使用随机微种子基质筛选与 I3C 的蛋白质晶体的衍生

1. 实验规划和考虑 使用预先存在的蛋白质的晶体，最好通过蒸汽扩散结晶产生。有关蒸汽扩散结晶的通用协议，请参见本韦努蒂和曼加尼34。其他结晶方法，如油下的微球和自由界面扩散，将需要在破碎前收获晶体以生成微种子。 在准备种子库存时，使用可以牺牲的最高质量晶体。最高质量的晶体可以根据形态进行视觉判断，或者如果有这种数据，可以选择最好的衍射晶体。通过种子设定进行优化后，极有可能获得质量更好的晶体。在没有晶体的情况下，可以使用晶体沉淀物，如球状物和针头。 识别盐晶体。盐晶体可以在结晶屏幕中生长，看起来像蛋白质晶体。在rMMS中使用盐晶体没有好处，会浪费宝贵的样品，因此消除盐误报非常重要。 盐晶体被压碎时会大声喧哗。晶体必须粉碎产生种子库存，所以这个策略是特别相关的。如果粉碎晶体时听到可听见的裂纹声音，则晶体很可能是盐。 如果蛋白质含有色氨酸和酪氨酸残留物，请使用紫外荧光显微镜识别在这些光照条件下荧光的蛋白质晶体。 使用 Izit 染料（甲基蓝）将蛋白质晶体染色，使其与相对未染色的盐晶体区分开来。但是，此过程更具破坏性，仅建议在有晶体从相同掉落的复制中备用时。注：虽然上述测试可能给出有希望的结果，但盐晶体仍可能被误认为是蛋白质晶体。在这种情况下，衍射实验可以用来明确辨别蛋白质和盐晶体。 2. 准备锂 I3C 库存 将120毫克的 I3C（5-氨基-2，4，6-三叶磷酸）检测成1.5 mL微离心管。 在 200 μL 的 2 M 氢氧化锂中溶解 I3C。溶液可以在40-60°C下用热块轻轻加热，以鼓励溶解。由此产生的锂 I3C 溶液应为棕色，浓度为 1 M。注意：氢氧化锂具有腐蚀性。应佩戴安全眼镜、手套和实验室外套。 测量溶液的 pH 值。如有必要，加入少量1 M 盐酸或 2 M 氢氧化锂，将 pH 调节至 7 至 8 之间。加入毫Q水，使最终溶液体积达到400μL。I3C 库存溶液的浓度为 0.5 M。注：步骤 2.3 是可选的。溶液的pH应在任何pH调整之前在pH 7-8之间。如果感兴趣的蛋白质受到pH的严重影响，应执行此步骤。可以在这里暂停协议。锂 I3C 可在黑暗中保持在 4 °C 至少两周35。 3. 将 I3C 添加到蛋白质库存中 方法 1 将库存锂 I3C 添加到目标蛋白的 150 μL 等分中。最终浓度应在5-40 mM锂 I3C 之间。 方法 2（温和方法） 准备与目标蛋白缓冲液匹配的蛋白质稀释缓冲液。在此稀释缓冲液中，添加库存锂 I3C，使锂 I3C 浓度在 10-80 mM 之间。 用蛋白质稀释缓冲液稀释蛋白质1：1，使锂 I3C 的最终浓度在5-40 mM之间。注：在方法1中，某些蛋白质在接触高浓度的锂 I3C 时会沉淀，而其他蛋白质可以耐受。方法2降低了降水的可能性。然而，这种方法使蛋白质浓度减半。对于没有既定结晶协议的蛋白质，通常建议蛋白质浓度为 10 mg/mL，用于初始结晶筛选。建议初始摩尔比为 I3C 与蛋白质 8。初始筛选后，可优化 I3C 与蛋白质的蛋白质浓度和摩尔比。 4. 制作种子库存 制作一个圆形探头，用于粉碎晶体。 在蓝色火焰上安装一个邦森燃烧器，将巴斯德移液器加热到中间。使用钳子，将巴斯德移液器的末端拉出来，将其拉出小于 0.3 mm 的薄直径。 一旦中段足够薄，请按住火焰中的该段，以此时分离移液器，并围绕移液器末端完成玻璃探头。注：圆形探头晶体破碎机由第三方供应商销售。这些是制造圆角探测器的替代方法。 将五根1.5 mL微离心管放在冰上。 在光学显微镜下，检查结晶盘中是否适合产生微晶。理想情况下，选择良好的形态大晶体。然而，这种技术也适用于不良的形态晶体、针、板、微晶体和球状石。 打开结晶盘。对于用塑料密封的 96 个井结晶托盘，使用手术刀切割密封井的塑料。对于用润滑脂密封的悬挂滴盘，可以使用钳子拆下盖玻片，并倒置到均匀的表面上。 将 70 μL 储液液转移到微离心管中，并在冰上冷却。在其他微离心管上，加入90μL的储液罐溶液，并返回冰中冷却。注：如果储油罐没有足够的体积或不存在（在油下的微料的情况下），则通过混合适当的试剂创建结晶储层。 使用晶体探针将掉落中的晶体搅拌，彻底粉碎。晶体需要完全粉碎，可以在显微镜下监测。 从落液中去除所有液体，然后用储液罐溶液将其转移到微离心管中。混合后从微离心管中混合并随后将2μL的混合物加入井中。用溶液冲洗井，然后转移到微离心管。再次重复此冲洗步骤。从这一点开始，保持微离心管的冷却，以避免熔化混合物中的微种子。 以4°C的最高速度旋转管3分钟，定期停止在冰上冷却管子，防止过热。注：一些微种子协议在微离心管中加入聚四氟乙烯种子珠，以帮助晶体破碎7，36。我们采用了这种技术，没有使用种子珠的成功，但看到没有问题，利用种子珠粉碎晶体。 在冷却储液罐溶液之间按顺序传输 10 μL，对种子库存进行 10/1 的连续稀释。 储存不会立即在 -80 °C 使用的种子库。 5. 设置 rMMS 屏幕 使用液体点胶机器人设置 96 井筛板。在没有机器人的情况下，也可以使用多通道移液器。 将 75 μL 从深井块转移到 96 井结晶盘。将 1 μL 添加到结晶滴中，在储液罐中加入 74 μL。 将步骤2中补充的1 μL蛋白质与锂 I3C 一起转移到结晶滴中。 将 0.1 μL 的种子库存转移到结晶下降。 用清晰的密封胶带密封板，并在恒定温度下孵育板，使晶体生长。 设置悬挂放置屏幕 润滑悬垂滴井的边缘（悬挂滴结晶盘有 24 种和 48 种井格式）。 将 500 μL 结晶溶液转移到储液罐中。 在玻璃盖滑梯中心附近，放置一滴 1 μL 的蛋白质，辅以步骤 2 中的锂 I3C。 将 1 μL 的结晶溶液添加到滴中。 将 0.1 μL 的种子库存转移到结晶下降。 将盖滑滑入润滑脂，反转盖滑轨并密封结晶井。 在恒定温度下孵育板，使晶体生长。注：使用新的和未经测试的种子库存，建议使用最集中的种子库存，以最大限度地提高获得结晶命中的机会。随后的条件可以设置与减少种子浓度，以优化晶体的数量。 定期在显微镜下检查晶体托盘，以寻找晶体生长。如果晶体质量足够，可以采集用于数据收集。晶体还可用于生成新的种子库存和新的 rMMS 屏幕，以便进行迭代优化。 6. 数据收集 使用低温循环收集晶体，保护晶体，并在液氮中闪冷晶体。有关闪光冷却晶体的其他信息，请参阅腾37和加曼和米切尔38。 在低温保护阶段，如果晶体通过新的水溶液，I3C可能会因为进入低温保护溶液而从晶体中丢失。在低温保护溶液中以符合结晶条件的浓度使用锂 I3C，以减轻这种影响。 使用该协议生长的晶体已成功使用 Parabar 10312 油基低温保护剂（汉普顿研究）进行低温保护。注：当晶体储存在液氮中时，协议可以在这里暂停。注意：液氮可导致冷灼伤。如果使用封闭空间，液氮也会导致窒息。 将晶体安装在 X 射线源测角仪上，并使用特定于 X 射线源的协议收集衍射数据。 该技术依赖于来自 I3C 中碘原子的异常信号。因此，选择X射线的能量以最大化此信号。 将同步加速器 X 射线源设置为尽可能低的可调能量。对于许多大分子晶体学光束线，最低可配置能量为 8000 至 8500 eV。 无法调整旋转的阳极 X 射线源。常用的铜阳极源在 8046 eV 时具有 K+ 边缘，这为碘（f” = 6.9 e）提供了良好的异常信号。具有铬的阳极源在 5415 eV 时具有 K+ 边缘，这为碘（f” = 12.6 e）提供了较大的异常信号。 辐射损伤是数据收集过程中的一个严重问题，因为它会降低异常信号39。选择光束的曝光时间和衰减，以达到最佳衍射，同时最大限度地减少辐射剂量。注：在用溴原子取代碘原子的类似相位化合物中，辐射损伤已证明会导致碳溴键的放射性解射，并减少溴原子的占有率24。 使用反向光束SSSSSSS数据收集作为收集策略。数据以楔块收集，彼此之间收集相反的楔形。这允许以等量剂量收集 Friedel 对，从而改进了对受辐射损伤影响较小异常信号的测量。例如， 收集 360° 的八楔形策略涉及按楔形 1 （0°-45°）、楔形 2 （180°-225°）、楔形 3 （46°-90°）、楔形 4 （225°）的顺序收集数据 270°）、楔形5（90°-135°）、楔形6（270°-315°）、楔块7（135°-180°）和楔块8（315°-360°）。注：连续旋转是反向光束数据收集的替代收集策略。有关收集策略的最近比较，请参阅 Garcie-Bonte & Katona40。 7. 数据处理和结构解决方案 使用XS41对衍射数据执行数据缩减，以最大化异常信号。数据缩减输入参数特定于数据集，可能需要一些试验和错误。下面是一些建议开始。 设置弗里德尔的法律-错误。执行更正两次，STRICT_ABSORPTION_CORRECT = true 和 STRICT_ABSORPTION_CORRECT = False。一次运行可以具有比另一个更高的异常信号。比较输出中使用”肛门 Corr”和”SigAno”学科的运行之间的异常信号。这提供了数据质量指示器。 在 1100 万次运行 XDS_ASCII shelxc。HKL 文件，用于更准确地指示异常信号。”Ranom”纪律将给出不同分辨率的异常信号的指示。 运行无意义的 42 和无目的43 来扩展数据。在无目的中，设置参数 ANOMALOUS。如果使用 GUI，请选择”分离 异常对”选项，以进行异常拒绝和合并统计信息。可能需要测试不同的分辨率截止，以最大化异常信号。 使用自动里克肖自动晶体结构测定管道44解决蛋白质结构。Auto-Rickshaw将尝试通过蛋白质建模和优化软件，尝试解决相位问题，并自动构建蛋白质的晶体结构。 对于没有同源模型模板的蛋白质，在高级模式下运行自动里克肖的S一S SAD协议。输入所需的参数。 选择蛋白质作为分子类型。 输入以焦虑 （+） 表示的数据收集波长。 选择”I”作为子结构元素，以指示使用了碘原子。 选择”i3c”作为子结构类型，以指示 I3C 是相位分子。 选择”sub_direct”作为子结构确定方法。此方法使用 SHELXD32 来搜索子结构。 选择”3″作为每个单体的预期下部结构数。 输入”1″作为子结构搜索的分辨率截止。这允许自动里克肖自动确定合适的分辨率截止。 输入单个单体中的残渣数、数据集的空间组以及基于 Matthews 系数的不对称单元中的分子数。 选择适合需要的X射线数据的适当传播级别。选择”自动里克肖开发人员”将允许自动里克肖开发人员在出现问题时对运行进行故障排除。 将异常数据输入为 mtz 文件。 输入蛋白质序列作为 seq、pir 或 txt 文件。可以在文本编辑器中生成 seq 文件（例如 Windows 上的 Notepad+9 或 Linux 中的 nano）。创建一个新文件，将蛋白质的主要序列输入为一条长线或用换行符分隔。使用 .seq 文件扩展名保存文件。 输入机构电子邮件地址。 结果通过发送到提供的电子邮件地址的 Web 链接传递。注：AutoRickshaw是一个自动化管道，调用各种晶体软件包来解决X射线晶体结构32，33，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58。如果自动里克肖运行无法解决结构，可以测试其他自动里克肖设置。结构确定方法可以更改为”sub_phassade”，以使用相位器59而不是S后XD 32。每个单体的预期下部结构数也可以增加或减少。 在晶体结构的实验阶段，自动里克肖将尝试在单元细胞中放置重原子，从而形成一个子结构。I3C中碘原子的等边三角形排列为验证下部结构提供了一种有效的方法。如果步骤 6.3 失败，验证子结构有助于对结构解决方案进行故障排除。 从自动里克肖结果页面下载重原子网站列表。这是一个超链接，称为”重原子站点”。这将下载一个文本文件与重原子网站。 将文件的文件扩展名从.txt更改为.pdb。 打开库特60中的 PDB 文件。打开对称性，查看来自相邻非对称单位的其他重原子。 测量重原子之间的距离，包括非对称单位之间的距离。I3C 将显示为等边三角形，侧长为 6 个焦虑。具有这些尺寸的三角形的存在表示这些重原子的位置是正确的。