Este artículo presenta un método para generar cristales proteicos derivados con I3C (5-amino-2,4,6-ácido triiodoisophtalico) utilizando microsedizaciones para generar nuevas condiciones de cristalización en pantallas de matriz dispersas. Las bandejas se pueden configurar con robots dispensadores de líquidos o a mano.
La elucidación de la estructura proteica mediante cristalografía de rayos X requiere tanto cristales difractantes de alta calidad como solución computacional del problema de la fase de difracción. Las estructuras novedosas que carecen de un modelo de homología adecuado a menudo se derivan con átomos pesados para proporcionar información de fase experimental. El protocolo presentado genera eficientemente cristales de proteínas derivados mediante la combinación de cribado aleatorio de matriz de microsedora con derivatización con una molécula de átomo pesado I3C (ácido 5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic). Al incorporar I3C en la celosía de cristal, el problema de la fase de difracción se puede resolver eficientemente utilizando una sola fase de dispersión anómala de longitud de onda (SAD). La disposición del triángulo equilátero de los átomos de yodo en I3C permite una validación rápida de una subestructura anómala correcta. Este protocolo será útil para los biólogos estructurales que resuelven estructuras macromoleculares utilizando técnicas basadas en cristalografía con interés en la fase experimental.
En el campo de la biología estructural, la cristalografía de rayos X se considera como la técnica estándar de oro para determinar las estructuras de resolución atómica de las macromoléculas. Se ha utilizado ampliamente para entender la base molecular de las enfermedades, guiar proyectos de diseño racional de fármacos y dilucidar el mecanismo catalítico de las enzimas1,2. Aunque los datos estructurales proporcionan una gran cantidad de conocimientos, el proceso de expresión y purificación de proteínas, cristalización y determinación de la estructura puede ser extremadamente laborioso. Comúnmente se encuentran varios cuellos de botella que dificultan el progreso de estos proyectos y esto debe abordarse para agilizar eficientemente el gasoducto de determinación de la estructura cristalina.
Después de la expresión y purificación recombinantes, deben identificarse las condiciones preliminares que favorezcan la cristalización, que a menudo es un aspecto arduo y lento de la cristalografía de rayos X. Se han desarrollado pantallas de matriz dispersa comercial que consolidan las condiciones conocidas y publicadas para aliviar este cuello de botella3,4. Sin embargo, es común generar pocos impactos de estas pantallas iniciales a pesar de usar muestras de proteínas altamente puras y concentradas. Observar gotas claras indica que la proteína puede no estar alcanzando los niveles de supersaturación requeridos para nuclear un cristal. Para fomentar la nucleación cristalina y el crecimiento, las semillas producidas a partir de cristales preexistentes se pueden añadir a las condiciones y esto permite un mayor muestreo del espacio de cristalización. Ireton y Stoddard introdujeron por primera vez el método de cribado de matriz de microsedas5. Los cristales de mala calidad fueron triturados para hacer un stock de semillas y luego se añadieron sistemáticamente a las condiciones de cristalización que contienen diferentes sales para generar nuevos cristales de calidad de difracción que de otro modo no se habrían formado. Esta técnica fue mejorada aún más por D’Arcy et al. que desarrollaron cribado aleatorio de matriz de microsedas (rMMS) en el que las semillas se introdujeron en una pantalla de cristalización de matriz de repuesto6,7. Esto mejoró la calidad de los cristales y aumentó el número de impactos de cristalización en promedio en un factor de 7.
Después de que los cristales se producen con éxito y se obtiene un patrón de difracción de rayos X, se encuentra otro cuello de botella en forma de resolución del “problema de fase”. Durante el proceso de adquisición de datos, se registra la intensidad de la difracción (proporcional al cuadrado de la amplitud) pero se pierde la información de fase, dando lugar al problema de fase que detiene la determinación inmediata de la estructura8. Si la proteína objetivo comparte una identidad de secuencia alta con una proteína con una estructura previamente determinada, se puede utilizar la sustitución molecular para estimar la información de fase9,10,11,12. Aunque este método es rápido y económico, las estructuras del modelo pueden no estar disponibles o no ser adecuadas. El éxito del método de reemplazo molecular basado en modelos de homología disminuye significativamente a medida que la identidad de la secuencia cae por debajo del 35%13. En ausencia de un modelo de homología adecuado, se pueden probar métodos ab initio, como ARCIMBOLDO14,15 y AMPLE16. Estos métodos utilizan modelos o fragmentos predichos computacionalmente como puntos de partida para el reemplazo molecular. AMPLE, que utiliza modelos de señuelo previstos como puntos de partida, lucha para resolver estructuras de proteínas y proteínas grandes (>100 residuos) que contienen predominantemente hojas de β. ARCIMBOLDO, que intenta encajar pequeños fragmentos para extenderse a una estructura más grande, se limita a los datos de alta resolución (≤2o) y a la capacidad de los algoritmos para expandir los fragmentos en una estructura completa.
Si los métodos de sustitución molecular fallan, deben utilizarse métodos directos como el reemplazo isomórfico17,18 y la dispersión anómala a una sola longitud de onda (SAD19)o de varias longitudes de onda (MAD20). Este es a menudo el caso de estructuras verdaderamente novedosas, donde el cristal debe ser formado o derivado con un átomo pesado. Esto se puede lograr empapando o co-cristalizando con un compuesto de átomo pesado, modificación química (como la incorporación de 5 bromouralo en el ARN) o la expresión de proteínas etiquetada (como la incorporación de selenomethionine o aminoácidos de selenocisteína en la estructura primaria)21,22. Esto complica aún más el proceso de cristalización y requiere cribado y optimización adicionales.
Una nueva clase de compuestos de fase, incluyendo I3C (5-amino-2,4,6-ácido triiodoisofáltico) y B3C (5-amino-2,4,6-ácido tribromoisophálico), ofrecen ventajas emocionantes sobre los compuestos de fase preexistentes23,24,25. Tanto I3C como B3C cuentan con un andamio de anillo aromático con una disposición alterna de dispersiones anómalas necesarias para los métodos de fase directa y los grupos funcionales de aminoácidos o carboxilatos que interactúan específicamente con la proteína y proporcionan especificidad del sitio de unión. La posterior disposición triangular equilátero de los grupos de metales pesados permite una validación simplificada de la subestructura de fase. En el momento de la redacción, hay 26 estructuras enlazadas a I3C en el Banco de Datos de Proteínas (PDB), de las cuales 20 se resolvieron utilizando la fase SAD26.
Este protocolo mejora la eficacia de la tubería de determinación de la estructura mediante la combinación de los métodos de derivación de metales pesados y cribado rMMS para aumentar simultáneamente el número de golpes de cristalización y simplificar el proceso de derivación de cristal. Demostramos que este método era extremadamente eficaz con la lisoz de la clara de huevo de gallina y un dominio de una nueva proteína de lesina de bacteriófago P6827. Se describe la solución de estructura mediante la tubería de determinación de estructura Auto-Rickshaw altamente automatizada, específicamente adaptada para el compuesto de fase I3C. Existen otras canalizaciones automatizadas que se pueden utilizar como AutoSol28,ELVES29 y CRANK230. Los paquetes no totalmente automatizados como SHELXC/D/E también se pueden utilizar31,32,33. Este método es particularmente beneficioso para los investigadores que están estudiando proteínas que carecen de modelos homólogos en la PDB, al reducir significativamente el número de pasos de detección y optimización. Un requisito previo para este método son los cristales de proteína o un precipitado cristalino de la proteína diana, obtenido de ensayos de cristalización anteriores.
La determinación de la estructura de una proteína novedosa en ausencia de un modelo de homología adecuado para el reemplazo molecular requiere una fase experimental. Estos métodos requieren la incorporación de átomos pesados en el cristal proteico que añade un nivel de complejidad a la tubería de determinación de la estructura y puede introducir numerosos obstáculos que deben ser abordados. Los átomos pesados se pueden incorporar directamente en la proteína a través de la expresión etiquetada utilizando selenomethionina y selenocisteína. Como este método es costoso, laborioso y puede resultar en menores rendimientos proteicos, la proteína etiquetada a menudo se expresa después de que se han encontrado condiciones de cristalización y se ha optimizado con proteínas sin etiquetar. Alternativamente, los cristales pueden ser derivados empapando en una solución que contiene átomos pesados22,63,64. Este método a menudo utiliza cristales de alta calidad y por lo tanto se realiza después de que ya se ha desarrollado un método de cristalización robusto. Obtener con éxito un cristal derivado utilizando este método requiere una mayor optimización de los procedimientos de remojo y el cribado de diferentes compuestos de fase, añadiendo así más tiempo a un proceso ya laborioso.
La co-cristalización de la proteína con el átomo pesado se puede realizar en la etapa de cribado, agilizando así eficientemente el proceso y reduciendo los pasos de manipulación de cristales que pueden causar daños. Sin embargo, todavía existe el escenario potencial de obtener pocos impactos iniciales de cristalización y el problema de elegir un compuesto de átomo pesado compatible. Muchos compuestos de fase disponibles actualmente son incompatibles con precipitantes, tampones y aditivos que se encuentran comúnmente en condiciones de cristalización. Pueden ser insolubles en tampones de sulfato y fosfato, quelato al citrato y acetato, reaccionar desfavorablemente con los amortiguadores HEPES y Tris o ser secuestrados por la TDT y β-mercaptoetanol21. Como el compuesto de fase I3C no sufre de estas incompatibilidades, es un compuesto de fase robusta que podría ser susceptible a muchas condiciones diferentes.
En este estudio, se presenta un método simplificado de producción de cristales derivados listos para la fase SAD a través de la co-cristalización simultánea del compuesto de fase I3C y rMMS. La combinación de ambas técnicas aumenta el número de golpes de cristalización, con muchas de las condiciones que han mejorado la morfología y las características de difracción. En los casos de prueba Orf11 NTD y HEWL, se identificaron nuevas condiciones en la pantalla I3C-rMMS que estaban ausentes cuando I3C no estaba presente. Potencialmente, I3C puede unirse favorablemente a la proteína, facilitando la formación y estabilización de contactos de cristal27. A su vez, esto puede inducir cristalización y posiblemente mejorar las características de difracción. Además de ser un compuesto compatible con pantallas de matriz dispersas, I3C es también un atractivo compuesto de fase debido a sus propiedades intrínsecas. Los grupos funcionales que se alternan con el yodo en el andamio del anillo aromático permiten una unión específica a las proteínas. Esto conduce a una mayor ocupación y potencialmente reduce la señal de fondo23. Además, la disposición de dispersores anómalos en un triángulo equilátero es evidente en la subestructura y se puede utilizar para validar rápidamente la unión de I3C(Figura 4B y 4C). Por último, puede producir una señal anómala con radiación sincrotrón sintonizable, así como fuentes de rayos X de ánodo giratorio de cromo y cobre. Por lo tanto, se puede aplicar a muchos flujos de trabajo diferentes. Como I3C está ampliamente disponible y es barato de comprar, este enfoque está al alcance de la mayoría de los laboratorios de biología estructural.
Hay varias consideraciones experimentales que deben abordarse cuando se utiliza el método I3C-rMMS. Este método no se puede aplicar si no se puede obtener material cristalino inicial de la proteína. En casos difíciles, el material cristalino de una proteína homóloga también se puede utilizar para generar stock de semillas. Este enfoque de la siembra cruzada de rMMS ha mostrado algunos resultados prometedores7. Optimizar el número de cristal a través de la dilución del stock de semillas es un paso crucial, que no debe pasarse por alto, para maximizar la posibilidad de producir cristales grandes de alta calidad y adquirir datos de difracción adecuados. Si hay pocos sitios I3C identificados en la unidad asimétrica, las condiciones propicias para la cristalización deben optimizarse aún más con una mayor concentración de I3C. Esto puede aumentar la ocupación de I3C para maximizar la señal anómala y ayudar a la derivación de cristal.
Puede haber casos en los que esta técnica puede no ser el método óptimo para derivar cristales proteicos. A medida que aumenta el tamaño de una proteína o complejo proteico, el número limitado de sitios I3C en la superficie de la proteína puede no proporcionar suficiente potencia de fase para resolver la estructura. En estos escenarios en los que se sospecha que el tamaño de las proteínas está impidiendo la fase, el etiquetado de la proteína puede ser un enfoque más viable para la eliminación gradual de la proteína. Si la proteína tiene un número adecuado de residuos de metionina en la proteína (recomendado tener al menos una metionina por cada 100 residuos65)y se puede lograr la incorporación de selenomethionina de alta eficiencia en una proteína (como en los sistemas de expresión bacteriana66), múltiples átomos de selenio de alta ocupación estarán presentes en los cristales para fase de la estructura.
Además, algunas proteínas pueden intrínsecamente no ser adecuadas para la derivación con I3C. Los sitios de unión I3C a proteínas dependen de la estructura proteica. Puede haber proteínas que naturalmente tienen pocos parches expuestos compatibles con la unión I3C. Por lo tanto, no es imprevisible que pueda haber dificultades para co-cristalizar algunas proteínas diana con I3C.
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación se llevó a cabo en la línea de haz MX1 en el Sincrotrón Australiano, parte de ANSTO. Los autores desean reconocer a los miembros de los laboratorios Shearwin y Bruning para los debates sobre este trabajo. Los autores también quieren reconocer a la Dra. Santosh Panjikar y a la Dra. Linda Whyatt-Shearwin que contribuyeron a la obra original que fue pionera en este protocolo.
Se reconoce la siguiente financiación: Consejo Australiano de Investigación (concesión Nos. DP150103009 y DP160101450 a Keith E. Shearwin); Universidad de Adelaida (Beca de estipendio del Programa de Entrenamiento de Investigación del Gobierno Australiano para Jia Quyen Truong y Stephanie Nguyen).
10 mL disposable luer lock syringes | Adelab Scientific | T3SS10LAT | Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells |
24 well tissue culture plate | Sigma Aldrich | CLS3527 | Used for hanging drop crystal tray |
3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | For 96 well crystallization screens set up by robot |
5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid | Alfa Aesar | B22178 | Commonly referred to as I3C in the article |
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original | Hampton Research | HR3-297 | For 96 well crystallization screens set up by robot |
Coverslips | Thermo Fisher Scientific | 18X18-2 | Coverslips for hanging drop crystal tray wells |
Dow Corning vacuum grease | Hampton Research | HR3-510 | Used for sealing hanging drop crystal tray wells |
Eppendorf Pipette 0.1 μL-2.5 μL | Eppendorf | 3120000011 | |
Gilson Pipette 2 μL-20 μL | John Morris Group | 1153247 | |
Gilson Pipette 20 μL-200 μL | John Morris Group | 1152006 | |
Glass pasteur pipettes | Adelab Scientific | HIR92601.01 | |
Hen Egg White Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Approximately 95% pure |
IndexHT screen | Hampton Research | HR2-134 | |
Microscope illuminator | Meiji Techno | FT192/230 | Light source to illuminate crystallography experiments |
PEG/ION HT screen | Hampton Research | HR2-139 | |
Phoenix Liquid Dispenser | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
Scalpel with scalpel blade no. 15 | Adelab Scientific | LV-SMSCPO15 | |
Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol. |
Stereo microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | Microscope for visualising crystallography experiments |
Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415 | |
Vortex mixer | Adelab Scientific | RAVM1 |