een troebel, vezelig neerslag(figuur 2D,tweede tekening). Druk op de randen van het stolsel om het sterker aan de deklip te laten hechten, waarbij u ervoor zorgt dat de hersenen niet vervormen(figuur 2D,derde en vierde tekeningen). Herhaal stap 3.1–3.5 als meerdere stollingsmonsters op de afdeklip moeten worden geïmmobiliseerd. Met het uiteinde van de punt ongeveer 0,5 cm boven het stolsel(en) geplaatst, pipet u voorzichtig 390 μL kweekmedium zonder Fibrinogeen druppelgewijs bovenop het stolsel(en) (figuur 2B, rechter Petrischaal). Voeg het kweekmedium niet toe aan de zijkanten van het stolsel, omdat het los kan komen van de afdeklip. Om de resterende trombine uit te wassen, gebruikt u een pipet om 300 μl van het kweekmedium te verwijderen en voegt u 300 μl schoon kweekmedium toe, zodat de stolsels volledig ondergedompeld blijven. Herhaal dit twee keer om overtollige trombine uit te wassen. Figuur 2: Immobilisatie van een Drosophila larvale hersenen met behulp van Fibrine stolsels. (A) Met behulp van een met BSA gecoate pipetpunt worden de hersenen overgebracht van het kweekmedium (geel) naar een kweekmedium + Fibrinogeenoplossing (oranje) en vervolgens op de afdeklip (lichtblauw) van een kweekschaal gepipeteerd, samen met 3,5 μL kweekmedium + Fibrinogeen. Fibrinogeenstolling wordt geïnduceerd door toevoeging van trombine om hersenen in dorsale of ventrale positie te immobiliseren (zie D en E). De beveiligde hersenen in de stolsels worden vervolgens bedekt met kweekmedium zonder Fibrinogeen en overtollige trombine wordt verwijderd door het toevoegen en verwijderen van kweekmedium drie keer. (B) De positie van de hersenen binnen de druppel van kweekmedium + Fibrinogeen (oranje) op de afdeklip mag alleen worden aangepast door deze voorzichtig te duwen met de punt van een gesloten paar tangen, of slechts één tangpunt. Het aanraken van de druppel met op open paar tangen kan ertoe leiden dat het cultuurmedium wordt getrokken door capillariteit tussen de uiteinden van de tang. (C) Stappen voor het positioneren van de larvale hersenen voor het weergeven van de ventrale kant (zie tekst). (D) Stappen voor het positioneren van de larvale hersenen voor het weergeven van de dorsale kant (zie tekst). In (D) en (E), groen: Trombine. Donkeroranje: Fibrinestolsel. Lichtblauw: coverslip. Blauwe pijlen: randen van het stolsel dat tegen de afdeklip moet worden geduwd om het stolsel te stabiliseren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 4. Toevoeging van reagentia tijdens live beeldvorming Om temperatuurveranderingen te voorkomen die focusveranderingen veroorzaken, moet u de oplossing met de reagentia die aan de kweekschaal worden toegevoegd op dezelfde temperatuur houden als de kweekschotel zelf om deze op dezelfde temperatuur te brengen voordat u deze toevoegt. Als een milieukamer wordt gebruikt, laat u de oplossing in de kamer. Verwijder het deksel van de kweekschotel zonder de kweekschotel zelf te verplaatsen. Om het verwijderen te vergemakkelijken, plaatst u het deksel van de 35 mm schotel ondersteboven op de schaal voordat u deze in beeld zet. Plaats met een P1000 pipet de pipetpunt dicht bij het oppervlak van het kweekmedium in de kweekschaal en laat er voorzichtig het juiste volume reagensoplossing op los om de gewenste reagensconcentratie te bereiken (bijv. 400 μL van een oplossing van 20 μM NAPP1 op 400 μL kweekmedium voor een eindconcentratie van 10 μM NAPP1) , zonder sterke fluxen te genereren die de stolsels kunnen losmaken. Om de oplossing in de kweekschaal te homogeniseren, gebruikt u een P200 pipet om een kleine hoeveelheid van de oplossing vijf keer langzaam in en uit te pipeten (bijv. 150 μL voor een volume van 800 μL in de schaal). Plaats het deksel bovenop de kweekschaal terug zonder de kweekschotel zelf te verplaatsen en hervat de beeldvorming. 5. Washout van reagentia tijdens live beeldvorming Houd de wasoplossing vóór de washout op dezelfde temperatuur als de kweekschotel. Verwijder het deksel van de kweekschotel zonder de kweekschotel zelf te verplaatsen. Verwijder met een P200- of P1000-pipet langzaam een kweekmedium uit de kweekschaal zonder de bovenkant van het stolsel bloot te leggen (verwijder bijvoorbeeld 600 μL van 800 μL kweekmedium in de schaal). Om het reagens te verdunnen met een P1000 pipet, plaatst u de pipetpunt dicht bij het oppervlak van het kweekmedium in de kweekschaal en laat u de wasoplossing langzaam los (voeg bijvoorbeeld 1 ml wasoplossing toe aan het 200 μL kweekmedium dat in de schaal achterbleef voor een verdunningsfactor van 6). Herhaal stap 5.3 en 5.4 totdat het reagens zo nodig wordt verdund (nog eens drie vergelijkbare rondes resulteren bijvoorbeeld in een verdunningsfactor van 1296, waardoor de beginconcentratie van 10 μM NAPP1 tot 7,7 nM wordt verminderd). Plaats het deksel bovenop de kweekschaal terug zonder de kweekschotel zelf te verplaatsen en hervat de beeldvorming. 6. Correctie van de xyz drifting op tridimensionale en/of multichannel time-lapses voorbereiding Download en installeer ImageJ24. Download de TurboReg25 en MultiStackReg26 plugins en plaats ze in de plugins map van ImageJ. Download de MultiHyperStackReg (Aanvullend coderingsbestand 1) en AutoHyperStackReg ImageJ macro’s (Aanvullend coderingsbestand 2). Als u een macro wilt installeren, plaatst u het .ijm-bestand in de map plug-ins van ImageJ of voegt u de inhoud van het .ijm-bestand toe aan het bestand ImageJ/macros/StartupMacros.txt. Open op ImageJ een timelapsefilm met verschillende segmenten en/of meerdere kanalen (voortaan “hyperstack” genoemd, figuur 3A,4A). Als de time-lapse slechts één segment en één kanaal bevat, kan de uitlijning rechtstreeks worden uitgevoerd met MultiStackReg. Correctie van laterale drift met MultiHyperStackReg Bepaal welk kanaal en/of segment van de hyperstack moet worden gebruikt als referentie voor uitlijning. Als u een referentiestack met één kanaal en één segment wilt genereren (voortaan “referentiestack” genoemd), klikt u op Afbeelding | Dupliceren…, vink het selectievakje Dubbele hyperstack aan, typ het relevante kanaalnummer in kanalen (c): (vervang bijvoorbeeld 1–2 door 1) en/of het relevante kanaalnummer in segmenten (z): (vervang bijvoorbeeld 1-15 door 8) en zorg ervoor dat frames: (t) alle frames (bijv. 1-50) bevatten voordat u op OK klikt (figuur 3B). Als alternatief voor stap 6.2.1, als een projectie van meerdere segmenten de voorkeur heeft voor de referentiestack met één kanaal en één segment, klikt u op Afbeelding | Stapels | Z Project…, selecteer de eerste en laatste segmenten en het type projectie, zorg ervoor dat Alle tijdframes zijn aangevinkt en klik op OK. Als de time-lapse meerdere kanalen heeft, verwijdert u de irrelevante kanalen (Afbeelding | Stapels | Segment verwijderen) uit de resulterende projectie of het gekozen referentiekanaal dupliceren (Afbeelding | Duplicaat) (figuur 3B). Als u de referentiestapel bijsnijdt om slechts één deel als afbeelding als referentie te gebruiken, selecteert u het gereedschap Rechthoek op de werkbalk, volgt u een rechthoek over het interessegebied en klikt u op Afbeelding | Bijsnijden. Om MultiStackReg te starten, klik op Plugins | Registratie | MultiStackReg. Selecteer in het pop-upmenu Stapel 1:de naam van de éénkanaals stapel met één segment die in de vorige stappen is gegenereerd. Selecteer Vertaling in het pop-upmenu Transformatie:, selecteer Vertaling; vink het selectievakje Transformatiebestand opslaan aan en negeer alle andere velden.OPMERKING: Andere soorten transformatie (zie25). Klik op OK. Selecteer een locatie en naam om het uitlijningsbestand op te slaan en klik op Opslaan. Wacht in het venster van de referentiestack tot de frames automatisch stoppen met bewegen, wat aangeeft dat de registratie voorbij is (figuur 3B). Controleer de referentiestack om te zien of de uitlijning bevredigend is. Zo niet, herhaal dan stap 6.2.1–6.2.5 met een ander referentiesegment, kanaal en/of bijsnijden. Sluit de referentiestack. Selecteer het hyperstackvenster en voer de Macro MultiHyperStackReg uit. Selecteer het transformatiebestand dat in stap 6.2.5 is gemaakt en klik op Openen. Wacht tot de uitlijning op elk kanaal en/of segment van de hyperstack wordt toegepast, waarna een nieuw venster met het achtervoegsel “_aligned” wordt geopend (figuur 3C). Correctie van focus drift met Behulp van MultiHyperStackReg Klik op Afbeelding | Eigenschappen…, kopieert u de waarde die wordt weergegeven in Pixelbreedte. Als u de hyperstack met één kanaal met een afstand van één pixel orthogonaal wilt resliceren, klikt u op Afbeelding | Stapels | Reslice [/]…, plak de pixelbreedtewaarde in het veld Uitvoerafstand: numeriek; selecteer Boven in het pop-upmenu Start At: vink Interpolatie vermijden aan en klik op OK.OPMERKING: Als het geheugen op ImageJ moet worden vrijgemaakt, kan de hyperstack worden gesloten na de reslice. Selecteer het nieuwe venster gegenereerd door de reslice (voortaan aangeduid als “resliced hyperstack”, Figuur 4B). Als de hyperstack met resliced meerdere kanalen heeft, selecteert u een referentiekanaal om de uitlijning uit te voeren en verwijdert u de andere kanalen door ze te selecteren in de kanaalrolbalk. klik op Afbeelding | Stapels | Segment verwijderen, selecteer Kanaal in het pop-upmenu Huidige verwijderen en klik op OK. Genereer een hyperstack met één segment (voortaan “resliced reference stack” genoemd), hetzij door een enkel segment van de resliced hyperstack te dupliceren (zie stap 6.2.1) hetzij door meerdere segmenten van de resliced hyperstack te projecteren (zie stap 6.2.2) (Figuur 4C). Snijd desgewenst de referentiestack met resliced bij om slechts één deel als referentie te gebruiken (zie stap 6.2.3). Voer de afbeeldingsregistratie uit op de resliced reference stack met MutiStackReg (zie stap 6.2.4–6.2.6) (Figuur 4C). Selecteer het venster hyperstack met resliced en voer de macro MultiHyperStackReg uit. Selecteer het transformatiebestand dat in stap 6.3.5 is gemaakt, klik op Openen en wacht tot de uitlijning op elk kanaal en/of segment van de hyperstack is toegepast, waarna een nieuw venster met het achtervoegsel “_aligned” wordt geopend (voortaan aangeduid als “resliced reference stack”, figuur 4D). Sluit de originele resliced hyperstack. Als u de geresliceerde uitgelijnde hyperstack wilt converteren naar de xy-weergave van de oorspronkelijke hyperstack, klikt u op Stapels | Reslice [/]…, selecteer Boven in het pop-upmenu Start At: vink Interpolatie vermijden aan en klik op OK. Zodra een nieuw venster met de uiteindelijke focus-uitgelijnde hyperstack wordt geopend(figuur 4E),sluit u de geresliceerde uitgelijnde hyperstack. Voer de macro AutoHyperStackReg uit om de laterale drift en focus drift automatisch te corrigeren. Selecteer het referentiekanaal, indien van toepassing, en of de laterale en/of focus drift moet worden corrigeren. Klik op OK. Figuur 3: Pijplijn voor de correctie van laterale drift met MultiHyperstackReg. (A) Laterale en focus drifts kunnen worden waargenomen op een hyperstack met verschillende segmenten en tijdspunten. (B) Een enkele segment, single channel referentie stack wordt gegenereerd uit de hyperstack, hetzij door duplicatie of Z projectie. De referentiestack wordt uitgelijnd door de MultiStackReg-plug-in, waardoor een uitlijningsbestand wordt gegenereerd. (C) De Macro MultiHyperstackReg wordt gebruikt om het uitlijningsbestand op de hyperstack toe te passen, wat resulteert in een uitgelijnde hyperstack waarvoor de laterale drift wordt gecorrigeerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 4: Pijplijn voor het corrigeren van focus drift met MultiHyperstackReg. (A) Focus drifts kunnen worden waargenomen op een hyperstack met verschillende segmenten en tijdspunten. (B) De hyperstack wordt orthogonaal geresliceerd vanaf de bovenkant, langs elke lijn pixels langs de Y-as, zonder interpolatie. Dit resulteert in een resliced hyperstack met dezelfde informatie als de hyperstack, met zijn y en z coördinaten geschakeld. De focus drift (in z) van de oorspronkelijke hyperstack treedt op als een drift in y op de resliced hyperstack. (C) Een enkele slice, single channel resliced reference stack wordt gegenereerd uit de resliced hyperstack, hetzij door duplicatie of Z projectie. De referentiestack met resliced wordt uitgelijnd door de MultiStackReg-plug-in, waardoor een uitlijningsbestand wordt gegenereerd. (D) De macro MultiHyperstackReg wordt gebruikt om het uitlijningsbestand toe te passen op de geresliceerde hyperstack, wat resulteert in een uitgelijnde resliced hyperstack waarvoor de focus drift (in y) wordt gecorrigeerd. (E) Een tweede orthogonale reslice herstelt de oorspronkelijke coördinaten van de hyperstack, die nu geen focus drift (in z) meer vertoont. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 7. Corticale signaalmeting met roterende linescans Download de macro Rotating Linescans ImageJ (Aanvullend coderingsbestand 3). Open een time-lapse in ImageJ. Plaats de schuifbalk van de frames op het eerste frame en, als de time-lapse meerdere segmenten bevat, plaatst u de schuifbalk van de segmenten op het segment waarop het signaal wordt gemeten. Trackingmodus Selecteer het gereedschap Rechte lijn op de werkbalk. Traceer een lijn over de te meten corticale zone (figuur 5A), zorg ervoor dat de lijn ongeveer loodrecht op de cortex staat en dat de lijn lang genoeg is om de cortex bij elk volgend keerpunt te kruisen (figuur 5B, eerste en tweede paneel). Dubbelklik op het pictogram van het gereedschap Lijn op de werkbalk om het venster Lijnbreedte te openen. Vergroot de breedte van de lijn zoveel als nodig is, terwijl het snijpunt tussen de lijn en de cortex een rechte lijn blijft (figuur 5B, derde paneel). Start de macro Rotating Linescans. Stel het rotatiebereik (figuur 5E) in op een lage waarde (ongeveer 10°) als de oriëntatie van de te meten corticale zone niet veel verandert van het ene tijdspunt naar het andere. Stel de waarde Measure Around in op 0 pixels om alleen het signaal te meten op de lijn waar de maximale signaalintensiteit wordt gedetecteerd, of op hogere waarden om ook het signaal rond deze lijn te meten.OPMERKING: De meetwaarde Rond heeft alleen invloed op de signaalmeting na detectie van de cortex en heeft geen invloed op de detectie zelf. Selecteer in het pop-upmenu Cortex zoeken op kanaal: het kanaal waarop de detectie wordt uitgevoerd. Om te visualiseren waar de cortex op elk tijdstip is gedetecteerd, houdt u het selectievakje Weergavepositie… aangevinkt (aanbevolen). Houd het selectievakje Recenter en heroriënteren… aangevinkt. Klik op OK. Zodra de status Gereed, Resultaten gekopieerd naar Klembord wordt weergegeven in de imagej-vensterstatus, bladert u door de time-lapse om te controleren of de gedetecteerde cortexposities (gele overlay) en het gemeten gebied (cyaanoverlay) bevredigend zijn. Zo niet, herhaal dan stap 7.3.1–7.3.4 met een andere lijnpositie, lengte of breedte en verschillende instellingen in het venster Opties voor roterende linescans. Plak de metingen in een spreadsheetsoftware.OPMERKING: Kolommen komen overeen met kanalen in de volgorde van hun uiterlijk in de time-lapse en lijnen komen overeen met frames. Niet-trackingmodus Selecteer het gereedschap Rechte lijn op de werkbalk. Traceer een lijn (aangegeven in cyaan, figuur 5A) over de te meten corticale zone, zorg ervoor dat de lijn ongeveer loodrecht op de cortex staat en dat de lijn lang genoeg is om de cortex op elk tijdstip te kruisen (figuur 5C, eerste en tweede paneel). Dubbelklik op het pictogram van het lijngereedschap op de werkbalk om het venster Lijnbreedte te openen. Vergroot de breedte van de lijn zoveel als nodig is, terwijl het snijpunt tussen de lijn en de cortex een rechte lijn blijft (figuur 5C, derde paneel). Start de macro Rotating Linescans. Stel het rotatiebereik (figuur 5E) in op de richtingsveranderingen van de corticale zone die gedurende de gehele tijdspanne moeten worden gemeten. Stel de waarde Measure Around in op 0 pixels om alleen het signaal te meten op de lijn waar de maximale signaalintensiteit wordt gedetecteerd, of op hogere waarden om ook het signaal rond deze lijn te meten.OPMERKING: De meetwaarde Rond heeft alleen invloed op de signaalmeting na detectie van de cortex en heeft geen invloed op de detectie zelf. Selecteer in het pop-upmenu Cortex zoeken op kanaal: het kanaal waarop de detectie wordt uitgevoerd. Om te visualiseren waar de cortex op elk tijdstip is gedetecteerd, houdt u de weergaveposities… aangevinkt (aanbevolen). Schakel het selectievakje Recenter en Heroriënteren… uit. Klik op OK. Eenmaal voltooid, worden resultaten gekopieerd naar klembord weergegeven in de imagej-vensterstatus, blader door de time-lapse om te controleren of de gedetecteerde cortexposities (gele overlay) en het gemeten gebied (cyaanoverlay) bevredigend zijn. Zo niet, herhaal dan de vorige stappen met een andere lijnpositie, lengte of breedte en verschillende instellingen in het venster Opties voor Roterende linescans. Plak de metingen in een spreadsheetsoftware.OPMERKING: Kolommen komen overeen met kanalen in de volgorde van hun uiterlijk in de time-lapse en lijnen komen overeen met frames. Figuur 5: Meting van het corticale signaal met roterende linescan. (A) Een lijn (cyaan) wordt loodrecht op de cortex (zwart) getraceerd waar het signaal zal worden gemeten. Verschillende grijstinten tonen de celpositie die over drie tijdspunten verandert (t1, t2, t3). (B) Links: correcte positionering van de lijn in trackingmodus. Midden: onjuiste positionering van de lijn in trackingmodus omdat er op het volgende keerpunt geen overlap is met de cortex. Rechts: te brede lijn waardoor het snijpunt (oranje lijn) tussen de cortex en de lijn niet recht is. (C) Links: correcte positionering van de lijn in de niet-trackingmodus. Midden: onjuiste positionering van de lijn in niet-trackingmodus omdat er op elk moment geen overlap is met de cortex. Rechts: te brede lijn waardoor het snijpunt (oranje lijn) tussen de cortex en de lijn niet recht is. (D) Lengte en breedte van de scanlijn. (E) Linescans worden uitgevoerd binnen een reeks oriëntaties rond de oorspronkelijke oriëntatie weergegeven in (D) gedefinieerd door de parameter “rotatiebereik”, met een interval dat wordt gedefinieerd door de parameter “rotatiestap”. (F) Niet-optimale oriëntatie van de scanlijn ten opzichte van de cortex, wat resulteert in een laag signaal gemeten langs de lijn. (G) De optimale oriëntatie van de lijn wordt gedefinieerd als de lijn die resulteert in de hoogste piek van de signaalintensiteit gemeten langs de lijn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.