Dit artikel presenteert een methode om eiwitkristallen te genereren die zijn afgeleid met I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisoftaalzuur) met behulp van microseeding om nieuwe kristallisatieomstandigheden in schaarse matrixschermen te genereren. De trays kunnen worden opgezet met behulp van vloeibare doseerrobots of met de hand.
Eiwitstructuur opheldering met behulp van x-ray kristallografie vereist zowel hoge kwaliteit diffracting kristallen en computationele oplossing van de diffractie fase probleem. Nieuwe structuren die geen geschikt homologiemodel hebben, worden vaak afgeleid met zware atomen om experimentele fase-informatie te verstrekken. Het gepresenteerde protocol genereert efficiënt afgeleide eiwitkristallen door willekeurige microseeding matrix screening te combineren met afleiding met een zwaar atoommolecuul I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid). Door I3C in het kristalrooster op te nemen, kan het probleem van de diffractiefase efficiënt worden opgelost met behulp van enkele golflengteafwijking (SAD) fasering. De gelijkzijdige driehoeksopstelling van jodiumatomen in I3C zorgt voor een snelle validatie van een correcte afwijkende onderbouw. Dit protocol zal nuttig zijn voor structurele biologen die macromoleculaire structuren oplossen met behulp van op kristallografie gebaseerde technieken met interesse in experimentele fasering.
Op het gebied van structurele biologie wordt röntgenkristallografie beschouwd als de gouden standaardtechniek om de atomaire resolutiestructuren van macromoleculen te bepalen. Het is op grote schaal gebruikt om de moleculaire basis van ziekten te begrijpen, rationele projecten voor het ontwerpen van geneesmiddelen te begeleiden en het katalytische mechanisme van enzymen1,2te verduidelijken . Hoewel structurele gegevens een schat aan kennis bieden, kan het proces van eiwitexpressie en -zuivering, kristallisatie en structuurbepaling uiterst omslachtig zijn. Er worden vaak verschillende knelpunten opgetreden die de voortgang van deze projecten belemmeren en dit moet worden aangepakt om de pijpleiding voor de bepaling van de kristalstructuur efficiënt te stroomlijnen.
Na recombinant expressie en zuivering moeten voorlopige omstandigheden worden geïdentificeerd die bevorderlijk zijn voor kristallisatie, wat vaak een moeizaam en tijdrovend aspect van röntgenkristallografie is. Commerciële schaarse matrixschermen die bekende en gepubliceerde voorwaarden consolideren zijn ontwikkeld om dit knelpunt te verlichten3,4. Echter, het is gebruikelijk om weinig hits te genereren van deze eerste schermen, ondanks het gebruik van zeer zuivere en geconcentreerde eiwit monsters. Het observeren van heldere druppels geeft aan dat het eiwit mogelijk niet de niveaus van oververzadiging bereikt die nodig zijn om een kristal te kernen. Om kristalkern en groei aan te moedigen, kunnen zaden die zijn geproduceerd uit reeds bestaande kristallen aan de omstandigheden worden toegevoegd en dit maakt een verhoogde bemonstering van de kristallisatieruimte mogelijk. Ireton en Stoddard introduceerden voor het eerst de microseed matrix screening methode5. Kristallen van slechte kwaliteit werden verpletterd om een zaadvoorraad te maken en vervolgens systematisch toegevoegd aan kristallisatieomstandigheden die verschillende zouten bevatten om nieuwe diffractiekwaliteitkristallen te genereren die anders niet zouden zijn gevormd. Deze techniek werd verder verbeterd door D’Arcy et al. die willekeurige microseed matrix screening (rMMS) ontwikkeld waarin zaden werden geïntroduceerd in een reserve matrix kristallisatie scherm6,7. Dit verbeterde de kwaliteit van kristallen en verhoogde het aantal kristallisatie hits gemiddeld met een factor 7.
Nadat kristallen met succes zijn geproduceerd en een röntgendiffractiepatroon is verkregen, ontstaat een ander knelpunt in de vorm van het oplossen van het ‘faseprobleem’. Tijdens het proces van gegevensverwerving wordt de intensiteit van de diffractie (evenredig aan het kwadraat van de amplitude) geregistreerd, maar de fase-informatie gaat verloren, waardoor het faseprobleem ontstaat dat onmiddellijke structuurbepalingstopt 8. Als het doeleiwit een hoge sequentie-identiteit deelt met een eiwit met een eerder bepaalde structuur , kan moleculaire vervanging worden gebruikt om de fase-informatie9,10,11,12te schatten . Hoewel deze methode snel en goedkoop is, zijn modelstructuren mogelijk niet beschikbaar of geschikt. Het succes van de op het malogiemodel gebaseerde moleculaire vervangingsmethode daalt aanzienlijk naarmate de sequentie-identiteit onder de 35%13daalt. Bij gebrek aan een geschikt homologiemodel kunnen ab initio-methoden, zoals ARCIMBOLDO14,15 en AMPLE16,worden getest. Deze methoden gebruiken computationeel voorspelde modellen of fragmenten als uitgangspunt voor moleculaire vervanging. AMPLE, dat voorspelde lokmodellen als uitgangspunt gebruikt, worstelt om structuren van grote (>100 residuen) eiwitten en eiwitten die voornamelijk β-vellen bevatten op te lossen. ARCIMBOLDO, dat probeert om kleine fragmenten te passen om zich in een grotere structuur uit te breiden, is beperkt tot gegevens met een hoge resolutie (≤2 Å) en door het vermogen van algoritmen om de fragmenten in een volledige structuur uit te breiden.
Als moleculaire vervangingsmethoden uitvallen, moeten directe methoden zoals isomorfe vervanging17,18 en afwijkende verstrooiing op een enkele golflengte (SAD19)of meerdere golflengten (MAD20)worden gebruikt. Dit is vaak het geval voor echt nieuwe structuren, waar het kristal moet worden gevormd of afgeleid met een zwaar atoom. Dit kan worden bereikt door het weken of co-kristalliseren met een zware atoomverbinding, chemische modificatie (zoals 5-bromouracil integratie in RNA) of geëtiketteerde eiwitexpressie (zoals het opnemen van selenomethionine of selenocysteine aminozuren in de primaire structuur)21,22. Dit bemoeilijkt het kristallisatieproces verder en vereist extra screening en optimalisatie.
Een nieuwe klasse van fasering verbindingen, waaronder I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid) en B3C (5-amino-2,4,6-tribromoisophthalic acid), bieden spannende voordelen ten opzichte van reeds bestaande fasering verbindingen23,24,25. Zowel I3C als B3C zijn voorzien van een aromatische ringsteiger met een afwisselende opstelling van afwijkende verstrooiing die nodig is voor directe faseringsmethoden en amino- of carboxylaatfunctionele groepen die specifiek met het eiwit communiceren en bindende sitespecificiteit bieden. De daaropvolgende gelijkzijdige driehoeksregeling van zware metalengroepen maakt vereenvoudigde validatie van de faseringsonderbouw mogelijk. Op het moment van schrijven zijn er 26 I3C-gebonden structuren in de Protein Data Bank (PDB), waarvan er 20 werden opgelost met behulp van SADfasering 26.
Dit protocol verbetert de werkzaamheid van de structuurbepalingspijplijn door de methoden van derivatisatie van zware metalen en rMMS-screening te combineren om tegelijkertijd het aantal kristallisatietreffers te verhogen en het kristalafleidingproces te vereenvoudigen. We hebben aangetoond dat deze methode zeer effectief was met kippeneiwit lysozyme en een domein van een nieuw lysin eiwit uit bacteriofaag P6827. Structuur oplossing met behulp van de sterk geautomatiseerde Auto-Riksja structuur bepaling pijplijn wordt beschreven, specifiek afgestemd op de I3C fasering compound. Er bestaan andere geautomatiseerde pijpleidingen die kunnen worden gebruikt, zoals AutoSol28, ELVES29 en CRANK230. Niet-volledig geautomatiseerde pakketten zoals SHELXC/D/E kunnen ook worden gebruikt31,32,33. Deze methode is vooral gunstig voor onderzoekers die eiwitten bestuderen die geen homologe modellen in het VOB hebben, door het aantal screening- en optimalisatiestappen aanzienlijk te verminderen. Een voorwaarde voor deze methode is eiwitkristallen of een kristallijn neerslag van het doeleiwit, verkregen uit eerdere kristallisatieproeven.
Structuurbepaling van een nieuw eiwit bij afwezigheid van een geschikt homologiemodel voor moleculaire vervanging vereist experimentele fasering. Deze methoden vereisen opname van zware atomen in het eiwitkristal, wat een niveau van complexiteit toevoegt aan de structuurbepalingspijpleiding en tal van obstakels kan introduceren die moeten worden aangepakt. Zware atomen kunnen direct in het eiwit worden opgenomen door middel van gelabelde expressie met behulp van selenomethionine en selenocysteine. Omdat deze methode duur, omslachtig is en kan resulteren in een lagere eiwitopbrengst, wordt geëtiketteerd eiwit vaak uitgedrukt nadat kristallisatieomstandigheden zijn gevonden en geoptimaliseerd met niet-gelabeld eiwit. Als alternatief kunnen kristallen worden afgeleid door te weken in een oplossing die zwareatomen 22,63,64. Deze methode maakt vaak gebruik van kristallen van hoge kwaliteit en wordt daarom uitgevoerd nadat er al een robuuste kristallisatiemethode is ontwikkeld. Het succesvol verkrijgen van een afgeleid kristal met behulp van deze methode vereist verdere optimalisatie van weken procedures en screening van verschillende fasering verbindingen, dus het toevoegen van meer tijd aan een reeds moeizaam proces.
Co-kristallisatie van het eiwit met het zware atoom kan worden uitgevoerd in de screeningfase, waardoor het proces efficiënt wordt gestroomlijnd en kristalmanipulatiestappen worden verminderd die schade kunnen veroorzaken. Echter, er bestaat nog steeds het potentiële scenario van het verkrijgen van enkele initiële kristallisatie hits en het probleem van het kiezen van een compatibele zware atoomverbinding. Veel momenteel beschikbare fasering verbindingen zijn onverenigbaar met precipitanten, buffers en additieven vaak gevonden in kristallisatie voorwaarden. Ze kunnen onoplosbaar zijn in sulfaat- en fosfaatbuffers, chelaat om te citeren en acetaat, ongunstig reageren met HEPES- en Tris-buffers of worden afgezonderd door DTT en β-mercaptoethanol21. Aangezien de I3C fasering verbinding geen last heeft van deze onverenigbaarheden, het is een robuuste fasering verbinding die vatbaar zou kunnen zijn voor veel verschillende voorwaarden.
In deze studie wordt een gestroomlijnde methode voor het produceren van afgeleide kristallen gepresenteerd die klaar zijn voor SAD-fasering door gelijktijdige co-kristallisatie van de I3C faseringsverbinding en rMMS. De combinatie van beide technieken verhoogt het aantal kristallisatiehits, waarbij veel van de omstandigheden de morfologie- en diffractiekenmerken hebben verbeterd. In zowel Orf11 NTD als HEWL-testcases werden nieuwe omstandigheden in het I3C-rMMS-scherm geïdentificeerd die afwezig waren toen I3C niet aanwezig was. Mogelijk kan I3C zich gunstig binden aan het eiwit, waardoor de vorming en stabilisatie van kristalcontacten27wordt vergemakkelijkt. Dit kan op zijn beurt leiden tot kristallisatie en mogelijk verbeteren van diffractiekenmerken. Naast het feit dat een verbinding compatibel met schaarse matrix schermen, I3C is ook een aantrekkelijke fasering verbinding vanwege de intrinsieke eigenschappen. De functionele groepen die afwisselen met jodium op de aromatische ring steiger maken specifieke binding aan eiwitten. Dit leidt tot een grotere bezetting en vermindert mogelijk achtergrondsignaal23. Bovendien is de opstelling van afwijkende strooiwagens in een gelijkzijdige driehoek duidelijk in de onderbouw en kan deze worden gebruikt om de binding van I3C(figuur 4B tr 4C)snel te valideren. Ten slotte kan het een afwijkend signaal produceren met tunable synchrotronstraling, evenals chroom- en koperroterende anode röntgenbronnen. Het kan dus worden toegepast op veel verschillende workflows. Aangezien I3C op grote schaal beschikbaar en goedkoop te kopen is, is deze aanpak binnen handbereik voor de meeste structurele biologielaboratoria.
Er zijn verschillende experimentele overwegingen die moeten worden aangepakt bij het gebruik van de I3C-rMMS-methode. Deze methode kan niet worden toegepast als het eerste kristallijne materiaal van het eiwit niet kan worden verkregen. In moeilijke gevallen kan kristallijn materiaal uit een homolog eiwit ook worden gebruikt om zaadvoorraad te genereren. Deze cross-seeding benadering van rMMS heeft aangetoond dat een aantal veelbelovende resultaten7. Het optimaliseren van kristalaantal door verdunning van de zaadvoorraad is een cruciale stap, die niet over het hoofd mag worden gezien, om de kans op het produceren van grote kristallen van hoge kwaliteit te maximaliseren en geschikte diffractiegegevens te verkrijgen. Als er weinig I3C-sites zijn geïdentificeerd in de asymmetrische eenheid, moeten de omstandigheden die bevorderlijk zijn voor kristallisatie verder worden geoptimaliseerd met een verhoogde concentratie van I3C. Dit kan de bezetting van I3C verhogen om het afwijkende signaal te maximaliseren en kristalderivatisatie te helpen.
Er kunnen gevallen zijn waarin deze techniek mogelijk niet de optimale methode is om eiwitkristallen te derivatiseren. Naarmate de grootte van een eiwit- of eiwitcomplex toeneemt, kan het beperkte aantal I3C-sites op het eiwitoppervlak onvoldoende faseringskracht bieden om de structuur op te lossen. In deze scenario’s waarvan wordt vermoed dat de eiwitgrootte de fasering belemmert, kan de selenomethionine-etikettering van het eiwit een meer haalbare benadering zijn voor het faseren van het eiwit. Als het eiwit voldoende methionineresiduen in het eiwit heeft (aanbevolen met ten minste één methionine per 100 residuen65)en een hoge efficiëntie selenomethionine-integratie in een eiwit kan worden bereikt (zoals in bacteriële expressiesystemen66),zullen in de kristallen meerdere hoge bezettingsatomen aanwezig zijn om de structuur te faseren.
Bovendien kunnen sommige eiwitten inherent ongeschikt zijn voor derivatisatie met I3C. I3C bindingsplaatsen op eiwitten zijn afhankelijk van de eiwitstructuur. Er kunnen eiwitten bestaan die van nature weinig blootgestelde patches hebben die compatibel zijn met I3C-binding. Het is dus niet te voorzien dat er problemen kunnen zijn bij het co-kristalliseren van sommige doeleiwitten met I3C.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd uitgevoerd op de MX1 beamline op het Australische Synchrotron, onderdeel van ANSTO. De auteurs willen de leden van de laboratoria Shearwin en Bruning erkennen voor discussies over dit werk. De auteurs willen ook dr. Santosh Panjikar en Dr. Linda Whyatt-Shearwin erkennen die tot het originele werk hebben bijgedragen dat dit protocol pionierde.
De volgende financiering wordt erkend: Australian Research Council (grant Nos. DP150103009 en DP160101450 aan Keith E. Shearwin); Universiteit van Adelaide (Australian Government Research Training Program stipendium beurs voor Jia Quyen Truong en Stephanie Nguyen).
10 mL disposable luer lock syringes | Adelab Scientific | T3SS10LAT | Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells |
24 well tissue culture plate | Sigma Aldrich | CLS3527 | Used for hanging drop crystal tray |
3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | For 96 well crystallization screens set up by robot |
5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid | Alfa Aesar | B22178 | Commonly referred to as I3C in the article |
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original | Hampton Research | HR3-297 | For 96 well crystallization screens set up by robot |
Coverslips | Thermo Fisher Scientific | 18X18-2 | Coverslips for hanging drop crystal tray wells |
Dow Corning vacuum grease | Hampton Research | HR3-510 | Used for sealing hanging drop crystal tray wells |
Eppendorf Pipette 0.1 μL-2.5 μL | Eppendorf | 3120000011 | |
Gilson Pipette 2 μL-20 μL | John Morris Group | 1153247 | |
Gilson Pipette 20 μL-200 μL | John Morris Group | 1152006 | |
Glass pasteur pipettes | Adelab Scientific | HIR92601.01 | |
Hen Egg White Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Approximately 95% pure |
IndexHT screen | Hampton Research | HR2-134 | |
Microscope illuminator | Meiji Techno | FT192/230 | Light source to illuminate crystallography experiments |
PEG/ION HT screen | Hampton Research | HR2-139 | |
Phoenix Liquid Dispenser | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
Scalpel with scalpel blade no. 15 | Adelab Scientific | LV-SMSCPO15 | |
Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol. |
Stereo microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | Microscope for visualising crystallography experiments |
Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415 | |
Vortex mixer | Adelab Scientific | RAVM1 |