Cet article présente une méthode pour générer des cristaux protéiques dérivés de l’I3C (acide 5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic) utilisant le microsédage pour générer de nouvelles conditions de cristallisation dans des écrans matriciels clairsemés. Les plateaux peuvent être mis en place à l’aide de robots de distribution liquide ou à la main.
L’élucidation de la structure protéique à l’aide de la cristallographie aux rayons X nécessite à la fois des cristaux de diffractation de haute qualité et une solution computationnelle du problème de phase de diffraction. Les nouvelles structures qui n’ont pas de modèle d’homologie approprié sont souvent dérivées d’atomes lourds pour fournir des informations expérimentales sur la phase. Le protocole présenté génère efficacement des cristaux de protéines dérivatisés en combinant le criblage aléatoire de matrice de microsédage avec la dérivation avec une molécule d’atome lourde I3C (acide 5-amiino-2,4,6-triiodoisophthalic). En incorporant l’I3C dans le treillis de cristal, le problème de phase de diffraction peut être résolu efficacement à l’aide de la dispersion anormale à longueur d’onde unique (TAS). L’arrangement trilatéral de triangle des atomes d’iode dans I3C permet la validation rapide d’une sous-structure anormale correcte. Ce protocole sera utile aux biologistes structurels qui résolvent les structures macromoléculaires à l’aide de techniques cristallisées qui s’intéressent à l’élimination progressive expérimentale.
Dans le domaine de la biologie structurale, la cristallographie aux rayons X est considérée comme la technique de l’étalon-or pour déterminer les structures de résolution atomique des macromolécules. Il a été largement utilisé pour comprendre la base moléculaire des maladies, guider des projets rationnels de conception de médicaments et élucider le mécanisme catalytique des enzymes1,2. Bien que les données structurelles fournissent une richesse de connaissances, le processus d’expression et de purification des protéines, de cristallisation et de détermination de la structure peut être extrêmement laborieux. Plusieurs goulets d’étranglement sont couramment rencontrés qui entravent l’avancement de ces projets et il faut s’y attaquer pour rationaliser efficacement le pipeline de détermination de la structure cristalline.
Après l’expression et la purification recombinantes, les conditions préliminaires propices à la cristallisation doivent être identifiées, ce qui est souvent un aspect ardu et long de la cristallographie aux rayons X. Des écrans matriciels clairsemés commerciaux qui consolident les conditions connues et publiées ont été développés pour atténuer ce goulotd’étranglement 3,4. Cependant, il est courant de générer peu de succès à partir de ces écrans initiaux en dépit de l’utilisation d’échantillons de protéines très pures et concentrées. L’observation de gouttes claires indique que la protéine peut ne pas atteindre les niveaux de sursaturation nécessaires pour nucléer un cristal. Pour encourager la nucléation et la croissance des cristaux, les graines produites à partir de cristaux préexistants peuvent être ajoutées aux conditions, ce qui permet un échantillonnage accru de l’espace de cristallisation. Ireton et Stoddard ont introduit pour la première fois la méthode de criblage de matrice microsécadavres 5. Des cristaux de mauvaise qualité ont été broyés pour faire un stock de graines, puis ajoutés systématiquement aux conditions de cristallisation contenant différents sels pour générer de nouveaux cristaux de qualité diffraction qui ne se seraient pas formés autrement. Cette technique a été encore améliorée par D’Arcy et coll. qui ont développé le criblage aléatoire de matrice de microseed (rMMS) dans lequel les graines ont été introduites dans un écran de cristallisation dematrice de rechange 6,7. Cela a amélioré la qualité des cristaux et augmenté le nombre de coups de cristallisation en moyenne d’un facteur de 7.
Une fois que les cristaux sont produits avec succès et un modèle de diffraction de rayon X est obtenu, un autre goulot d’étranglement sous la forme de résoudre le « problème de phase » est rencontré. Au cours du processus d’acquisition des données, l’intensité de la diffraction (proportionnelle au carré de l’amplitude) est enregistrée, mais l’information de phase est perdue, ce qui donne lieu au problème de phase qui arrête la détermination immédiate de la structure8. Si la protéine cible partage l’identité de séquence élevée à une protéine avec une structure précédemment déterminée, le remplacement moléculaire peut être employé pour estimer l’information de phase9,10,11,12. Bien que cette méthode soit rapide et peu coûteuse, les structures du modèle peuvent ne pas être disponibles ou appropriées. Le succès de la méthode de remplacement moléculaire basée sur le modèle d’homologie diminue considérablement à mesure que l’identité de la séquence tombe en dessous de 35% 13. En l’absence d’un modèle d’homologie approprié, des méthodes ab initio, telles que ARCIMBOLDO14,15 et AMPLE16, peuvent être testées. Ces méthodes utilisent des modèles ou des fragments prédits par calcul comme points de départ pour le remplacement moléculaire. AMPLE, qui utilise les modèles de leurre prévus comme points de départ, lutte pour résoudre les structures de grandes protéines (>100 résidus) et de protéines contenant principalement β feuilles. ARCIMBOLDO, qui tente d’insérer de petits fragments pour s’étendre dans une structure plus grande, est limité aux données haute résolution (≤2 Å) et par la capacité des algorithmes à étendre les fragments dans une structure complète.
Si les méthodes de remplacement moléculaire échouent, des méthodes directes telles que le remplacement isomorphe17,18 et la diffusion anormale à une seule longueur d’onde (SAD19) ou à plusieurs longueurs d’onde (MAD20) doivent être utilisées. C’est souvent le cas pour des structures vraiment nouvelles, où le cristal doit être formé ou dérivé avec un atome lourd. Ceci peut être réalisé en trempant ou en co-cristallisant avec un composé atome lourd, la modification chimique (telle que l’incorporation de 5-bromouracil dans l’ARN) ou l’expression étiquetée de protéine (telle que incorporer la sélénomethionine ou les acides aminés de selénocystéine dans la structure primaire)21,22. Cela complique encore le processus de cristallisation et nécessite un dépistage et une optimisation supplémentaires.
Une nouvelle classe de composés phasing, y compris I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acide) et B3C (5-amino-2,4,6-tribromoisophthalic acide), offrent des avantages passionnants par rapport aux composés préexistants23,24,25. I3C et B3C disposent d’un échafaudage aromatique avec un arrangement alternatif de dispersions anormales nécessaires pour les méthodes d’élimination progressive directe et les groupes fonctionnels aminés ou carboxylate qui interagissent spécifiquement avec la protéine et fournissent la spécificité du site contraignant. L’agencement triangulaire équilatéral subséquent des groupes de métaux lourds permet une validation simplifiée de la sous-structure d’élimination progressive. Au moment d’écrire ces lignes, il y avait 26 structures liées à l’I3C dans la Banque de données protéiques (PDB), dont 20 ont été résolues à l’aide de l’élimination progressive du TAS26.
Ce protocole améliore l’efficacité du pipeline de détermination de la structure en combinant les méthodes de dérivation des métaux lourds et de criblage rMMS afin d’augmenter simultanément le nombre de coups de cristallisation et de simplifier le processus de dérivation des cristaux. Nous avons démontré que cette méthode était extrêmement efficace avec le lysozyme de blanc d’oeuf de poule et un domaine d’une protéine nouvelle de lysine du bactériophage P6827. La solution de structure utilisant le pipeline hautement automatisé de détermination de structure d’auto-pousse-pousse est décrite, spécifiquement adaptée pour le composé de phasing d’I3C. Il existe d’autres pipelines automatisés qui peuvent être utilisés tels que AutoSol28, ELVES29 et CRANK230. Les paquets non entièrement automatisés tels que SHELXC/D/E peuvent également êtreutilisés 31,32,33. Cette méthode est particulièrement bénéfique pour les chercheurs qui étudient les protéines dépourvues de modèles homologues dans la PDB, en réduisant considérablement le nombre d’étapes de dépistage et d’optimisation. Une condition préalable à cette méthode est les cristaux protéiques ou un précipité cristallin de la protéine cible, obtenu à partir d’essais de cristallisation antérieurs.
La détermination de structure d’une protéine nouvelle en l’absence d’un modèle approprié d’homologie pour le remplacement moléculaire exige l’élimination progressive expérimentale. Ces méthodes nécessitent l’incorporation d’atomes lourds dans le cristal protéique, ce qui ajoute un niveau de complexité au pipeline de détermination de la structure et peut introduire de nombreux obstacles qui doivent être abordés. Les atomes lourds peuvent être incorporés directement dans la protéine par l’expression étiquetée utilisant la sélénomethionine et la selénocystéine. Comme cette méthode est coûteuse, laborieuse et peut entraîner des rendements protéiques inférieurs, les protéines étiquetées sont souvent exprimées après que des conditions de cristallisation ont été trouvées et optimisées avec des protéines non étiquetées. Alternativement, les cristaux peuvent être dérivés en trempant dans une solution contenant des atomes lourds22,63,64. Cette méthode utilise souvent des cristaux de haute qualité et est donc effectuée après qu’une méthode de cristallisation robuste a déjà été développée. L’obtention réussie d’un cristal dérivatisé à l’aide de cette méthode nécessite une optimisation plus continue des procédures de trempage et le criblage de différents composés de phasage, ajoutant ainsi plus de temps à un processus déjà laborieux.
La co-cristallisation de la protéine avec l’atome lourd peut être effectuée au stade de criblage, rationalisant ainsi efficacement le processus et réduisant les étapes de manipulation du cristal qui peuvent causer des dommages. Cependant, il existe toujours le scénario potentiel d’obtenir peu de coups de cristallisation initiale et le problème de choisir un composé atome lourd compatible. De nombreux composés de phasage actuellement disponibles sont incompatibles avec les précipités, les tampons et les additifs couramment trouvés dans les conditions de cristallisation. Ils peuvent être insolubles dans les tampons de sulfate et de phosphate, chélate au citrate et à l’acétate, réagir défavorablement avec des tampons HEPES et Tris ou être séquestrés par la TNT et le β-mercaptoéthanol21. Comme le composé de phasage I3C ne souffre pas de ces incompatibilités, c’est un composé robuste de phasing qui pourrait être aimable à beaucoup de conditions différentes.
Dans cette étude, une méthode simplifiée de production de cristaux dérivatisés prêts pour le TSO progressivement par co-cristallisation simultanée du composé de phasage I3C et du RMMS est présentée. La combinaison des deux techniques augmente le nombre de coups de cristallisation, avec beaucoup de conditions ayant amélioré la morphologie et les caractéristiques de diffraction. Dans les cas d’essai orf11 NTD et HEWL, de nouvelles conditions dans l’écran I3C-rMMS ont été identifiées qui étaient absentes quand I3C n’était pas présent. Potentiellement, I3C peut se lier favorablement à la protéine, facilitant la formation et la stabilisation des contacts en cristal27. À son tour, cela peut induire la cristallisation et peut-être améliorer les caractéristiques de diffraction. En plus d’être un composé compatible avec des écrans matriciels clairsemés, I3C est également un composé attrayant de phasing en raison de ses propriétés intrinsèques. Les groupes fonctionnels qui alternent avec l’iode sur l’échafaudage aromatique permettent une liaison spécifique aux protéines. Cela conduit à une plus grande occupation et réduit potentiellement le signal d’arrière-plan23. De plus, l’agencement de disperseurs anormaux dans un triangle équilatéral est évident dans la sous-structure et peut être utilisé pour valider rapidement la liaison de l’I3C(figure 4B et 4C). Enfin, il peut produire un signal anormal avec le rayonnement synchrotron tunable ainsi que le chrome et le cuivre tournant anode X-ray sources. Ainsi, il peut être appliqué à de nombreux workflows différents. Comme i3C est largement disponible et peu coûteux à acheter, cette approche est à portée de main pour la plupart des laboratoires de biologie structurelle.
Il y a plusieurs considérations expérimentales qui doivent être abordées lors de l’utilisation de la méthode I3C-rMMS. Cette méthode ne peut pas être appliquée si le matériau cristallin initial de la protéine ne peut pas être obtenu. Dans les cas difficiles, des matériaux cristallins provenant d’une protéine homologue peuvent également être utilisés pour générer des stocks de semences. Cette approche d’ensemencement croisé à rMMS a montré quelques résultatsprometteurs 7. L’optimisation du nombre de cristaux par dilution du stock de semences est une étape cruciale, qu’il ne faut pas négliger, afin de maximiser les chances de produire de gros cristaux de haute qualité et d’acquérir des données de diffraction appropriées. S’il y a peu de sites I3C identifiés dans l’unité asymétrique, les conditions propices à la cristallisation devraient être encore optimisées avec une concentration accrue d’I3C. Cela peut augmenter l’occupation de l’I3C afin de maximiser le signal anormal et faciliter la dérivation des cristaux.
Il peut y avoir des cas où cette technique peut ne pas être la méthode optimale pour dérivatiser les cristaux de protéines. À mesure que la taille d’une protéine ou d’un complexe protéique augmente, le nombre limité de sites I3C à la surface des protéines peut ne pas fournir suffisamment de puissance d’élimination progressive pour résoudre la structure. Dans ces scénarios où l’on soupçonne que la taille des protéines entrave l’élimination progressive, l’étiquetage de la protéine par la sélénomethionine peut être une approche plus viable pour éliminer progressivement la protéine. Si la protéine a un nombre suffisant de résidus de méthionine dans la protéine (recommandé d’avoir au moins une méthionine pour 100 résidus65) et l’incorporation de sélénomethionine à haut rendement dans une protéine peut être atteint (comme dans les systèmes d’expressionbactérienne 66), plusieurs atomes de sélénium à occupation élevée seront présents dans les cristaux pour phaser la structure.
En outre, certaines protéines peuvent intrinsèquement ne pas être adaptées à la dérivation avec I3C. Les sites de liaison I3C sur les protéines dépendent de la structure protéique. Il peut exister des protéines qui ont naturellement peu de patchs exposés compatibles avec la liaison I3C. Par conséquent, il n’est pas imprévisible qu’il puisse y avoir des difficultés à co-cristalliser certaines protéines cibles avec l’I3C.
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été entreprise sur la ligne de faisceau MX1 du Synchrotron australien, qui fait partie de l’ANSTO. Les auteurs aimeraient remercier les membres des laboratoires Shearwin et Bruning pour leurs discussions sur ces travaux. Les auteurs aimeraient également remercier le Dr Santosh Panjikar et la Dre Linda Whyatt-Shearwin qui ont contribué aux travaux originaux qui ont été à l’origine de ce protocole.
Le financement suivant est reconnu : Australian Research Council (subvention Nos. DP150103009 et DP160101450 à Keith E. Shearwin); Bourse d’études de l’Université d’Adélaïde (Australian Government Research Training Program à Jia Quyen Truong et Stephanie Nguyen).
10 mL disposable luer lock syringes | Adelab Scientific | T3SS10LAT | Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells |
24 well tissue culture plate | Sigma Aldrich | CLS3527 | Used for hanging drop crystal tray |
3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | For 96 well crystallization screens set up by robot |
5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid | Alfa Aesar | B22178 | Commonly referred to as I3C in the article |
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original | Hampton Research | HR3-297 | For 96 well crystallization screens set up by robot |
Coverslips | Thermo Fisher Scientific | 18X18-2 | Coverslips for hanging drop crystal tray wells |
Dow Corning vacuum grease | Hampton Research | HR3-510 | Used for sealing hanging drop crystal tray wells |
Eppendorf Pipette 0.1 μL-2.5 μL | Eppendorf | 3120000011 | |
Gilson Pipette 2 μL-20 μL | John Morris Group | 1153247 | |
Gilson Pipette 20 μL-200 μL | John Morris Group | 1152006 | |
Glass pasteur pipettes | Adelab Scientific | HIR92601.01 | |
Hen Egg White Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Approximately 95% pure |
IndexHT screen | Hampton Research | HR2-134 | |
Microscope illuminator | Meiji Techno | FT192/230 | Light source to illuminate crystallography experiments |
PEG/ION HT screen | Hampton Research | HR2-139 | |
Phoenix Liquid Dispenser | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
Scalpel with scalpel blade no. 15 | Adelab Scientific | LV-SMSCPO15 | |
Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol. |
Stereo microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | Microscope for visualising crystallography experiments |
Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415 | |
Vortex mixer | Adelab Scientific | RAVM1 |